子宮內膜息肉不孕癥患者增殖期與種植窗期子宮內膜組織VEGF、Ki-67表達變化

馮苗，韓立薇，吳穗妹，李玉華，李蕾蕾，李艷秋，張碧云

(廣東省計劃生育?？漆t(yī)院，廣州510600)

子宮內膜息肉(EP)是一種常見的宮腔內良性病變，是引起不孕癥的常見原因之一。有研究報道，16.5%～26.5%的不明原因性不孕癥患者合并EP[1]。近年來，隨著超聲技術不斷發(fā)展和宮腔鏡廣泛應用，EP的檢出率越來越高。不孕癥患者助孕前常規(guī)行宮腔鏡檢查，EP的檢出率高達23.6%[2]。目前，EP的病因和發(fā)病機制尚不完全清楚，普遍認為與雌孕激素受體失調、炎癥刺激、氧化應激、細胞因子表達異常及細胞增殖與凋亡失調等有關[3]。血管內皮生長因子(VEGF)是一種作用于血管內皮細胞的細胞因子，具有促進內皮細胞增殖、分化，增加微血管通透性及誘導血管生成等作用，是判斷種植窗期子宮內膜容受性的生物標志物之一。Ki-67是一種與細胞增殖相關的核抗原。有研究報道，VEGF、Ki-67異常表達與絕經(jīng)后婦女EP形成和術后復發(fā)有關。但在育齡期EP不孕癥患者增殖期與種植窗期子宮內膜組織中VEGF、Ki-67表達的報道較少。為此，本研究觀察了育齡期EP不孕癥患者增殖期與種植窗期子宮內膜組織VEGF、Ki-67表達變化，旨在探索VEGF、Ki-67異常表達與EP形成和術后復發(fā)及子宮內膜容受性的關系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年4～12月在廣東省計劃生育專科醫(yī)院就診的、因不孕癥行宮腔鏡檢查發(fā)現(xiàn)宮腔內贅生物并經(jīng)病理證實為EP患者84例(觀察組)，其中初發(fā)63例、復發(fā)21例，年齡20～35(30.3±3.5)歲，不孕年限1～12(4.7±3.1)年。所有患者經(jīng)全面檢查排除輸卵管、子宮畸形，內分泌、免疫系統(tǒng)疾病及男方因素等導致的不孕癥。同期選擇在廣東省計劃生育專科醫(yī)院就診的，因男方因素所致的不孕癥，宮腔鏡檢查未發(fā)現(xiàn)宮腔內贅生物且病理證實為正常子宮內膜者43例(對照組)，年齡20～40(31.3±3.9)歲，不孕年限1～10(5.6±3.3)年。兩組年齡、不孕年限具有可比性。本研究經(jīng)廣東省計劃生育專科醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 VEGF、Ki-67表達檢測 觀察組入院后行宮腔鏡檢查，其中處于增殖期62例(復發(fā)21例均處于增殖期)、種植窗期22例，留取EP組織、EP周圍0.5～1.0 cm肉眼觀察無異常子宮內膜組織(以下稱周圍組織)；對照組入院后亦行宮腔鏡檢查，其中處于增殖期23例、種植窗期20例，留取正常子宮內膜組織(以下稱正常組織)。

所有組織10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。切片經(jīng)59 ℃電熱恒溫干燥箱過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3% H2O2室溫孵育5～10 min以滅活內源性過氧化物酶，微波加熱修復抗原。5%正常山羊血清封閉10～15 min，分別加入鼠抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人Ki-67多克隆抗體，4 ℃濕盒中孵育過夜。次日，加入生物素化二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性的乳腺癌組織作為陽性對照。

采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)師獨立閱片。VEGF陽性染色定位于細胞質，呈淺黃色至棕褐色顆粒；Ki-67陽性染色定位于細胞核，呈淺黃色至棕褐色顆粒。每張切片隨機選取10個400倍視野，評估染色強度；計數(shù)每視野陽性細胞，計算陽性細胞比例。染色強度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞比例評分：無陽性細胞為0分，<5%為1分，5%～<50%為2分，50%～<70%為3分，≥70%為4分。以染色強度評分和陽性細胞比例評分綜合評價，二者之和≥3分為VEGF或Ki-67陽性表達[4]。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組增殖期VEGF、Ki-67陽性表達比較 見表1。

表1 兩組增殖期VEGF、Ki-67陽性表達比較[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05；與同發(fā)病狀態(tài)周圍組織比較，#P<0.05。

2.2 兩組種植窗期VEGF、Ki-67陽性表達比較 見表2。

表2 兩組種植窗期VEGF、Ki-67陽性表達比較[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

EP是子宮內膜基底層的局限性良性增生，有蒂突向宮腔，由少量致密纖維結締組織組成的間質、管壁較厚的血管及子宮內膜腺體組成，好發(fā)于育齡期或圍絕經(jīng)期婦女，是引起育齡期婦女不孕癥的常見原因之一[5，6]。目前，臨床治療通常采用宮腔鏡電切術。EP切除后不僅能提高育齡期不孕癥患者自然妊娠率，還能改善輔助生殖技術助孕的育齡期不孕癥患者妊娠結局，但術后復發(fā)率高達13.3%[7]。眾所周知，子宮內膜在正常月經(jīng)周期中經(jīng)歷增殖、分化、脫落的周期性變化，而EP組織同正常子宮內膜一樣也存在周期性變化。因此推測，EP在宮腔內占位機械性干擾胚胎著床并造成子宮內膜微環(huán)境改變，有可能是導致EP不孕的重要原因[6，8]。

VEGF是血小板生長因子超家族的重要成員之一，是目前已知作用最強的促血管生成因子，能直接作用于血管內皮細胞，通過與其特異性受體結合，促進血管內皮細胞增殖并增加其通透性，介導血管內皮細胞遷移和浸潤，從而有利于血管形成[9]。VEGF在月經(jīng)周期各時期子宮內膜中均有表達，對內膜血管生成和血管通透性改變及月經(jīng)來潮后內膜再生至關重要。在增殖期，子宮內膜上皮細胞表達的VEGF主要作用于間質，可促進內皮細胞增殖、新生血管形成。在分泌期，子宮內膜VEGF表達增加，可使內膜微血管密度和血管通透性增加，內膜間質明顯水腫，為胚胎著床提供了必需的條件。在增殖期，對照組子宮內膜組織VEGF弱陽性表達，有利于血管生成，從而促進月經(jīng)后的內膜修復；觀察組無論是初發(fā)還是復發(fā)EP組織VEGF陽性表達均明顯高于周圍組織和對照組，EP組織VEGF過表達引起組織內新生血管過度生成并伴有間質纖維組織增加，顯微鏡下可見成束或成索的大血管，這是EP組織區(qū)別于正常子宮內膜組織的一個重要特征[10]；復發(fā)EP組織VEGF陽性表達明顯高于初發(fā)EP組織，VEGF高表達反映了血管內皮細胞增殖、遷徙和血管構建水平高，這可能是導致EP復發(fā)的原因之一。VEGF作為判斷子宮內膜容受性的生物學標志之一，能為種植提供血管化的容受性。在種植窗期，對照組子宮內膜組織VEGF陽性表達增加，有助于胚胎著床和早期絨毛血管形成；觀察組EP組織及周圍組織VEGF陽性表達均明顯低于對照組，其陽性表達降低可能與子宮內膜下血流灌注減少，從而影響子宮內膜容受性有關[11]，最終導致胚胎著床失敗，繼而引起不孕[12]。

Ki-67是一種與細胞增殖相關的核抗原，定位于人10號染色體，其功能與有絲分裂密切相關[13]。Ki-67反映細胞增殖活性的效果要明顯優(yōu)于PCNA指數(shù)、DNA指數(shù)、DNA倍體含量等指標。Ki-67在增生期子宮內膜組織中弱表達，而在分泌期子宮內膜組織中幾乎不表達。有研究證實，Ki-67過表達在子宮內膜病變的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。對照組增殖期子宮內膜組織Ki-67弱表達，表明處于活躍的增生狀態(tài)，有利于子宮內膜修復和再生[14]；觀察組無論是初發(fā)EP組織還是復發(fā)EP組織Ki-67陽性表達均明顯高于周圍組織和對照組；而種植窗期，兩組子宮內膜組織幾乎無Ki-67陽性表達，從而限制了子宮內膜增生，有利于子宮內膜的周期性脫落。這些結果表明，Ki-67高表達可能與EP的形成及術后復發(fā)有關，Ki-67表達增加是細胞增殖活性和有絲分裂增強的標志，提示EP是一種細胞增殖性疾病，腺體細胞和間質細胞有絲分裂增強，有更多的細胞進入增殖周期，但局限于EP內，并不是組織失控性增生[15]，故在育齡婦女中起源于EP的子宮內膜癌非常少見。EP病理組織學常見的是單純性或復雜性增生，伴或不伴整個子宮內膜增生[16]。

綜上所述，EP不孕癥患者增殖期EP組織VEGF、Ki-67高表達可能與EP形成和術后復發(fā)有關，而種植窗期EP組織VEGF低表達可能與子宮內膜容受性欠佳有關。這一結論有可能為EP不孕癥患者治療方案選擇乃至研發(fā)治療EP的靶向藥物提供理論依據(jù)。