利用重測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)高粱多態(tài)性SSR分子標(biāo)記

王平 王春語(yǔ) 張麗霞 叢玲 朱振興 陸曉春

（1遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高粱研究所，沈陽(yáng) 110161；2沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，沈陽(yáng) 110161）

高粱是世界上重要的糧食作物，是五大作物之一，在人類發(fā)展史上扮演了重要角色［1］。隨著分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的重要基因被克隆出來(lái)，使得分子育種技術(shù)迅速發(fā)展。分子育種技術(shù)以及基因圖位克隆的深入發(fā)展，都離不開(kāi)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)經(jīng)歷過(guò)幾代分子標(biāo)記的歷程，從AFLP，SSR標(biāo)記發(fā)展到今天的SNP標(biāo)記［2-4］。盡管SNP標(biāo)記在很多地方已經(jīng)利用起來(lái)，但是SNP標(biāo)記利用需要用到一些特殊儀器設(shè)備，這些設(shè)備價(jià)格不菲，如利用KASP系統(tǒng)，儀器昂貴［5］；或是利用酶切方法開(kāi)發(fā)CAPS標(biāo)記或是dCAPS標(biāo)記，酶切的方法成本高，分辨率低，酶切不完全等問(wèn)題，經(jīng)常會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成一些困擾［6］。雖然還有其他檢測(cè)SNP的方法，但總體操作相對(duì)復(fù)雜，核心問(wèn)題是SNP標(biāo)記僅有兩種多態(tài)型，以上這些因素都限制了SNP的應(yīng)用。而SSR標(biāo)記即短序列重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記，因其開(kāi)發(fā)價(jià)格低廉，使用門檻很低，多態(tài)性好而且穩(wěn)定等原因在現(xiàn)階段的實(shí)踐中有很大的運(yùn)用空間［3］。測(cè)序技術(shù)的飛躍發(fā)展，使得高通量測(cè)序成本日益降低，在科研中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用［7-8］。利用高通量測(cè)序技術(shù)在很多物種中進(jìn)行了SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，大多使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)，如在芝麻、豌豆、蘇丹草及馬尾松等作物中都用到RNA-Seq數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記［9-12］。因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序通量、基因時(shí)空表達(dá)以及僅限基因區(qū)域序列等因素影響造成開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記產(chǎn)量小，質(zhì)量不高。盡管美國(guó)高粱品種BTX623在2009年就完成了基因組測(cè)序［13］，也預(yù)測(cè)了很多SSR標(biāo)記［14-15］，但越來(lái)越多的研究表明很多參考基因組僅能代表一部分生態(tài)型的多樣性，這也是泛基因組學(xué)研究興起的重要原因［16-17］。來(lái)源于美國(guó)種質(zhì)的BTX623僅能代表部分生態(tài)型品種的序列，而且在國(guó)內(nèi)高粱育種中使用的很多資源與BTX623有較大的差異，造成SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)在基因組一些區(qū)域的多態(tài)性標(biāo)記開(kāi)發(fā)效率低下，極大限制了高粱SSR分子標(biāo)記的應(yīng)用。

為了有效開(kāi)發(fā)多態(tài)性SSR標(biāo)記，本研究利用26個(gè)包括不育系和恢復(fù)系的材料，然后進(jìn)行重測(cè)序。測(cè)序完成后，利用生物信息分析工具開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記，進(jìn)行一系列分析后最終開(kāi)發(fā)了兩萬(wàn)多個(gè)SSR標(biāo)記，并部分驗(yàn)證了SSR 標(biāo)記的多態(tài)性，這些標(biāo)記的成功開(kāi)發(fā)，為將來(lái)基因定位、克隆、分子育種等實(shí)踐提供了重要的分子標(biāo)記信息。

1 材料與方法

1.1 材料

重測(cè)序?qū)嶒?yàn)材料：高粱生產(chǎn)骨干親本：12份恢復(fù)系和14份不育系（表1）。所有實(shí)驗(yàn)材料于5月上旬在沈陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地種植，行長(zhǎng)4 m，株距15 cm。

表112份恢復(fù)系和14份不育系樣品信息

1.2 方法

1.2.1 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)過(guò)程 生物信息學(xué)分析流程如下：對(duì)12份恢復(fù)系和14份不育系高粱材料進(jìn)行了10×重測(cè)序，然后從兩個(gè)途徑同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中分析變異信息的軟件GATK（Genome Analysis ToolKit）算法分析全基因組indel差異，另一方面利用BTX623參考基因組和簡(jiǎn)單重復(fù)序列鑒定軟件MISA（MIcroSAtellite identification tool）分析全基因組SSR位點(diǎn)信息，然后綜合比較得到全基因組SSR差異位點(diǎn)信息，而后進(jìn)行單拷貝基因的分析，綜合SSR差異位點(diǎn)分析，依據(jù)SSR標(biāo)記重復(fù)單元堿基數(shù)進(jìn)行分析，然后依據(jù)兩端保守序列進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)。引物設(shè)計(jì)利用Primer 3軟件，遵循引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)正反向擴(kuò)增引物，引物的GC含量在50%-60%之間，長(zhǎng)度在18-23 bp左右，退火溫度設(shè)在57-63℃之間，以58℃為最佳。設(shè)計(jì)時(shí)避免3'末端堿基為A，以及潛在二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。將挑選要進(jìn)行合成的引物，送往蘇州金唯智公司合成（https：//www.genewiz.com.cn）。

1.2.2 DNA提取 實(shí)驗(yàn)材料開(kāi)始抽穗時(shí)剪取葉片1-2 cm到2 mL離心管中，然后加入 600 μL TPS（100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0），1 mol/L KC，高壓濕熱滅菌后使用）提取液；放入一個(gè)不銹鋼珠（直徑約5 mm），在組織磨樣機(jī)（Tissuelyser Ⅱ，QIAGEN，德國(guó)）上研磨，頻率設(shè)定為20/s，研磨 1-2 min；利用強(qiáng)力磁鐵取出鋼珠，將離心管放入 65℃水浴中保溫 30 min；12 000r/min 離心 5 min，小心吸出上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，clss= r/min 離心10 min，棄上清。加入 1 mL 70%乙醇洗滌沉淀，12000 r/min 離心 5 min，棄上清，留沉淀，打開(kāi)管蓋，待沉淀完全干燥后加入 50 μL包含0.2 mg/mL Rnase A（生工生物工程有限公司，上海，中國(guó)）的滅菌水或是1×TE buffer溶解沉淀。提取的高粱葉片基因組DNA在0.8%-1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)合格后保存于-20℃冰箱備用。

1.2.3 SSR電泳分析 PCR及聚丙烯酰胺凝膠電泳：高粱基因組 DNA 1 μL，F(xiàn)/R-primer（10 μmol/L）0.2μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL（北京艾德萊生物），ddH2O 3.8 μL總體積10 μL；反應(yīng)在PCR儀上（T100 Thermal cycler，BIO-RAD，美國(guó)）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s、X℃30 s、72℃ 25 s，34個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸5 min；其中退火溫度X隨引物設(shè)計(jì)適度調(diào)整。PCR產(chǎn)物取2-2.5 μL用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5-2.0 h左右（根據(jù)差異大小來(lái)決定電泳時(shí)間）。電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，從電泳槽中將膠板取下，用鏟子將兩板分開(kāi)，緩慢將膠取下，并記錄膠的順序編號(hào)，經(jīng)銀染、顯色、水洗等程序獲得擴(kuò)增條帶，然后在燈箱板上進(jìn)行膠片的拍攝（EOS 5D，Canon，日本）。

2 結(jié)果

2.126份重測(cè)序材料多態(tài)性SSR標(biāo)記篩選

利用高粱中26份具有代表性的不育系和恢復(fù)系材料，進(jìn)行重測(cè)序序列分析。重測(cè)序完成后，進(jìn)行SSR標(biāo)記的篩選，為考慮將來(lái)SSR分子標(biāo)記檢測(cè)的便利性，本研究制定了比較嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)。SSR篩選標(biāo)準(zhǔn)如下所示：（1）兩堿基單元重復(fù)SSR標(biāo)記的重復(fù)次數(shù)需≥6次重復(fù)，即這個(gè)SSR標(biāo)記長(zhǎng)度必須在12 bp以上；三堿基重復(fù)序列SSR重復(fù)次數(shù)≥5次；四堿基重復(fù)序列SSR的重復(fù)次數(shù)≥4次；五堿基重復(fù)序列SSR的重復(fù)次數(shù)≥3；六堿基重復(fù)序列SSR的重復(fù)次數(shù)≥3次。（2）在所有26個(gè)高粱品種中要有多態(tài)性，至少是兩種。經(jīng)過(guò)了本研究的標(biāo)準(zhǔn)篩選，共得到24441個(gè)多態(tài)性SSR，以2或是3個(gè)基序重復(fù)的SSR為主，兩堿基重復(fù)SSR標(biāo)記11051個(gè)；三堿基重復(fù)6082個(gè)；四堿基重復(fù)2600個(gè)；五堿基重復(fù)2449個(gè)；六堿基重復(fù)2259個(gè)（圖1-A）。對(duì)篩選到的SSR標(biāo)記在26個(gè)品種間進(jìn)行基因型比較，基因型多態(tài)類型在2-7種之間，最多能達(dá)到7種多態(tài)型，大部分的標(biāo)記僅有兩種，然后多態(tài)性數(shù)目呈斷崖式下降，以2種多態(tài)性的為主，高達(dá)68%；其次是3種多態(tài)型的占21%；而其它幾種多態(tài)型就相對(duì)較少分布，7種多態(tài)型的標(biāo)記僅有77個(gè)（圖1-B）。

圖1 不同重復(fù)單元堿基數(shù)的SSR 標(biāo)記的數(shù)量（A）及其在26個(gè)品種間的不同多態(tài)型標(biāo)記數(shù)量（B）

2.2 單拷貝基因處多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的篩選

在分子育種實(shí)踐中，功能性標(biāo)記起到至關(guān)重要的作用。功能性標(biāo)記，主要是位于基因位置上的標(biāo)記，而一般這樣的基因，幾乎都是單拷貝基因。所以本研究的策略是篩選在單拷貝基因位置的SSR標(biāo)記。本研究篩選首先是進(jìn)行單拷貝基因的鑒定，然后分析這些單拷貝基因（包含該基因上下游）序列中所包含的SSR序列，篩選位于單拷貝基因（含上下游2 k）內(nèi)的多態(tài)性SSR標(biāo)記。相對(duì)所有的SSR標(biāo)記數(shù)量，位于基因區(qū)標(biāo)記的SSR數(shù)量，僅為總量的1/4左右，總計(jì)篩選到6733個(gè)標(biāo)記。2-3個(gè)基序重復(fù)的SSR標(biāo)記，僅有2000左右，而4-6重復(fù)的SSR標(biāo)記，約700-800個(gè)（圖2-A）。大部分的單拷貝基因上SSR標(biāo)記在26個(gè)品種僅有2種基因型，占了總SSR的69%；其次為3種基因型占總數(shù)的20%，4-7種基因型的SSR標(biāo)記比較少，7種基因型的SSR標(biāo)記僅為28個(gè)（圖2-B）。

圖2 單拷貝基因處不同重復(fù)單元堿基數(shù)的SSR標(biāo)記數(shù)量（A）和26個(gè)品種間不同多態(tài)型標(biāo)記數(shù)量（B）

2.3 單拷貝基因處多態(tài)性SSR分子標(biāo)記在基因上位置分析

通過(guò)分析這些SSR標(biāo)記在基因上的位置，6733個(gè)SSR標(biāo)記中，位于編碼區(qū)的僅有820個(gè)，UTR區(qū)1276個(gè)，內(nèi)含子725個(gè)，大多在上下游區(qū)域共3932個(gè)。如在2個(gè)基序重復(fù)的SSR中，占有63%，而分布在編碼區(qū)多為3堿基或6堿基重復(fù)（圖3-A）。這些SSR標(biāo)記在26個(gè)品種間的基因型數(shù)，可以看出在基因上下游區(qū)域的SSR標(biāo)記居多，位于基因編碼區(qū)的最少，約占所有在編碼區(qū)附近的12%。大多數(shù)SSR在26個(gè)高粱品種有兩種基因型，依次遞減到7種多態(tài)型（圖3-B）。

2.4 SSR標(biāo)記有效性評(píng)價(jià)

為了檢測(cè)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的有效性，本研究在位于編碼區(qū)約800個(gè)SSR標(biāo)記引物中，在每條染色體上挑選了5對(duì)相對(duì)均一覆蓋整條染色體的SSR標(biāo)記，在10條染色體上進(jìn)行了引物的挑選、合成，共計(jì)50對(duì)引物，引物相關(guān)信息如表2所示。為了檢驗(yàn)引物的實(shí)用性，利用了參考基因組高粱材料BTX623和雜交種遼糯3號(hào)，因?yàn)楸狙芯吭谟N實(shí)踐中很多時(shí)候利用的是雜交種材料。在50對(duì)引物中，兩個(gè)材料中僅有一對(duì)引物未擴(kuò)增出產(chǎn)物（Chr6-3兩個(gè)親本間無(wú)擴(kuò)增），引物成功率高達(dá)98%，另有兩對(duì)引物僅能在一個(gè)材料中進(jìn)行擴(kuò)增；另一個(gè)材料顯示無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物（Chr2-3，Chr2-5都是在BTX623中無(wú)擴(kuò)增，在遼糯3中能正常擴(kuò)增），最終顯示有18對(duì)引物在這兩個(gè)親本間存在多態(tài)性。

為進(jìn)一步檢驗(yàn)該批引物的質(zhì)量，本研究同時(shí)挑選了引物Chr1-1，分析其在74份核心種質(zhì)資源中的多態(tài)性豐富程度。該引物在BTX623中擴(kuò)增的產(chǎn)物的大小，應(yīng)該是266 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物中較濃的條帶，大小基本符合預(yù)期，該條帶即是目標(biāo)條帶。條帶大小比對(duì)分析表明，該標(biāo)記在74份核心種質(zhì)資源中至少有8種多態(tài)型，標(biāo)記Chr1-1具有比較高的分辨能力（圖4）。

圖3 位于單拷貝基因上不同重復(fù)單元堿基數(shù)的SSR標(biāo)記位于基因不同位置的數(shù)量（A）及其在26個(gè)品種間的多態(tài)型數(shù)目（B）

3 討論

SSR分子標(biāo)記因其價(jià)廉物美，儀器設(shè)備要求不高、多態(tài)性好、實(shí)踐中可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，一直是分子標(biāo)記領(lǐng)域的熱門開(kāi)發(fā)方向［3，18-19］。近年來(lái)，由于高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，成本日益降級(jí)，利用高通量測(cè)序開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，越來(lái)越高效和便捷。在很多研究中利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記，由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)本身的缺陷，如測(cè)序主要是基因轉(zhuǎn)錄區(qū)段，

很多基因具有時(shí)空表達(dá)，于是會(huì)漏掉很多基因組序列信息，造成開(kāi)發(fā)多態(tài)性SSR標(biāo)記效率并不高［9-12］。

表2 分布于10條染色體上的50對(duì)SSR引物信息

圖4 引物Chr1-1在74份高粱微核心種質(zhì)資源中多態(tài)性分析

在高粱作物中盡管BTX623的基因組序列在2009 年已經(jīng)完成［13］，Yonemaru 等［15］利用該基因組序列開(kāi)發(fā)多態(tài)性SSR標(biāo)記，共獲得5599個(gè)非冗余SSR標(biāo)記，其中（AT/TA）n占所有SSR的26.1%，其次是（AG/TC）n 占20.5%、（AC/TG）n占13.7%和（CG/GC）n占11.8%。其中5012個(gè)SSR標(biāo)記染色體位置是通過(guò)e-PCR技術(shù)與34008個(gè)基因座的預(yù)測(cè)位置進(jìn)行比較來(lái)確定的。在通過(guò)片段分析驗(yàn)證的970個(gè)標(biāo)記中，67.8%（970個(gè)標(biāo)記中的658個(gè)）的標(biāo)記成功地在高粱品系BTx623中擴(kuò)增，在11個(gè)高粱品系和一個(gè)蘇丹草品系的組合中，所有SSR基因座的平均多態(tài)性率為45.1%（658個(gè)標(biāo)記中的297個(gè)）。BTX623來(lái)源于美國(guó)，其基因組序列僅能代表部分生態(tài)型品種的序列，國(guó)內(nèi)高粱育種中使用的很多資源與BTX623有較大的差異，且遺傳范圍狹窄，造成SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)在基因組一些區(qū)域的多態(tài)性標(biāo)記開(kāi)發(fā)效率低下，極大限制了高粱SSR分子標(biāo)記在國(guó)內(nèi)高粱育種上的應(yīng)用。

為了能開(kāi)發(fā)多態(tài)性高的SSR標(biāo)記，本研究利用實(shí)驗(yàn)室先前進(jìn)行了26份不育系和恢復(fù)系材料重測(cè)序，利用這26份材料的重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，有效提高了多態(tài)性標(biāo)記開(kāi)發(fā)的力度和效率。本研究設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的50對(duì)SSR引物在兩個(gè)親本BTX623和雜交種遼糯3中進(jìn)行擴(kuò)增，有49對(duì)成功擴(kuò)增出條帶，其中有兩對(duì)引物僅在遼糯3號(hào)中能夠擴(kuò)增，表明很有可能某些基因組區(qū)域在BTX623中是缺失的，僅存在國(guó)內(nèi)某些高粱材料中。50對(duì)引物在這兩個(gè)品種中有多態(tài)性的SSR標(biāo)記為36%，并挑選了SSR標(biāo)記Chr1-1在74份微核心種質(zhì)資源中進(jìn)行分析，初步分析該標(biāo)記在這些種質(zhì)資源中有8種多態(tài)型之多，表明從開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記中容易篩選出多態(tài)性好的標(biāo)記。

本研究開(kāi)發(fā)的SSR分子標(biāo)記是以26份材料中必須至少有兩種多態(tài)型作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。在這些入選的SSR標(biāo)記中，大部分入選的SSR標(biāo)記都是以2個(gè)堿基基序?yàn)橹貜?fù)單元的分子標(biāo)記，3個(gè)以上堿基重復(fù)的達(dá)到6082，26個(gè)品種中多態(tài)性超過(guò)2種的有24441，分布在單拷貝基因上SSR標(biāo)記占總標(biāo)記數(shù)1/4，分布單拷貝基因編碼區(qū)的標(biāo)記占落在單拷貝基因上的12%。這些標(biāo)記類型和特點(diǎn)為高粱基因定位、克隆以及分子育種等分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了可靠的參考數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

利用14個(gè)不育系和12個(gè)恢復(fù)系作為重測(cè)序材料，開(kāi)發(fā)了在26份材料中至少含有2種多態(tài)型的SSR標(biāo)記24441個(gè)單拷貝基因處的多態(tài)性SSR 6733個(gè)。隨機(jī)挑選均勻覆蓋10條染色體的單拷貝基因處SSR標(biāo)記50對(duì)，利用遼寧高粱雜交種遼糯3號(hào)進(jìn)行測(cè)試，其中49對(duì)能擴(kuò)增出產(chǎn)物，成功率高達(dá)98%，利用高粱雜交種遼糯3號(hào)、BTX623和74份微核心種質(zhì)資源測(cè)試表明，50對(duì)SSR標(biāo)記在2個(gè)品種中有18對(duì)表現(xiàn)出多態(tài)性，挑選了一對(duì)引物在74份微核心種質(zhì)中可見(jiàn)8種多態(tài)型。本研究表明利用不育系和恢復(fù)系材料進(jìn)行重測(cè)序能有效開(kāi)發(fā)多態(tài)性高的SSR標(biāo)記。