幾丁質(zhì)脫乙酰酶的研究進展

張巖 關菲菲 伍寧豐 田健

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，保定071000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京100081）

幾丁質(zhì)又名甲殼素、甲殼質(zhì)，是一種由N-乙酰葡糖胺通過β-（1，4）糖苷鍵連接形成的多糖。廣泛分布于海產(chǎn)品蝦、蟹的外殼，真菌和藻類等植物的細胞壁中，同時也是節(jié)肢動物，如大多數(shù)昆蟲的外骨骼的重要組成成分［1］。在自然界中，幾丁質(zhì)是繼纖維素之后的第二大含量豐富的多糖物質(zhì)［2］。該物質(zhì)由Henri Braconnot于1811年首次在真菌中發(fā)現(xiàn)［3］，但該物質(zhì)幾乎不溶于常用溶劑，從而嚴重限制了其商業(yè)應用。幾丁質(zhì)經(jīng)幾丁質(zhì)脫乙酰酶（Chitin deacetylase，CDA）水解可得到易溶于酸的殼聚糖［4］。殼聚糖作為幾丁質(zhì)的衍生物，同屬于大分子多糖聚合物，同時是自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一堿性多糖，具有極大的應用價值和商業(yè)前景。

在工業(yè)上，殼聚糖可用來制備水凝膠、纖維、納米粒子等物質(zhì)；根據(jù)其成膜性則可使紡織材料達到耐水洗、抗皺、抗靜電等效果［5］。在醫(yī)學上，由于其具有較好的生物相容性，生物降解性和無毒性［6］，常被用來制作動脈支架、藥物緩釋微膠囊等材料［7］。作為天然食品添加劑，對肉制品［8］、果蔬制品［9］和海產(chǎn)品［10］等有顯著的保鮮作用。此外，還具有澄清果汁［11］、延緩淀粉老化和增加面包持水性［12］等功效，從而改善食品風味和質(zhì)感。根據(jù)其與金屬離子結(jié)合能力和絮凝作用，可有效處理環(huán)境中的污水，同時易被降解不會造成二次污染［13］。其良好的持水性和成膜性，也使之在化妝品行業(yè)中有一定的應用［14］。

目前工業(yè)生產(chǎn)中主要利用濃堿（40% NaOH）和高溫長時間處理法脫去蝦蟹外殼中幾丁質(zhì)的乙酰基團來制備殼聚糖［15］。該過程不僅會造成濃堿的大量浪費，產(chǎn)生的工業(yè)廢水也會造成嚴重的環(huán)境污染。且該過程不易控制，生成的殼聚糖為脫乙酰度不同的混合物且質(zhì)量不穩(wěn)定。反應過程耗時長、耗能高［16］，增加了生產(chǎn)成本。而利用幾丁質(zhì)脫乙酰酶脫去幾丁質(zhì)的乙?；鶊F是一種綠色高效的、條件可控的方法，該方法具有高度特異性，可定向得到所需降解產(chǎn)物，避免意外降解底物糖鏈的其它基團［17］。

幾丁質(zhì)脫乙酰酶是指能夠脫去底物上乙酰基團的酶，目前研究的脫乙酰酶的主要作用底物有幾丁質(zhì)、殼聚糖、殼寡糖等，底物不同，酶的種類，作用方式往往不同。本文通過搜集已發(fā)表的包括真菌、細菌及動物等來源的脫乙酰酶基因序列，通過NCBI網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）進行BLAST分析，對含有特定CE4超家族、spore_pdaA超家族、uraD_N-term-dom超家族結(jié)構(gòu)域序列的酶進行歸納。下面將從這一類酶的催化機制，反應條件，金屬離子的影響等方面進行闡述。

1 幾丁質(zhì)脫乙酰酶的催化機制

1.1 CE4超家族

CAZy數(shù)據(jù)庫（http：//www.cazy.org/）中的碳水化合物脂酶4（Carbohydrate esterase 4，CE4）超家族，主要包括幾丁質(zhì)脫乙酰酶，細菌肽聚糖N-乙酰葡糖氨脫乙酰酶以及木聚糖脫乙酰酶等，這類酶可以移除乙?；鶊F從而將N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）轉(zhuǎn)變?yōu)榘被咸烟牵℅lcN），該家族成員一般包含NodB同源結(jié)構(gòu)域和His-His-Asp金屬離子結(jié)合三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，屬于利用酸堿催化的金屬酶［18］。

1.1.1 CE4超家族水解底物特性 近年來，關于該類幾丁質(zhì)脫乙酰酶的研究主要集中在其底物的識別特性。2017年，挪威生命科學大學Liu等［19］從Aspergillus nidulansFGSC A4中鑒定出一種幾丁質(zhì)脫乙酰酶AnCDA（GenBank EAA66447），該酶對（GlcNAc）2有單端脫乙酰作用，對（GlcNAc）3-6則具有完全脫乙酰作用，對α-幾丁質(zhì)、β-幾丁質(zhì)也有一定活性，但對于GlcNAc無活性。同年，日本大學Hirano等［20］從Shewanella balticaATCC BAA-1091 中篩選出的SbCODs（GenBank ABN60929.1），與AnCDA具有相似的催化機制，即SbCODs對（GlcNAc）2的還原端進行脫乙酰反應，形成GlcNAc-GlcN，對GlcNAc無活性，但對（GlcNAc）3-4均有脫乙?；钚?。另外來自于真菌灰蓋鬼傘（Coprinopsis cinerea）的幾丁質(zhì)脫乙酰酶CDA1（GenBank EAU83261.2）和CDA2（GenBank EAU83234.2）［21］也對 GlcNAc均無反應，對（GlcNAc）2和40%的脫乙酰殼聚糖有一定的脫乙酰作用，且當幾丁質(zhì)粉末和膠體幾丁質(zhì)作為底物時無酶活。但這兩種酶對乙二醇幾丁質(zhì)（Glycol chitin）均有較高酶活。海洋節(jié)細菌屬（Arthrobacter）的幾丁質(zhì)脫乙酰酶ArCE4A（GenBank LT630322）［22］對 GlcNAc、（GlcNAc）2、α-幾丁質(zhì)和 β-幾丁質(zhì)幾乎無活性，但對部分乙酰化的殼聚糖有一定的脫乙?；钚?，且對乙酰木聚糖具有較高活性，脫乙酰度可達18.9%。同樣，來自Pestalotiopsissp.的幾丁質(zhì)脫乙酰酶 PesCDA（GenBank KY024221）［23］對膠體幾丁質(zhì)有輕微的脫乙酰作用，且該酶脫乙酰效果隨著底物乙酰度的增加而增加。當以（GlcNAc）2-6作為底物進行脫乙酰反應時發(fā)現(xiàn)，該酶對于（GlcNAc）n（n＞3）時存在脫乙酰效果，但最終產(chǎn)物仍會保留3個乙?；鶊F。與之相同的的是，根霉菌Rhizopus circinans分泌的幾丁質(zhì)脫乙酰酶RcCDA（GenBank EU086737）［24］，也僅對聚合度≥3的低聚物具有脫乙酰活性，這也與其它毛霉菌來源的脫乙酰酶相符。

然而與上述幾種酶都不同的是，來自于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的幾丁質(zhì)脫乙酰酶ScCDA2［25］除了可作用于（GlcNAc）2-6外，還可對膠質(zhì)幾丁質(zhì)、α-幾丁質(zhì)和β-幾丁質(zhì)3種均產(chǎn)生一定的脫乙酰作用。

來 源 于Vibrio Cholerae的VcCOD（GenBank WP_130350642）［26］通過對底物（GlcNAc）1-6測試發(fā)現(xiàn)該酶不能脫去GlcNAc中的乙?；鶊F，底物為（GlcNAc）2時表現(xiàn)出最大酶活，且酶活隨著鏈長的增加酶活逐漸降低。同樣，Pacheco等［27］通過對來自膠孢炭疽菌的幾丁質(zhì)脫乙酰酶研究發(fā)現(xiàn)，通過降低底物鏈長有助于脫乙酰反應，另外在酸性介質(zhì)中提高溶解度和降低底物結(jié)晶度有促進脫乙酰效果。但ArCE4A在底物（GlcNAc）3-5中卻隨著聚合度的增加呈現(xiàn)酶活遞增趨勢，這與上述兩種酶對糖鏈長度的偏好完全相反。

柄孢霉（Podospora anserina）中含有一種具有兩個幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Chitin binding domain，CBD）的幾丁質(zhì)脫乙酰酶PaCDA（GenBank CAP60162），Hossbach等［28］通過研究去除一個或全部幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的PaCDA發(fā)現(xiàn)，不溶于水的膠質(zhì)殼五糖作為底物時含有CBDs的PaCDA比完全刪除該結(jié)構(gòu)域的PaCDA有更好的脫乙酰效果。表明CBDs有助于酶與不溶的底物進行反應。此外，該酶易作用于高度乙酰化的殼聚糖高聚物，但無法使底物完全脫乙?；?/p>

1.1.2 CE4超家族結(jié)構(gòu)信息 通過對上述CE4超家族的CDA酶進行氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)，該家族的酶在His-His-Asp三連體結(jié)構(gòu)上顯示出高度保守性，并均含有H-D催化活性部位。此外，每個CDA均含有CE4超家族保守基序motif（1-5）（圖1）。由此可見，今后在進行新酶鑒定和分子改造時可加強對這些區(qū)域的對比與研究。

此外，通過使用SWISS-MODEL［29-33］對CDA1、CDA2、PesCDA、PaCDA進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)同源建模，再進一步利用PyMOL（www.pymol.org）進行三級結(jié)構(gòu)比對發(fā)現(xiàn)，這幾種酶的三級結(jié)構(gòu)均有較高的吻合度。通過AnCDA的晶體結(jié)構(gòu)與RcCDA同源建模的結(jié)果進行對比發(fā)現(xiàn)，雖然序列相似性不高，但其結(jié)構(gòu)相似性很高。同時，這幾種酶的三級結(jié)構(gòu)分析也揭示了這幾種酶均含有該家族所特有的（α/β）8折疊桶結(jié)構(gòu)和6個loop區(qū)（圖2）。

圖1 蛋白序列同源性及活性位點分析

圖2 CE4超家族脫乙酰酶蛋白同源結(jié)構(gòu)模型

1.2 spore_pdaA 超家族

1.2.1 spore_pdaA 超家族水解底物特性 spore_pdaA超家族是多糖脫乙酰酶中的一個超家族。該家族的酶主要存在于細菌孢子壁上，主要作用于N-乙酰肽聚糖和幾丁寡糖。PdaA是枯草芽孢桿菌中的一種脫乙酰酶，該酶與CE4家族的NodB結(jié)構(gòu)域有較高同源性，對于該酶的報道多集中于N-乙酰胞壁酸的脫乙酰作用，其最適反應pH值為7.0，對于幾丁質(zhì)的脫乙酰作用較少，但其與CE4家族較高的同源性也使其作為今后CDA潛在研究對象［34］。

1.2.2 spore_pdaA 超家族結(jié)構(gòu)信息 通過蛋白表面凹陷中的保守殘基推斷該家族蛋白含有一個與β/α桶狀結(jié)構(gòu)相關的折疊，與CE4家族相比，其蛋白表面凹陷中特有的Lys和兩個Arg殘基提供的陽離子也使其能夠更好地結(jié)合聚合度低于3的N-乙酰氨基葡萄糖低聚物。通過已報道的X-射線觀測和電子云密度可知GlcNAc與該酶結(jié)合時會將一些水分子從活性部位替換出來，同時根據(jù)蛋白與底物N-乙酰氨基葡萄糖的結(jié)合特點，揭露了其與CE4家族相似的Asp和其它His殘基的催化作用（圖3）［34-35］。

1.3 uraD_N-term-dom 超家族

1.3.1 uraD_N-term-dom 超家族水解底物特性 uraD是一種尿酸鹽分解代謝蛋白，參與尿囊酸鹽分解形成尿囊酸反應的最后一步，且通過序列比對發(fā)現(xiàn)該類蛋白與幾丁質(zhì)脫乙酰酶家族具有同源性。

通過海洋基因組文庫篩選出的幾丁質(zhì)脫乙酰酶rCdaYJ［36］，通過生信分析發(fā)現(xiàn)該酶屬于uraD_N-term-dom超家族。進一步實驗發(fā)現(xiàn)該酶可脫去對硝基乙酰苯胺上的乙?；鶊F，但是目前未發(fā)現(xiàn)該家族酶蛋白能水解幾丁質(zhì)中的乙?；鶊F。

圖3 spore_pdaA超家族蛋白表面氨基酸殘基分析

1.3.2 uraD_N-term-dom 超家族結(jié)構(gòu)信息 通過對uraD家族puuE蛋白與CE4家族多種酶對比研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)抑制劑復合物的晶體結(jié)構(gòu)與多糖脫乙酰酶β/α桶狀結(jié)構(gòu)具有總體相似性（圖4），但在低聚物結(jié)合和活性部位幾何結(jié)構(gòu)上存在顯著差異。例如，存在于CE4家族中的His-His-Asp金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)在puuE中被Glu-His-Trp代替，此外，uraD家族在CE4家族第一個β/α桶狀結(jié)構(gòu)前多折疊的一個該結(jié)構(gòu)為其結(jié)合小分子底物提供便利［37］。

圖4 uraD_N-term-dom超家族puuE蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

2 最適溫度與pH值

本文中提及的幾丁質(zhì)脫乙酰酶多數(shù)在50℃左右達到最大酶活。例如，AnCDA、ScCDA2、HcCDA2［38］三者最適溫度均為 50℃。而 SbCODs、VcCOD兩種酶的最適溫度稍低，分別為40℃、45℃。PesCDA、CDA2、CDA1則有較高最適反應溫度，分別為55、60和70℃。

此外，對于pH值而言，多數(shù)酶偏愛弱堿性環(huán)境。如AnCDA、SbCODs、PesCDA、ScCDA2和HcCDA2 5種酶的最適pH值均為8.0。此外，CDA1、CDA2最適pH值分別為7.5、9.0，VcCOD根據(jù)不同體系的緩沖溶液，其pH值在7.0-7.5之間。但是RcCDA卻在偏酸性的環(huán)境中發(fā)揮最大活性，其最適pH值為 5.5-6.0。其中 AnCDA、ScCDA2、HcCDA2三種酶有著相同的最適溫度和pH值。

除了CE4家族的脫乙酰酶外，分別來自spore_pdaA 家族和uraD超家族的PdaA和rCdaYJ的最適pH值分別為7.0和7.4。其中rCdaYJ最適溫度僅為28℃，這可能是因為rCdaYJ是海洋基因組文庫來源的酶，與其所處環(huán)境有關。

3 金屬離子催化作用

某些情況下金屬離子的催化作用對于酶發(fā)揮活性具有非常重要的作用，但是不同的酶對于金屬離子的反應不同。較為常見的起促進作用的金屬離子是 Co2+， 如 AnCDA、CDA2、ScCDA2、HcCDA2以及毛柄金錢菌（Flammulina velutipes）來源的脫乙酰酶均在Co2+存在的體系中表現(xiàn)為酶活提高，但是VcCOD、CDA1表現(xiàn)出截然相反的現(xiàn)象，Co2+對這兩個酶有抑制作用，盡管CDA1與CDA2來源于同一生物體。此外，在有些酶中Mn2+、Mg2+也可起到酶活促進作用。而Cu2+、Zn2+則在部分酶中展現(xiàn)出酶活抑制作用。有趣的是，ScCDA2結(jié)構(gòu)上存在鋅離子結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域，但在Co2+離子存在時展現(xiàn)出最大活力。

4 脫乙酰機制

目前針對脫乙酰酶的研究中脫乙酰機制研究是一個重點方向，然而就當前研究而言，眾多脫乙酰酶在脫乙?；^程中有著不盡相同的脫乙酰產(chǎn)物，且沒有標準的脫乙酰路徑。目前，脫乙酰反應中幾乎所有酶唯一一致的方面就是均從非還原末端開始對幾丁寡糖進行脫乙酰反應。但對于水解幾丁二糖，一般生成GlcNAc-GlcN。對于除單糖、二糖之外的N-乙酰低聚糖，不同的酶會與糖鏈上不同位置的N-乙?；l(fā)生水解反應。如對于N-乙酰四糖，PesCDA僅能將其水解為AADA（A代表GlcNAc，D代表GlcN），同樣的VcCOD也僅能將N-乙酰四糖脫去單個乙?；罱K生成ADAA單一產(chǎn)物，而SCCDA2則可通過三步水解反應在第一次生成DAAA、ADAA和AADA的基礎上，進一步水解產(chǎn)生 DDAA、DADA和ADDA，最終得到DDDA。

5 總結(jié)與展望

幾丁質(zhì)脫乙酰酶主要來源于真菌和海洋生物，其最適溫度范圍為40-70℃，最適溫度集中在50℃左右，是一類可耐受較高溫度的酶。這類酶的最適pH值集中在8.0附近，最適pH值范圍為5.5-9.0，大多數(shù)酶在堿性條件下活性較高。而Co2+則是最常見的增強酶活的金屬離子，且多數(shù)酶均容易受到金屬離子的影響。在底物識別方面，幾乎均無法使GlcNAc脫除乙酰基，少數(shù)酶可脫去（GlcNAc）2非還原端的乙?；鶊F，大多數(shù)酶易識別（GlcNAc）3-6，而α-幾丁質(zhì)和β-幾丁質(zhì)等難溶于水的高聚合度多糖，由于其疏水性導致多數(shù)酶無法對其產(chǎn)生酶活反應，詳見表1。

自然環(huán)境中的微生物資源豐富，蘊藏著巨大的基因資源，如Whitman等［39］認為土壤、海底淤泥及地表下微生物豐度分別為2.6×1029、3.5×1030及（0.25-2.5）×1030，這些微生物中約有99%是未培養(yǎng)微生物，其中可能包含了很多具有綜合性質(zhì)優(yōu)良的未知酶蛋白。隨著宏基因組學和基因測序技術的發(fā)展，目前已有大量的來源于不同自然環(huán)境的宏基因組數(shù)據(jù)可在EBI metagenomics、iMicrobe、IMG/M等公開基因組數(shù)據(jù)庫中下載。如利用hmmsearch從CAM_PROJ_GOS單個宏基因組數(shù)據(jù)集中就可檢索到3423條幾丁質(zhì)脫乙酰酶的基因（E-value值小于0.0001）。這些數(shù)據(jù)也表明了在宏基因數(shù)據(jù)庫中蘊藏了大量的基因資源，而這些基因資源“大數(shù)據(jù)”將是未來幾年分子生物學研究的熱點。

隨著節(jié)能、環(huán)保、高效的工業(yè)生產(chǎn)理念深入人心，高效脫除幾丁質(zhì)中乙酰基團的酶制劑必定被市場需求。目前國內(nèi)外研究中幾丁質(zhì)脫乙酰酶主要來源于真菌，而海洋生物中蝦蟹類生物含有大量幾丁質(zhì)及殼聚糖，因此在海洋基因組文庫中篩選脫乙酰酶，目的性更強，更具有針對性。另外該酶目前主要存在對多糖的脫乙酰度較低，對于晶體幾丁質(zhì)等疏水性多糖難以發(fā)揮作用等不足之處，故今后應加強在脫乙酰酶分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域上進行分析改造，并加強構(gòu)建穩(wěn)定高效的工程菌株從而彌補真菌等生物體自身表達量偏低的缺陷。目前國內(nèi)外部分機構(gòu)已檢測到某些幾丁質(zhì)脫乙酰酶可定點脫去特定位置的乙?；鶊F，但這種現(xiàn)象的發(fā)生機理卻尚不明確，進一步對幾丁質(zhì)脫乙酰酶水解機理的研究將有助于定向獲得目的脫乙酰產(chǎn)物。我國每年有大量的蝦蟹外殼等物質(zhì)被直接廢棄，開發(fā)幾丁質(zhì)脫乙酰酶對廢棄物二次利用具有極高的價值，隨著對幾丁質(zhì)脫乙酰酶的深入研究，今后必定可通過多種生物原料開發(fā)出高質(zhì)量的殼聚糖副產(chǎn)物。

表1 幾丁質(zhì)脫乙酰酶研究概況