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    利用重測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)高粱多態(tài)性SSR分子標(biāo)記

    2019-11-21 11:09:26王平王春語(yǔ)張麗霞叢玲朱振興陸曉春
    生物技術(shù)通報(bào) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:多態(tài)拷貝堿基

    王平 王春語(yǔ) 張麗霞 叢玲 朱振興 陸曉春

    (1遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高粱研究所,沈陽(yáng) 110161;2沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,沈陽(yáng) 110161)

    高粱是世界上重要的糧食作物,是五大作物之一,在人類發(fā)展史上扮演了重要角色[1]。隨著分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)的發(fā)展,越來(lái)越多的重要基因被克隆出來(lái),使得分子育種技術(shù)迅速發(fā)展。分子育種技術(shù)以及基因圖位克隆的深入發(fā)展,都離不開(kāi)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展至今,已經(jīng)經(jīng)歷過(guò)幾代分子標(biāo)記的歷程,從AFLP,SSR標(biāo)記發(fā)展到今天的SNP標(biāo)記[2-4]。盡管SNP標(biāo)記在很多地方已經(jīng)利用起來(lái),但是SNP標(biāo)記利用需要用到一些特殊儀器設(shè)備,這些設(shè)備價(jià)格不菲,如利用KASP系統(tǒng),儀器昂貴[5];或是利用酶切方法開(kāi)發(fā)CAPS標(biāo)記或是dCAPS標(biāo)記,酶切的方法成本高,分辨率低,酶切不完全等問(wèn)題,經(jīng)常會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成一些困擾[6]。雖然還有其他檢測(cè)SNP的方法,但總體操作相對(duì)復(fù)雜,核心問(wèn)題是SNP標(biāo)記僅有兩種多態(tài)型,以上這些因素都限制了SNP的應(yīng)用。而SSR標(biāo)記即短序列重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記,因其開(kāi)發(fā)價(jià)格低廉,使用門檻很低,多態(tài)性好而且穩(wěn)定等原因在現(xiàn)階段的實(shí)踐中有很大的運(yùn)用空間[3]。測(cè)序技術(shù)的飛躍發(fā)展,使得高通量測(cè)序成本日益降低,在科研中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[7-8]。利用高通量測(cè)序技術(shù)在很多物種中進(jìn)行了SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用,大多使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù),如在芝麻、豌豆、蘇丹草及馬尾松等作物中都用到RNA-Seq數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記[9-12]。因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序通量、基因時(shí)空表達(dá)以及僅限基因區(qū)域序列等因素影響造成開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記產(chǎn)量小,質(zhì)量不高。盡管美國(guó)高粱品種BTX623在2009年就完成了基因組測(cè)序[13],也預(yù)測(cè)了很多SSR標(biāo)記[14-15],但越來(lái)越多的研究表明很多參考基因組僅能代表一部分生態(tài)型的多樣性,這也是泛基因組學(xué)研究興起的重要原因[16-17]。來(lái)源于美國(guó)種質(zhì)的BTX623僅能代表部分生態(tài)型品種的序列,而且在國(guó)內(nèi)高粱育種中使用的很多資源與BTX623有較大的差異,造成SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)在基因組一些區(qū)域的多態(tài)性標(biāo)記開(kāi)發(fā)效率低下,極大限制了高粱SSR分子標(biāo)記的應(yīng)用。

    為了有效開(kāi)發(fā)多態(tài)性SSR標(biāo)記,本研究利用26個(gè)包括不育系和恢復(fù)系的材料,然后進(jìn)行重測(cè)序。測(cè)序完成后,利用生物信息分析工具開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記,進(jìn)行一系列分析后最終開(kāi)發(fā)了兩萬(wàn)多個(gè)SSR標(biāo)記,并部分驗(yàn)證了SSR 標(biāo)記的多態(tài)性,這些標(biāo)記的成功開(kāi)發(fā),為將來(lái)基因定位、克隆、分子育種等實(shí)踐提供了重要的分子標(biāo)記信息。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    重測(cè)序?qū)嶒?yàn)材料:高粱生產(chǎn)骨干親本:12份恢復(fù)系和14份不育系(表1)。所有實(shí)驗(yàn)材料于5月上旬在沈陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地種植,行長(zhǎng)4 m,株距15 cm。

    表112份恢復(fù)系和14份不育系樣品信息

    1.2 方法

    1.2.1 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)過(guò)程 生物信息學(xué)分析流程如下:對(duì)12份恢復(fù)系和14份不育系高粱材料進(jìn)行了10×重測(cè)序,然后從兩個(gè)途徑同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中分析變異信息的軟件GATK(Genome Analysis ToolKit)算法分析全基因組indel差異,另一方面利用BTX623參考基因組和簡(jiǎn)單重復(fù)序列鑒定軟件MISA(MIcroSAtellite identification tool)分析全基因組SSR位點(diǎn)信息,然后綜合比較得到全基因組SSR差異位點(diǎn)信息,而后進(jìn)行單拷貝基因的分析,綜合SSR差異位點(diǎn)分析,依據(jù)SSR標(biāo)記重復(fù)單元堿基數(shù)進(jìn)行分析,然后依據(jù)兩端保守序列進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)。引物設(shè)計(jì)利用Primer 3軟件,遵循引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)正反向擴(kuò)增引物,引物的GC含量在50%-60%之間,長(zhǎng)度在18-23 bp左右,退火溫度設(shè)在57-63℃之間,以58℃為最佳。設(shè)計(jì)時(shí)避免3'末端堿基為A,以及潛在二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。將挑選要進(jìn)行合成的引物,送往蘇州金唯智公司合成(https://www.genewiz.com.cn)。

    1.2.2 DNA提取 實(shí)驗(yàn)材料開(kāi)始抽穗時(shí)剪取葉片1-2 cm到2 mL離心管中,然后加入 600 μL TPS(100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),10 mmol/L EDTA(pH8.0),1 mol/L KC,高壓濕熱滅菌后使用)提取液;放入一個(gè)不銹鋼珠(直徑約5 mm),在組織磨樣機(jī)(Tissuelyser Ⅱ,QIAGEN,德國(guó))上研磨,頻率設(shè)定為20/s,研磨 1-2 min;利用強(qiáng)力磁鐵取出鋼珠,將離心管放入 65℃水浴中保溫 30 min;12 000r/min 離心 5 min,小心吸出上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 離心管,加入等體積的異丙醇,輕輕顛倒混勻,clss= r/min 離心10 min,棄上清。加入 1 mL 70%乙醇洗滌沉淀,12000 r/min 離心 5 min,棄上清,留沉淀,打開(kāi)管蓋,待沉淀完全干燥后加入 50 μL包含0.2 mg/mL Rnase A(生工生物工程有限公司,上海,中國(guó))的滅菌水或是1×TE buffer溶解沉淀。提取的高粱葉片基因組DNA在0.8%-1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)合格后保存于-20℃冰箱備用。

    1.2.3 SSR電泳分析 PCR及聚丙烯酰胺凝膠電泳:高粱基因組 DNA 1 μL,F(xiàn)/R-primer(10 μmol/L)0.2μL,2×Taq PCR Master Mix 5 μL(北京艾德萊生物),ddH2O 3.8 μL總體積10 μL;反應(yīng)在PCR儀上(T100 Thermal cycler,BIO-RAD,美國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增程序如下:95℃預(yù)變性3 min;94℃ 30 s、X℃30 s、72℃ 25 s,34個(gè)循環(huán),最后72℃ 延伸5 min;其中退火溫度X隨引物設(shè)計(jì)適度調(diào)整。PCR產(chǎn)物取2-2.5 μL用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5-2.0 h左右(根據(jù)差異大小來(lái)決定電泳時(shí)間)。電泳結(jié)束后,關(guān)閉電源,從電泳槽中將膠板取下,用鏟子將兩板分開(kāi),緩慢將膠取下,并記錄膠的順序編號(hào),經(jīng)銀染、顯色、水洗等程序獲得擴(kuò)增條帶,然后在燈箱板上進(jìn)行膠片的拍攝(EOS 5D,Canon,日本)。

    2 結(jié)果

    2.126份重測(cè)序材料多態(tài)性SSR標(biāo)記篩選

    利用高粱中26份具有代表性的不育系和恢復(fù)系材料,進(jìn)行重測(cè)序序列分析。重測(cè)序完成后,進(jìn)行SSR標(biāo)記的篩選,為考慮將來(lái)SSR分子標(biāo)記檢測(cè)的便利性,本研究制定了比較嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)。SSR篩選標(biāo)準(zhǔn)如下所示:(1)兩堿基單元重復(fù)SSR標(biāo)記的重復(fù)次數(shù)需≥6次重復(fù),即這個(gè)SSR標(biāo)記長(zhǎng)度必須在12 bp以上;三堿基重復(fù)序列SSR重復(fù)次數(shù)≥5次;四堿基重復(fù)序列SSR的重復(fù)次數(shù)≥4次;五堿基重復(fù)序列SSR的重復(fù)次數(shù)≥3;六堿基重復(fù)序列SSR的重復(fù)次數(shù)≥3次。(2)在所有26個(gè)高粱品種中要有多態(tài)性,至少是兩種。經(jīng)過(guò)了本研究的標(biāo)準(zhǔn)篩選,共得到24441個(gè)多態(tài)性SSR,以2或是3個(gè)基序重復(fù)的SSR為主,兩堿基重復(fù)SSR標(biāo)記11051個(gè);三堿基重復(fù)6082個(gè);四堿基重復(fù)2600個(gè);五堿基重復(fù)2449個(gè);六堿基重復(fù)2259個(gè)(圖1-A)。對(duì)篩選到的SSR標(biāo)記在26個(gè)品種間進(jìn)行基因型比較,基因型多態(tài)類型在2-7種之間,最多能達(dá)到7種多態(tài)型,大部分的標(biāo)記僅有兩種,然后多態(tài)性數(shù)目呈斷崖式下降,以2種多態(tài)性的為主,高達(dá)68%;其次是3種多態(tài)型的占21%;而其它幾種多態(tài)型就相對(duì)較少分布,7種多態(tài)型的標(biāo)記僅有77個(gè)(圖1-B)。

    圖1 不同重復(fù)單元堿基數(shù)的SSR 標(biāo)記的數(shù)量(A)及其在26個(gè)品種間的不同多態(tài)型標(biāo)記數(shù)量(B)

    2.2 單拷貝基因處多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的篩選

    在分子育種實(shí)踐中,功能性標(biāo)記起到至關(guān)重要的作用。功能性標(biāo)記,主要是位于基因位置上的標(biāo)記,而一般這樣的基因,幾乎都是單拷貝基因。所以本研究的策略是篩選在單拷貝基因位置的SSR標(biāo)記。本研究篩選首先是進(jìn)行單拷貝基因的鑒定,然后分析這些單拷貝基因(包含該基因上下游)序列中所包含的SSR序列,篩選位于單拷貝基因(含上下游2 k)內(nèi)的多態(tài)性SSR標(biāo)記。相對(duì)所有的SSR標(biāo)記數(shù)量,位于基因區(qū)標(biāo)記的SSR數(shù)量,僅為總量的1/4左右,總計(jì)篩選到6733個(gè)標(biāo)記。2-3個(gè)基序重復(fù)的SSR標(biāo)記,僅有2000左右,而4-6重復(fù)的SSR標(biāo)記,約700-800個(gè)(圖2-A)。大部分的單拷貝基因上SSR標(biāo)記在26個(gè)品種僅有2種基因型,占了總SSR的69%;其次為3種基因型占總數(shù)的20%,4-7種基因型的SSR標(biāo)記比較少,7種基因型的SSR標(biāo)記僅為28個(gè)(圖2-B)。

    圖2 單拷貝基因處不同重復(fù)單元堿基數(shù)的SSR標(biāo)記數(shù)量(A)和26個(gè)品種間不同多態(tài)型標(biāo)記數(shù)量(B)

    2.3 單拷貝基因處多態(tài)性SSR分子標(biāo)記在基因上位置分析

    通過(guò)分析這些SSR標(biāo)記在基因上的位置,6733個(gè)SSR標(biāo)記中,位于編碼區(qū)的僅有820個(gè),UTR區(qū)1276個(gè),內(nèi)含子725個(gè),大多在上下游區(qū)域共3932個(gè)。如在2個(gè)基序重復(fù)的SSR中,占有63%,而分布在編碼區(qū)多為3堿基或6堿基重復(fù)(圖3-A)。這些SSR標(biāo)記在26個(gè)品種間的基因型數(shù),可以看出在基因上下游區(qū)域的SSR標(biāo)記居多,位于基因編碼區(qū)的最少,約占所有在編碼區(qū)附近的12%。大多數(shù)SSR在26個(gè)高粱品種有兩種基因型,依次遞減到7種多態(tài)型(圖3-B)。

    2.4 SSR標(biāo)記有效性評(píng)價(jià)

    為了檢測(cè)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的有效性,本研究在位于編碼區(qū)約800個(gè)SSR標(biāo)記引物中,在每條染色體上挑選了5對(duì)相對(duì)均一覆蓋整條染色體的SSR標(biāo)記,在10條染色體上進(jìn)行了引物的挑選、合成,共計(jì)50對(duì)引物,引物相關(guān)信息如表2所示。為了檢驗(yàn)引物的實(shí)用性,利用了參考基因組高粱材料BTX623和雜交種遼糯3號(hào),因?yàn)楸狙芯吭谟N實(shí)踐中很多時(shí)候利用的是雜交種材料。在50對(duì)引物中,兩個(gè)材料中僅有一對(duì)引物未擴(kuò)增出產(chǎn)物(Chr6-3兩個(gè)親本間無(wú)擴(kuò)增),引物成功率高達(dá)98%,另有兩對(duì)引物僅能在一個(gè)材料中進(jìn)行擴(kuò)增;另一個(gè)材料顯示無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物(Chr2-3,Chr2-5都是在BTX623中無(wú)擴(kuò)增,在遼糯3中能正常擴(kuò)增),最終顯示有18對(duì)引物在這兩個(gè)親本間存在多態(tài)性。

    為進(jìn)一步檢驗(yàn)該批引物的質(zhì)量,本研究同時(shí)挑選了引物Chr1-1,分析其在74份核心種質(zhì)資源中的多態(tài)性豐富程度。該引物在BTX623中擴(kuò)增的產(chǎn)物的大小,應(yīng)該是266 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物中較濃的條帶,大小基本符合預(yù)期,該條帶即是目標(biāo)條帶。條帶大小比對(duì)分析表明,該標(biāo)記在74份核心種質(zhì)資源中至少有8種多態(tài)型,標(biāo)記Chr1-1具有比較高的分辨能力(圖4)。

    圖3 位于單拷貝基因上不同重復(fù)單元堿基數(shù)的SSR標(biāo)記位于基因不同位置的數(shù)量(A)及其在26個(gè)品種間的多態(tài)型數(shù)目(B)

    3 討論

    SSR分子標(biāo)記因其價(jià)廉物美,儀器設(shè)備要求不高、多態(tài)性好、實(shí)踐中可操作性強(qiáng)等特點(diǎn),一直是分子標(biāo)記領(lǐng)域的熱門開(kāi)發(fā)方向[3,18-19]。近年來(lái),由于高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,成本日益降級(jí),利用高通量測(cè)序開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記,越來(lái)越高效和便捷。在很多研究中利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記,由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)本身的缺陷,如測(cè)序主要是基因轉(zhuǎn)錄區(qū)段,

    很多基因具有時(shí)空表達(dá),于是會(huì)漏掉很多基因組序列信息,造成開(kāi)發(fā)多態(tài)性SSR標(biāo)記效率并不高[9-12]。

    表2 分布于10條染色體上的50對(duì)SSR引物信息

    圖4 引物Chr1-1在74份高粱微核心種質(zhì)資源中多態(tài)性分析

    在高粱作物中盡管BTX623的基因組序列在2009 年已經(jīng)完成[13],Yonemaru 等[15]利用該基因組序列開(kāi)發(fā)多態(tài)性SSR標(biāo)記,共獲得5599個(gè)非冗余SSR標(biāo)記,其中(AT/TA)n占所有SSR的26.1%,其次是(AG/TC)n 占20.5%、(AC/TG)n占13.7%和(CG/GC)n占11.8%。其中5012個(gè)SSR標(biāo)記染色體位置是通過(guò)e-PCR技術(shù)與34008個(gè)基因座的預(yù)測(cè)位置進(jìn)行比較來(lái)確定的。在通過(guò)片段分析驗(yàn)證的970個(gè)標(biāo)記中,67.8%(970個(gè)標(biāo)記中的658個(gè))的標(biāo)記成功地在高粱品系BTx623中擴(kuò)增,在11個(gè)高粱品系和一個(gè)蘇丹草品系的組合中,所有SSR基因座的平均多態(tài)性率為45.1%(658個(gè)標(biāo)記中的297個(gè))。BTX623來(lái)源于美國(guó),其基因組序列僅能代表部分生態(tài)型品種的序列,國(guó)內(nèi)高粱育種中使用的很多資源與BTX623有較大的差異,且遺傳范圍狹窄,造成SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)在基因組一些區(qū)域的多態(tài)性標(biāo)記開(kāi)發(fā)效率低下,極大限制了高粱SSR分子標(biāo)記在國(guó)內(nèi)高粱育種上的應(yīng)用。

    為了能開(kāi)發(fā)多態(tài)性高的SSR標(biāo)記,本研究利用實(shí)驗(yàn)室先前進(jìn)行了26份不育系和恢復(fù)系材料重測(cè)序,利用這26份材料的重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā),有效提高了多態(tài)性標(biāo)記開(kāi)發(fā)的力度和效率。本研究設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的50對(duì)SSR引物在兩個(gè)親本BTX623和雜交種遼糯3中進(jìn)行擴(kuò)增,有49對(duì)成功擴(kuò)增出條帶,其中有兩對(duì)引物僅在遼糯3號(hào)中能夠擴(kuò)增,表明很有可能某些基因組區(qū)域在BTX623中是缺失的,僅存在國(guó)內(nèi)某些高粱材料中。50對(duì)引物在這兩個(gè)品種中有多態(tài)性的SSR標(biāo)記為36%,并挑選了SSR標(biāo)記Chr1-1在74份微核心種質(zhì)資源中進(jìn)行分析,初步分析該標(biāo)記在這些種質(zhì)資源中有8種多態(tài)型之多,表明從開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記中容易篩選出多態(tài)性好的標(biāo)記。

    本研究開(kāi)發(fā)的SSR分子標(biāo)記是以26份材料中必須至少有兩種多態(tài)型作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。在這些入選的SSR標(biāo)記中,大部分入選的SSR標(biāo)記都是以2個(gè)堿基基序?yàn)橹貜?fù)單元的分子標(biāo)記,3個(gè)以上堿基重復(fù)的達(dá)到6082,26個(gè)品種中多態(tài)性超過(guò)2種的有24441,分布在單拷貝基因上SSR標(biāo)記占總標(biāo)記數(shù)1/4,分布單拷貝基因編碼區(qū)的標(biāo)記占落在單拷貝基因上的12%。這些標(biāo)記類型和特點(diǎn)為高粱基因定位、克隆以及分子育種等分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了可靠的參考數(shù)據(jù)。

    4 結(jié)論

    利用14個(gè)不育系和12個(gè)恢復(fù)系作為重測(cè)序材料,開(kāi)發(fā)了在26份材料中至少含有2種多態(tài)型的SSR標(biāo)記24441個(gè)單拷貝基因處的多態(tài)性SSR 6733個(gè)。隨機(jī)挑選均勻覆蓋10條染色體的單拷貝基因處SSR標(biāo)記50對(duì),利用遼寧高粱雜交種遼糯3號(hào)進(jìn)行測(cè)試,其中49對(duì)能擴(kuò)增出產(chǎn)物,成功率高達(dá)98%,利用高粱雜交種遼糯3號(hào)、BTX623和74份微核心種質(zhì)資源測(cè)試表明,50對(duì)SSR標(biāo)記在2個(gè)品種中有18對(duì)表現(xiàn)出多態(tài)性,挑選了一對(duì)引物在74份微核心種質(zhì)中可見(jiàn)8種多態(tài)型。本研究表明利用不育系和恢復(fù)系材料進(jìn)行重測(cè)序能有效開(kāi)發(fā)多態(tài)性高的SSR標(biāo)記。

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