腺苷酸活化蛋白激酶在纖維化發(fā)生中的作用*

李淑嫻， 賈 強， 于功昌△， 邵 華△

[1濟南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 2山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院， 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)， 山東 濟南 250062]

[中圖分類號]R363; R364.5[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2019.11.028

1 AMPK的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)作用

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)被認為是調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)和代謝應(yīng)激反應(yīng)的能量傳感器，是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，由調(diào)節(jié)性β(β1和β2)和γ(γ1、γ2和γ3)亞單位以及催化性α(α1和α2)亞單位組成[1]，其中α亞基含有催化核心的N端激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain，KD)，Thr172 位點的磷酸化可使AMPK活性增加超過100倍，被認為是AMPK活化的標志。C末端結(jié)合β、γ亞基并含有重要的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，即當(dāng)AMP水平下降時，可以抑制AMPK活化的自身抑制結(jié)構(gòu)域(autoinhibitory domain，AID)和富含絲氨酸/蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域“ST環(huán)”(ST-loop)[2-3]；β亞基的N端有碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding module，CBM)將AMPK固定在細胞膜上，而N端區(qū)域之后緊跟著α、γ結(jié)合區(qū)域[4],因此，β 亞基相當(dāng)于1個與 α 和 γ 亞基結(jié)合的支架，使AMPK形成穩(wěn)定的異源三聚體[5];γ亞基的N末端包含4個串聯(lián)的胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS)重復(fù)序列，形成2個可以結(jié)合AMP或ATP分子的Bateman結(jié)構(gòu)域[6]。 AMPK 3個亞基的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。目前認為AMPK的激活方式主要有以下3種：(1)AMP/ATP相關(guān)的變構(gòu)調(diào)節(jié)機制：AMP通過連接到 γ 亞基變構(gòu)激活A(yù)MPK[7]；(2)AMPK活性的自調(diào)節(jié)：AMPK復(fù)合物的 α 亞基C端含有自抑制序列，能夠抑制AMPK的激活；(3)AMPK激酶激活：主要有鈣離子/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶β(calcium/calmodulin-dependent protein kinase β， CaMKK-β)、轉(zhuǎn)化生長因子β激活蛋白激酶1(transforming growth factor beta-activated protein kinase 1，TAK1)和肝激酶 B1(liver kinase B1，LKB1)[8]。當(dāng)細胞內(nèi)能量缺失時AMPK被激活，激活后的AMPK通過減少ATP消耗途徑和增加ATP的代謝途徑來維持能量代謝平衡，從而使體內(nèi)ATP的總量增加或比例增加[9]。然而，AMPK不僅能調(diào)節(jié)能量代謝，還有促進自噬、誘導(dǎo)凋亡、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和抗炎癥等作用。

Figure 1.The structure of the 3 subunits of AMPK. AID: autoinhibitory domain; CBM: carbohydrate-binding module; CBS: cystathionine β-synthase.

圖1 AMPK的3種亞基結(jié)構(gòu)示意圖

2 AMPK與炎癥反應(yīng)

纖維化發(fā)生過程是一個復(fù)雜的病理生理學(xué)過程。首先，損傷刺激觸發(fā)免疫細胞的快速募集，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量促炎細胞因子和生長因子，然后炎癥細胞因子激活效應(yīng)細胞并促進其增殖，觸發(fā)肌成纖維細胞的活化[10-11]。在誘導(dǎo)纖維化的因素中，Th2細胞釋放與纖維化發(fā)展相關(guān)的白細胞介素4 (interleukin-4, IL-4)、IL-5和IL-13。IL-13具有致炎和免疫調(diào)節(jié)的作用，可以作用于成纖維細胞表面IL-4R/IL-13Rα1而激活成纖維細胞，并在特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的發(fā)生、發(fā)展中通過促進巨噬細胞的激活從而在促纖維化過程中發(fā)揮重要作用[12-13]。單核細胞和巨噬細胞在組織重塑和纖維化中起著至關(guān)重要的作用，巨噬細胞來源的轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)誘導(dǎo)成纖維細胞遷移，促進成纖維細胞生長、活化和膠原合成[14]。大量證據(jù)表明，AMPK在炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病及肺損傷模型大鼠中，多種藥物通過激活A(yù)MPK途徑減少或降低炎癥因子[如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和IL-6]并減少炎癥細胞數(shù)量以減輕肺部炎癥反應(yīng)[15]。TGF-β是肝臟炎癥損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，AMPK可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的纖維化。Lim等[16]用TGF-β處理人(LX-2)和大鼠(CFSC-2G)肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)，發(fā)現(xiàn)AMPK減弱TGF-β誘導(dǎo)的與轉(zhuǎn)錄輔激活劑p300的Sd3相互作用，并改善纖維化激活。慢性炎癥和纖維化是Duchenne肌營養(yǎng)不良癥的特征，AMPK的激活可以抑制促炎巨噬細胞ltbp4的表達，從而導(dǎo)致TGF-β1分泌減少，刺激促炎巨噬細胞向抗炎狀態(tài)的轉(zhuǎn)移，減輕病變部位纖維化程度[17]。AMPK的抗炎作用多伴隨著轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制，活化的AMPK主要通過下游蛋白如沉默交配型信息調(diào)節(jié)物2同系物1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)、叉頭盒O3a(forkhead box O3a，F(xiàn)oxO3a)、p53、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α)等間接抑制NF-κB活性，并降低炎性因子表達[18]。由此可知，AMPK可通過抑制巨噬細胞來源的TGF-β的分泌，也可通過間接調(diào)節(jié) NF-κB活性和抑制炎性因子表達來減輕纖維化。

3 AMPK與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)

EMT在胚胎發(fā)育、傷口愈合、組織再生、腫瘤進展和器官纖維化等多種生物過程中起關(guān)鍵作用[19]。EMT的特征是細胞間接觸喪失、基底膜的破壞、蛋白質(zhì)(如E-鈣黏蛋白)的喪失、細胞骨架的重組，以及獲得新的間充質(zhì)標志物[如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、波形蛋白、I型膠原蛋白和纖連蛋白]而轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形形態(tài)[20]。隨著對纖維化機制研究的深入，近年來發(fā)現(xiàn)腎、肝、肺、眼和其它器官的纖維化都有EMT的發(fā)生[21]。TGF-β、表皮生長因子(epidermal growth factor， EGF)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平的變化會影響正常和異常情況下的組織穩(wěn)態(tài)，觸發(fā)EMT和進行性纖維化[22]。眾所周知，TGF-β調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和IL-6，在EMT中起重要作用。AMPK通過抑制Smad2/3磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性來抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT標志物的表達，因此，AMPK激活可抑制TGF-β調(diào)節(jié)的EMT[23]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)被認為是AMPK的下游靶點。Dong等[24]研究表明，二甲雙胍和白藜蘆醇可以通過激AMPK/mTOR信號來緩解細胞衰老和EMT。AMPK通過直接磷酸化mTORC1受體(mTOR的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白)來抑制mTORC1的活性，從而調(diào)節(jié)自噬，進而逆轉(zhuǎn)EMT[25]。綜上所述，AMPK主要是通過抑制mTOR活性以及抑制TGF-β而阻止EMT進程，從而抑制纖維化發(fā)生發(fā)展。

4 AMPK與細胞外基質(zhì)

纖維化的特征是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成增加，降解相對不足，隨著纖維化進展，組織成分發(fā)生變化，如α-SMA和波形蛋白表達增加，E-鈣黏蛋白丟失[19]。不同病因的損傷會導(dǎo)致復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，包括多種細胞類型和分子信號，導(dǎo)致ECM的過度積累，從而導(dǎo)致纖維化[26]。目前普遍認為，器官纖維化的發(fā)生機制與TGF-β的過表達導(dǎo)致ECM過度沉積且降解不足密切相關(guān)[27]。TGF-β1可通過激活經(jīng)典Smad途徑和非Smad的信號途徑誘導(dǎo)腎纖維化，從而導(dǎo)致肌成纖維細胞的活化，ECM的過量產(chǎn)生和降解抑制[28]。心臟纖維化的特征是間質(zhì)成纖維細胞增殖以及包括膠原和纖連蛋白在內(nèi)的心肌ECM的過度產(chǎn)生和沉積。最近的一項研究揭示了激活A(yù)MPK可以通過調(diào)節(jié)TGF-β介導(dǎo)的Smad3依賴轉(zhuǎn)錄來抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心臟纖維化[29]。另外，增強自噬也可以減少ECM沉積。Patel等[30]發(fā)現(xiàn)沉默自噬相關(guān)基因LC3-B和beclin-1后，α-SMA和纖連蛋白等肌成纖維細胞標志物表達明顯增多，說明抑制自噬能促進肌成纖維細胞增殖和ECM沉積。研究表明，AMPK激活可以通過增強自噬，同時下調(diào)ECM蛋白的穩(wěn)態(tài)水平，從而重新編程IPF成纖維細胞的代謝[31]。因此，AMPK可通過調(diào)節(jié)TGF-β以及增強自噬，從而減少ECM沉積，調(diào)節(jié)纖維化。

5 AMPK與肌成纖維細胞

肌成纖維細胞是肺纖維化的發(fā)病機制和進展過程中細胞外基質(zhì)的主要來源，兼具成纖維細胞和平滑肌細胞的特性。研究發(fā)現(xiàn)，在肺纖維化的發(fā)病機制中，肌成纖維細胞的凋亡受到抑制，導(dǎo)致纖維化進行性發(fā)展[32]。在各種促纖維化細胞因子中，TGF-β是已知的最有效的肌成纖維細胞分化誘導(dǎo)劑[33]。在IPF中誘導(dǎo)的肌成纖維細胞分化表現(xiàn)為肺成纖維細胞中I型膠原和α-SMA表達水平的增加[31]?，F(xiàn)已經(jīng)證明，TGF-β1和Smads被認為是腎纖維化的治療靶點[34]。TGF-β1激活下游Smads信號傳導(dǎo)，使Smad2/3復(fù)合物磷酸化并將細胞溶質(zhì)Smad4轉(zhuǎn)運到細胞核中以調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)基因表達，重組細胞骨架成分，誘導(dǎo)向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化[35]。除了典型的TGF-β/Smads途徑之外，TGF-β1還通過非Smad信號途徑誘導(dǎo)肌成纖維細胞活化和腎纖維化,包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(AKT)和小GTP酶途徑等[36]。實驗證明，TGF-β誘導(dǎo)的肌成纖維細胞分化能夠被二甲雙胍通過活化AMPK介導(dǎo)的機制有效抑制[37]。在心臟成纖維細胞中，TGF-β1是損傷后成纖維細胞活化/分化的主要決定因素，AMPK激活可以抑制TGF-β介導(dǎo)的肌成纖維細胞的分化[38]。因此，AMPK激活可通過抑制TGF-β/Smads途徑，抑制肌成纖維細胞凋亡，從而減弱纖維化。

6 AMPK與纖維化的治療

有許多藥物包括阿卡地新、二甲雙胍、白藜蘆醇、他汀類藥物和小檗堿等通過對AMPK的激活減輕纖維化。AMPK激活劑如5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-aminoimidazole-4-carbox-amide-1-β-D-ribofuranoside，AICAR)在肝纖維化動物模型中顯示抗纖維化作用[39]。體外實驗表明，AICAR處理后，原代大鼠HSC中TGF-β、α-SMA和I型膠原蛋白的基因表達水平顯著降低[40]。AICAR可以通過被腺苷轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運進入細胞，在細胞內(nèi)被腺苷激酶酸化生成AMP類似物——ZMP而激活A(yù)MPK[41]。二甲雙胍是一種用于治療Ⅱ型糖尿病的藥物，可抑制TGF-β1的產(chǎn)生，并通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體I和ATP的合成激活A(yù)MPK抑制心臟纖維化[42]。二甲雙胍治療還能抑制纖維化發(fā)生相關(guān)蛋白的表達，降低Smad2/3和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2的磷酸化[43]。白藜蘆醇是一種多酚,具有有效的抗氧化和抗腫瘤活性以及對神經(jīng)系統(tǒng)的重要保護作用。最近Lan等[44]證明白藜蘆醇通過至少2種機制激活A(yù)MPK。其一為抑制ATP合成，其二為Sirt1-LKB1激活的能量依賴機制。另外，他汀類藥物也被證明可以用來治療纖維化。Reichert等[45]實驗證明他汀類藥物減輕了大鼠心肌梗死后的纖維化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。因此，AMPK激活劑對減輕纖維化發(fā)揮著重要的作用，AMPK可能會成為一種治療纖維化的有希望的藥物靶點。

7 總結(jié)與展望

綜上所述，AMPK可以通過抑制TGF-β分泌、調(diào)節(jié)NF-κB活性和抑制炎性因子發(fā)揮抗炎作用；通過抑制mTOR活性以及抑制TGF-β阻止EMT進程；調(diào)節(jié)TGF-β以及增強自噬，從而減少ECM的沉積；通過抑制TGF-β/Smads途徑抑制肌成纖維細胞分化，減弱纖維化。應(yīng)用AMPK激活劑可以有效控制纖維化。AMPK有望成為纖維化新的治療靶點。這為治療纖維化提供了新的方向。然而，AMPK的具體抗纖維化作用機制尚未完全探索清楚，關(guān)于AMPK抗纖維化的下游靶蛋白并未完全明確。動物和細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)AMPK激活劑可以對纖維化產(chǎn)生作用，但是，在臨床上是否可以治療纖維化還需進一步驗證。因此，進一步探究AMPK的具體抗纖維化機制，明確下游靶蛋白，驗證AMPK激活劑是否能治療纖維化，對于減輕及治療纖維化有重要意義。