六種食用菌體外抗氧化及抗細胞增殖活性研究

陳子涵 劉金娟

（江蘇師范大學(xué) 江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室，徐州 221116）

食用菌為一種種類繁多、營養(yǎng)豐富并易培養(yǎng)的微生物，早在神農(nóng)氏百草經(jīng)中就有關(guān)于食用菌藥理活性的記載。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明食用菌中含有大量的營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、酚類、黃酮、維生素及生物堿等，在抗氧化［1］、抗腫瘤［2］、消炎［3］及治療糖尿?。?］等方面有很好的療效。Boonsong等［5］報道香菇、平菇和黑木耳等5種常見食用菌中的總多酚和總黃酮具有很好的抗氧化能力；Xu等［6］指出一些食用菌中的多糖、黃酮等成分具有預(yù)防腫瘤的功能。另外，食用菌的抗炎特性也有報道［7］?？茖W(xué)家預(yù)測，食用菌可能會成為新一代的 “生物制劑”，為人類健康造福。但是，目前關(guān)于各食用菌的活性成分含量、抗氧化以及抗腫瘤活性的比較研究的還比較少。因此，本實驗選取日常生活中常見的6種食用菌-海鮮菇（Hypsizygus marmoreus）、香菇（Lentinus edodes）、茶樹菇（Agrocybe cylindracea）、 杏 鮑 菇（Pleurotus ostreatus）、 平 菇（Flammulina velutipes）、金針菇（Volvaria volvacea）為實驗材料，采用5種抗氧化活性檢測體系和5株腫瘤細胞對上述食用菌提取物的抗氧化活性和腫瘤增殖抑制活性進行全面、細致的評價，旨在為進一步深入研究和開發(fā)利用食用菌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 海鮮菇、香菇、茶樹菇、杏鮑菇、平菇和金針菇購自大型超市，由專業(yè)人士鑒定；

1.1.2 細胞株 人肝癌細胞HepG2、人胃癌細胞SGC-7901、人肺癌細胞NCI-H460、人乳腺癌MDAMB-231細胞、人肝細胞LO2購自中科院上海細胞庫。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清、胰蛋白酶，美國Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)液，美國Gibico公司；Resazuri，美國Sigma公司；96孔板，NEST公司；其他藥品和試劑均為國產(chǎn)分析純。

Spectra Max2酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；Thermo Form 311型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；全自動高壓滅菌器，日本三洋電機公司；5840R冷凍離心機，Gene公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 將各食用菌切成小塊狀，然后采用家用榨汁機將其榨成汁液，用低溫離心機4℃，5000 r/min離心10 min，取上清，0.22 μm無菌濾膜抽濾后保藏于-20℃冰箱，備用。

1.2.2 多酚含量測定 多酚含量測定采用Folin-Ciocalteu測定法［8］。取0.1 mL樣品提取液于試管中，加入2.8 mL蒸餾水和0.1 mL 1.0 mol /L Folin-Ciocalteu試劑，混合均勻，靜止8 min后加入2 mL 7.5%碳酸鈉溶液，搖勻，混合液密封室溫下置于避光處，2 h后于765 nm波長測定吸光值，平行測定3次，以水做空白，沒食子酸做標(biāo)準曲線，建立的回歸方程為 ：y=0.002 8x+0.（0-200 μg/mL，R2=0.9989），式中：y為吸光度值，x為沒食子酸濃度（μg/mL）。不同提取物中多酚含量以每升樣品中所含的相當(dāng)于沒食子酸的量進行計算。

1.2.3 總黃酮含量測定［9］精確量取1 mL樣品提取液于10 mL的容量瓶中，先加入0.3 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min，再加入0.3 mL的10%的硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min，然后加4 mL 4%的氫氧化鈉溶液，分別用蒸餾水稀釋至刻度，靜置15-20 min，在波長510 nm下測定吸光值，平行測定3次，以蒸餾水作為空白，蘆丁做標(biāo)準曲線，建立的回歸方程為：y= 0.011 6x+0.（0-64 μg/mL，R2= 0.9975），式中：y為吸光度值，x為蘆丁濃度（μg/mL）。不同提取物中總黃酮含量以每升樣品中所含的相當(dāng)于蘆丁的含量進行計算。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測定［10］取0.5 mL適當(dāng)濃度樣品溶液和4.5 mL 60 μmol /L的DPPH 甲醇溶液，充分混勻后于室溫下密封避光靜置30 min，以甲醇做空白，于517 nm下測吸光值。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為對照管的吸光度值；A1為樣品管的吸光度值。

1.2.5 清除羥基自由基（·OH）測定 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法［11］。向反應(yīng)管中依次加入5 mmol/L鄰二氮菲溶液1.0 mL，PBS緩沖液（pH 7.4）3.8 mL和不同濃度樣液1.0 mL，充分混勻，加5 mmol/L硫酸亞鐵1.5 mL，混勻，加0.1%的過氧化氫1.0 mL，加水稀釋至10 mL，37℃保持30 min，536 nm下測定其吸光度，記作A樣；同上操作，不加雙氧水作為未損傷管，測吸光值記為A未損；不加樣品液作為損傷管，測吸光度為A損傷。按下式計算對·OH清除率：

1.2.6 清除亞硝酸鹽（NO2-）測定 采用鹽酸萘乙二胺法［12］。向反應(yīng)管中依次加入5 μg/mL的亞硝酸鈉3.0 mL，pH 3.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液5.0mL和不同濃度樣液2.0 mL，混勻，于37℃保溫15 min，取出后立即加入0.4%對氨基苯磺酸2 mL，搖勻，靜置3-5 min，加入0.2%鹽酸萘乙二胺1.0 mL，混勻，靜置15 min，在538 nm波長處測定吸光度。分別以相應(yīng)濃度樣液做空白試驗。按下式計算清除率：

1.2.7 總抗氧化能力（T-AOC）測定［13］取一定量的樣品液，按南京建成生物工程研究所T-AOC測定試劑盒說明書測定樣品提取液的T-AOC。

1.2.8 總還原力測定 采用普魯士藍法［13］。向反應(yīng)管中依次加入0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH6.6）2.5mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL和不同濃度樣液1.0 mL，混勻后于50℃保溫20 min，快速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸之后混勻，于5000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上層液體2.5 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，混勻，在700 nm下測定吸光度，吸光度越大，還原力越強。以同濃度樣品溶液代替樣品做空白試驗。

1.2.9 各食用菌抑制腫瘤細胞增殖的活性測定 采用Alamar blue法檢測各提取物體外抗腫瘤活性，具體實驗方法參照文獻［14］，具體過程如下：將處于對數(shù)生長期的細胞傳代，將細胞接種于96孔板上，每孔加入100 μL細胞懸液，空白組中加入100 μL不含細胞的培養(yǎng)基，放入37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞完全貼壁生長。然后對照組加入100 μL DMEM培養(yǎng)基，實驗組加入100 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的各食用菌提取物，24 h后Alamar blue法檢測細胞的成活率，置于570 nm的激發(fā)波長和590 nm的發(fā)射波長下檢測熒光值。公式如下：抑制率=［（空白對照熒光值-樣品熒光值）/（空白對照熒光值-無細胞空白熒光值）］×100%。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以x-±s表示。

2 結(jié)果

2.1 不同食用菌中總酚及黃酮含量

不同食用菌提取物中總多酚及黃酮含量，見表1。金針菇和茶樹菇提取物中多酚含量最高（分別為283.54和272.70 mg/L）；香菇次之（216.04 mg/L）；平菇、杏鮑菇和海鮮菇最低（分別為159.74、158.72和155.76 mg/L）。黃酮含量在金針菇、茶樹菇中（49.79和27.84 mg/L）比較高；香菇和杏鮑菇次之（19.56和11.54 mg/L）；平菇和海鮮菇最低（分別為6.20和5.19 mg/L）。

表1 不同食用菌中總酚、總黃酮、總還原力和總抗氧化能力

2.2 六種食用菌提取物抗氧化活性分析

2.2.1 總抗氧化活性和總還原力測定 采用試劑盒測定個食用菌提取物的總抗氧化能力（表1），結(jié)果顯示各食用菌的總抗氧化能力不同，其中茶樹菇和香菇最強（22.94±4.29和20.10±3.09 U/L），海鮮菇和平菇的能力最弱（2.59±0.76和3.21±1.21 U/L）。而總還原能力是評估抗氧化劑活性的一個重要指標(biāo)。樣品還原能力越強，吸光值越大。從表1中可以看出，茶樹菇、香菇和金針菇的總還原力比較高（0.26±0.06、0.233±0.05 和 0.207±0.03），平菇和杏鮑菇最低（0.073±0.01和0.061±0.01）。從兩指標(biāo)綜合看來，茶樹菇和香菇的具有很好的抗氧化活性。

2.2.2 清除DPPH自由基能力 DPPH·自由基屬于比較穩(wěn)定的有機物自由基，廣泛應(yīng)用于測定純抗氧化劑或植物提取物的體外抗氧化活性。不同食用菌的DPPH·自由基清除能力如表2所示，不同品種食用菌的DPPH·自由基清除能力之間存在較大差異。DPPH·自由基清除能力最強的是金針菇，清除率為48.8%，杏鮑菇的清除能力最弱，為2.39%，6個供試品種的DPPH·自由基清除能力為2.39%-48.8%，變幅為46.4%。

2.2.3 清除羥基自由基和超氧陰離子自由基能力 各食用菌提取物對羥基自由基也具有不同的清除能力（表2），其中金針菇的清除能力最強（75.12%±10.35%），香菇和茶樹菇最低（47.98%±9.76%和51.55%±5.32%），6個供試品種的OH·清除能力為47.89%-75.12%，變幅為27.23%。同時本研究也檢測了各食用菌對O2-·的清除能力（表2），發(fā)現(xiàn)并無明顯差異，供試樣品的清除能力為52.11%-59.42%，變幅僅為7.31%。

表2 不同品種食用菌提取液中的抗氧化活性

2.3 六種食用菌提取物對腫瘤細胞體外增殖的影響

不同濃度的食用菌提取物對HepG2、SGC-7901、NCI-H460、MDA-MB-231和MCF-7細胞增殖的抑制率的IC50值，見表3。結(jié)果表明，茶樹菇對HepG2和NCI-H460的增殖活性最強，IC50分別是4.62±2.13和 4.96±1.84 mL/L，而金針菇對 SGC-7901和MDA-MB-231細胞的增殖活性最強，IC50的分別是5.01±1.03和6.95±1.03 mL/L，6種食用菌提取物對幾種腫瘤細胞增殖的抑制能力要強于其對正常肝細胞LO2增殖的抑制能力，說明各食用菌提取物的細胞毒性很低，具有很好的抗腫瘤活性開發(fā)前景。

表3 六種食用菌提取物抑制腫瘤細胞的IC50值

3 討論

通過化學(xué)方法測定天然產(chǎn)物清除自由基能力，是一種常用于評價天然產(chǎn)物的抗氧化活性方法。常見的自由基系統(tǒng)有：DPPH·自由基系統(tǒng)、ABTS+·自由基系統(tǒng)、羥基自由基以及O2-·自由基系統(tǒng)［15-18］。應(yīng)用多種自由基系統(tǒng)測定藥物的抗氧化能力，能夠較為準確地反映該藥物的體外抗氧化能力。本研究采用多種自由基系統(tǒng)檢測6種常見食用菌的抗氧化活性，結(jié)果顯示各食用菌對各自由基具有一定的清除能力，茶樹菇和金針菇在各方面的抗氧化活性都比較強。邱軍強等［19］研究顯示金針菇的堿水提取物具有很強的DDPH自由基清除率，并且提取物的抗氧化活性主要與多酚含量有關(guān)；孫延芳等［20］也指出茶樹菇多酚的抗氧化活性優(yōu)于研究的其他幾種食用菌。本文對各食用菌的總黃酮和總酚含量的測定結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)金針菇、茶樹菇和香菇的含量很高，這與檢測的抗氧化活性和抗細胞增殖活性的強弱是有一定的關(guān)系。

利用現(xiàn)代藥理學(xué)理論和實驗，來驗證傳統(tǒng)藥用菌的藥理活性并尋找到活性目標(biāo)成分，是將其開發(fā)為保健食品或藥品的必經(jīng)之路。本研究對常見6種食用菌提取物的抗腫瘤活性進行了比較，結(jié)果證實，在實驗濃度內(nèi)，各食用菌對受測腫瘤細胞株均有一定程度的增殖抑制活性，其中各食用菌對HepG2細胞普遍有比較好的抑制作用，而對正常肝細胞增殖活性基本上無影響。食用菌中含有多糖、酚類、蛋白類等多種成分，對抗腫瘤作用的研究很多［20］，本研究對常見食用菌進行多組腫瘤細胞株的抗腫瘤測定，為進一步開發(fā)高附加值的保健品提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

（1）測定的6種食用菌在不同的抗氧化途徑中均有良好的抗氧化活性，其中茶樹菇和金針菇在各方面的抗氧化活性都比較強，而其多酚和黃酮含量也是最高的。（2）測定的6種食用菌對正常肝細胞LO2的毒性均較低，對測定的腫瘤細胞株均顯示出不同的抗腫瘤增殖活性，其中各食用菌對HepG2細胞普遍有比較好的抑制作用，作用最強的是金針菇和茶樹菇。