姜黃素對(duì)ERS誘導(dǎo)NASH大鼠肝細(xì)胞保護(hù)作用的研究*

李 敏， 黃婷婷， 姜雙燕， 楊 洋， 陳莎莎， 張文佳， 趙麗娟

(1錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院， 遼寧 錦州 121001; 2燕達(dá)醫(yī)院消化內(nèi)科， 北京 101601;3錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化科， 遼寧 錦州 121000)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver di-sease，NAFLD)是全球最常見的慢性肝病之一，成人患病率介于6.3%～45%，其中10%～30%可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)[1]。NASH是全球范圍內(nèi)較為嚴(yán)重的一種NAFLD病理類型[2]，發(fā)展成為肝纖維化、肝硬化等的風(fēng)險(xiǎn)性大。Herbert等[3]提出的“多重平行打擊”認(rèn)為NASH是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，較為準(zhǔn)確地解釋了NASH的發(fā)病機(jī)制，提出包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、細(xì)胞凋亡、自噬、相關(guān)脂肪因子紊亂和腸道菌群因素等在內(nèi)的多種因素參與了其發(fā)病過程。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種跨膜蛋白，隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤及非折疊蛋白量的積累，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)從PERK上脫離下來，大量PERK通過自身磷酸化被激活，空出的GRP78過表達(dá)還會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)PERK的激活[4]。激活的PERK使得真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α,eIF-2α)第51位的絲氨酸磷酸化，使其磷酸化而被激活[5-7]。正常情況下，eIF-2α無磷酸化，活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4, ATF4)上游5’端存在抑制ATF4翻譯的特定區(qū)域；只有當(dāng)eIF-2α磷酸化時(shí)才可直接翻譯ATF4。ATF4下游是轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白[CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein, CHOP]，是ERS引發(fā)凋亡的信號(hào)。研究表明NASH的發(fā)病過程中，大量的游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并通過PERK-eIF-2α-ATF4-CHOP通路導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死[8],這條通路中GRP78和CHOP被認(rèn)為是其中重要的標(biāo)志性信號(hào)[9]。

由于NASH發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，臨床至今仍缺乏針對(duì)其發(fā)病機(jī)制的藥物。研究表明，姜黃素(curcumin)能抑制肝細(xì)胞凋亡來減輕肝臟損傷[10]，同時(shí)過度的ERS參與了肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生[9]。目前姜黃素的肝臟保護(hù)作用是否與ERS有關(guān)鮮有報(bào)道[11]。本項(xiàng)工作主要通過分子生物學(xué)的方法，探討姜黃素對(duì)ERS誘導(dǎo)的NASH大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用是否與抑制ERS中的PERK通路有關(guān)，為臨床上NASH的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

選取SPF級(jí)6周齡SD雄性大鼠30只，體重(200±10) g，購自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(遼)2017-0003。

2 主要試劑

普通飼料：由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；高脂食物組成：79.5%玉米面(糧食雜貨店)+0.5%膽固醇(河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：2017031625)+20%豬油(糧食雜貨店)；姜黃素(上海瑞永生物科技有限公司)；甲醛溶液(沈陽天罡化學(xué)試劑廠)；抗GRP78和CHOP抗體(沈陽萬類生物有限公司)；PVDF膜(Millipore)；SDS-PAGE凝膠(武漢博士德生物有限公司)。

3 主要方法

3.1建立模型 30只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為3組，分別為正常對(duì)照(normal control)組(n=10)、模型(model)組(n=10)及姜黃素(curcumin)組(n=10)。各組均行普通飼料喂養(yǎng)，模型組與姜黃素組在普通飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上予高脂食物(3 ml·kg-1·d-1)灌胃4周，正常組予等量生理鹽水灌胃，喂養(yǎng)4周后，每組隨機(jī)處死2只大鼠，留取血液行肝功能檢測(cè)、肝組織行病理學(xué)檢測(cè)。觀察到模型組及姜黃素組大鼠丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine ami-notransferase, ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate ami-notransferase, AST)較正常對(duì)照組顯著升高，同時(shí)，光鏡下可見明顯肝細(xì)胞脂肪變性及大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，造模成功[11]。

3.2藥物干預(yù) 從第5周開始，在喂養(yǎng)方法不變基礎(chǔ)上，姜黃素組給予姜黃素灌胃，給藥劑量為200 mg·kg-1·d-1，模型組與正常對(duì)照組予等量生理鹽水灌胃，灌胃4周，第8周末結(jié)束實(shí)驗(yàn)。稱重，禁食12 h后麻醉，解剖，采心臟血，檢測(cè)ALT和AST；迅速取出肝臟并稱重，取部分肝臟組織制作石蠟切片，另一部分肝臟組織至于-80 ℃冰箱中用于制作肝組織勻漿。

3.3檢測(cè)方法 (1)生化檢測(cè)：全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)ALT和AST水平；(2)病理組織學(xué)：制作石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀察肝臟脂肪變性及炎癥程度；(3)Western blot檢測(cè)：精確稱取相同部位的肝臟組織300 mg，制備肝組織勻漿，檢測(cè)GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)；(4)TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：按試劑盒說明書操作。細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示，計(jì)數(shù)資料比較經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病理形態(tài)學(xué)結(jié)果用對(duì)比描述方法分析。

結(jié) 果

1 各組大鼠血生化相關(guān)指標(biāo)(ALT和AST)變化

第4周末，模型組和姜黃素組分別與正常對(duì)照組對(duì)比，大鼠血清ALT和AST均升高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清ALT和AST顯著升高，姜黃素組大鼠血清ALT和AST與模型組比較顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 肝功指標(biāo)的變化

*P<0.05，**P<0.05vsnormal control group；#P<0.05，##P<0.05vsmodel group.

2 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化

第4周末，模型組和姜黃素組大鼠較正常對(duì)照組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見脂肪滴，炎癥細(xì)胞明顯增多，結(jié)合生化指標(biāo)結(jié)果，提示造模成功，見圖1；第8周末，正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，肝細(xì)胞大小、形態(tài)規(guī)則；模型組大鼠肝小葉邊界模糊，肝索排列紊亂，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞體積明顯增大，胞質(zhì)內(nèi)可見大泡性脂肪滴；姜黃素組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性及炎性程度均明顯減輕，未見明顯壞死灶，見圖2。

Figure 1.Pathological results for rat liver at the end of the 4th week (HE staining). A: normal control group; B: model group. Red arrow: fat drop; black arrow: inflammatory cell infiltration.

圖1 第4周末各組大鼠肝臟病理學(xué)結(jié)果

Figure 2.Pathological results for rat liver at the end of the 8th week (HE staining). A: normal control group; B: model group; C: curcumin group. Red arrow: fat drop; black arrow: inflammatory cell infiltration.

圖2 第8周末各組大鼠肝臟病理學(xué)結(jié)果

3 各組大鼠肝組織相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)肝組織ERS相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)，得到相應(yīng)條帶，可見：模型組較正常對(duì)照組GRP78和CHOP表達(dá)顯著上調(diào)，姜黃素組較模型組CRP78和CHOP表達(dá)顯著下調(diào) (P<0.01)，見圖3。

Figure 3. The expression levels of GRP78 and CHOP in liver tissues of rats in each group. Mean±SD.n=8.##P<0.01vsnormal control group;**P<0.05vsmodel group.

圖3 各組大鼠CRP78和CHOP的表達(dá)變化

4 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡情況

正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞可見極少凋亡細(xì)胞，模型組凋亡細(xì)胞增多；姜黃素組大鼠的凋亡肝細(xì)胞較模型組減少，見圖4。

討 論

NASH的發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，被廣泛接受的是“二次打擊”學(xué)說，即脂類在肝細(xì)胞沉積為第1次打擊過程，由此引發(fā)的一系列細(xì)胞毒性反應(yīng)為第2次打擊[12-13]，進(jìn)一步導(dǎo)致肝臟損傷。目前研究表明，NASH的發(fā)病過程是多因素共同作用的結(jié)果，過度的ERS能造成肝細(xì)胞功能失調(diào)，誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]，而肝細(xì)胞凋亡可被游離脂肪酸誘導(dǎo)引起脂肪代謝紊亂并進(jìn)一步誘發(fā)ERS，最終導(dǎo)致NASH的出現(xiàn)[15-17]。GRP78是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上輔助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽形成正確構(gòu)象的蛋白，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白蓄積增加時(shí)，GRP78蛋白與PERK分離[15]，表達(dá)上調(diào)，故被認(rèn)為是ERS啟動(dòng)信號(hào)，這為臨床判斷肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激狀態(tài)提供了思路，即檢測(cè)GRP78蛋白表達(dá)水平高低[18]。CHOP存在于細(xì)胞質(zhì)中，在ERS激活時(shí)而轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，通過下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2以及上調(diào)促凋亡成員Bim的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此被認(rèn)為是ERS最主要的凋亡因子。

本研究采用高脂飲食構(gòu)建NASH模型，顯示模型組ALT和AST高于正常對(duì)照組，并出現(xiàn)了肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥因子浸潤(rùn)，凋亡細(xì)胞明顯增多，提示造模成功；而經(jīng)姜黃素治療后，肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞凋亡程度、以及肝功能(ALT和AST)均顯著下降，提示姜黃素對(duì)NASH大鼠肝臟具有保護(hù)作用。姜黃素是從植物姜黃中提取的有效物質(zhì)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤和抗纖維化等藥理作用[19]；姜黃素可減輕衣霉素誘導(dǎo)ERS引起的肝損傷[20]，同時(shí)能夠清除自由基，防止脂質(zhì)過氧化。隨著臨床對(duì)姜黃素的抗腫瘤作用的持續(xù)關(guān)注和深入，有研究指出姜黃素能夠通過ERS途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和凋亡，抑制癌細(xì)胞活性[21]。姜黃素可通過CHOP途徑抑制肝癌細(xì)胞增值，其增殖抑制作用與藥物濃度及作用時(shí)間有關(guān)[22]。而本研究結(jié)果也證實(shí)模型組大鼠GRP78及CHOP蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組均增高，說明NASH大鼠肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并誘導(dǎo)產(chǎn)生肝細(xì)胞凋亡；姜黃素組大鼠GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)降低。由此可見，姜黃素可通過下調(diào)GRP78和CHOP表達(dá)抑制ERS發(fā)生，從而減輕肝細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用。

Figure 4.Results for hepatocyte apoptosis.A: normal control group; B: model group; C: curcumin group. Black arrow: apoptotic cells.

圖4 肝細(xì)胞凋亡結(jié)果

綜上所述，姜黃素能改善NASH大鼠肝功能、減輕其病理學(xué)改變、減輕肝細(xì)胞凋亡的生理作用可能與其抑制ERS有關(guān)，為臨床應(yīng)用姜黃素治療NASH提供了依據(jù)。但因本研究樣本量有限，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。