小麥幾丁質(zhì)酶基因家族的全基因組鑒定及禾谷鐮刀菌脅迫下的表達(dá)分析

徐 武,劉建豐,張 戈,徐 文,袁祖麗

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002; 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002; 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物設(shè)計中心，河南 鄭州 450002)

幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)是廣泛存在于植物中的一種糖苷水解酶，能水解N-乙酰氨基葡萄糖聚合物[1]。幾丁質(zhì)酶是一類與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以破壞病原菌的細(xì)胞壁和昆蟲的外骨骼，在植物防御生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[2]。根據(jù)氨基酸序列相似性，可將植物幾丁質(zhì)酶分為糖苷水解酶亞家族18(GH-18)和糖苷水解酶亞家族19(GH-19)[3]。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫(http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html)，植物幾丁質(zhì)酶被分為5個不同的類(Ⅰ—Ⅴ)[4]。其中，Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類屬于GH-19亞家族，Ⅲ類和Ⅴ類屬于GH-18亞家族[3]。Ⅰ類幾丁質(zhì)酶成員具有N-末端甲殼素結(jié)合區(qū)和GH-19催化結(jié)構(gòu)域；Ⅱ類幾丁質(zhì)酶成員只有1個催化結(jié)構(gòu)域，與Ⅰ類幾丁質(zhì)酶成員具有較高的序列和結(jié)構(gòu)相似性，但缺乏甲殼素結(jié)合區(qū)；Ⅳ類幾丁質(zhì)酶成員與Ⅰ類幾丁質(zhì)酶成員具有較高的同源性，但由于甲殼素結(jié)合區(qū)和催化結(jié)構(gòu)域的缺失，其同源性較小[5]；Ⅲ類和Ⅴ類幾丁質(zhì)酶成員均具有GH-18催化結(jié)構(gòu)域和保守序列DXDXE，但與其他類成員無氨基酸序列同源性[6]。

在高等植物生長發(fā)育過程中，幾丁質(zhì)酶基因在植物抗病過程中起到重要作用[7-16]。1998年，TABEI等[7]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將水稻的幾丁質(zhì)酶基因RCC2導(dǎo)入黃瓜，與非轉(zhuǎn)基因植株相比，轉(zhuǎn)基因黃瓜對灰霉病的抗性顯著提高。2000年，YAMAMOTO等[8]將1個水稻Ⅰ類幾丁質(zhì)酶基因?qū)肫咸?，顯著提高了轉(zhuǎn)基因葡萄對白粉病的抗性。近年來，已將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入水稻[9-10]、棉花[11]、大豆[12-13]、花生[14]、煙草[15-16]等高等植物中，也明顯提高了轉(zhuǎn)基因植株對各類病菌的抗性，這些研究說明幾丁質(zhì)酶基因在植物抗病應(yīng)答過程中具有重要的作用。

小麥作為世界上重要的糧食作物之一，其生長發(fā)育過程中受到許多病菌的危害，尤其是禾谷鐮刀菌侵染引起的赤霉病。近年來，赤霉病成為造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)的病害之一，不僅降低小麥產(chǎn)量，而且還產(chǎn)生赤霉毒素影響品質(zhì)，甚至危害人類健康。自小麥參考基因組序列公布以來，小麥基因功能的研究報道越來越多，但是小麥中幾丁質(zhì)酶家族成員全基因組鑒定的研究尚未見報道。研究幾丁質(zhì)酶基因?qū)μ岣咝←湷嗝共】剐跃哂兄匾饬x。為此，對小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員進(jìn)行鑒定,并對其基因結(jié)構(gòu)、保守基序(Motif)、染色體分布、系統(tǒng)進(jìn)化及禾谷鐮刀菌脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究幾丁質(zhì)酶基因在小麥生物脅迫應(yīng)答方面的作用及小麥抗病分子育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

小麥基因組參考序列及其注釋文件均下載自Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-41)。

1.2 小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員的鑒定

小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員結(jié)構(gòu)域信息隱馬爾科夫模型(PF00704和PF00182)均下載自Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)。利用HMMER 3.1軟件結(jié)合幾丁質(zhì)酶基因家族成員結(jié)構(gòu)信息隱馬爾科夫模型搜索小麥基因組注釋的蛋白質(zhì)序列文件，E值設(shè)置為 1E-10。如果同一個基因?qū)?yīng)的多個注釋蛋白質(zhì)序列被鑒定到，選取長度最長的蛋白質(zhì)序列。采用Compute pI/Mw tool(https://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測蛋白質(zhì)的等電點和分子質(zhì)量。

1.3 小麥幾丁質(zhì)酶基因家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

根據(jù)鑒定到的小麥幾丁質(zhì)酶家族成員蛋白質(zhì)序列編號和Ensembl Plants中小麥基因組注釋信息文件,提取小麥幾丁質(zhì)酶基因家族基因的注釋信息,然后將其提交GSDS網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)來繪制基因結(jié)構(gòu)圖。用MEME軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)來預(yù)測幾丁質(zhì)酶家族成員的保守基序。

1.4 小麥幾丁質(zhì)酶家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將鑒定到的小麥幾丁質(zhì)酶家族成員蛋白質(zhì)序列利用MEGA 7.0軟件包中的MUSCLE軟件進(jìn)行多重序列比對，然后進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。系統(tǒng)進(jìn)化樹采用NJ(Neighbor-joining)法構(gòu)建，抽樣次數(shù)為1 000[17]。

1.5 小麥幾丁質(zhì)酶基因家族基因的表達(dá)分析

小麥RNA-Seq測序數(shù)據(jù)來自SRA數(shù)據(jù)庫[18]，登錄號為SRR7000820—SRR7000822、SRR7000826—SRR7000828、SRR7000832—SRR7000834、SRR7000838—SRR7000840、SRR7000844—SRR7000846、SRR7000850—SRR7000852、SRR7000856—SRR7000858、SRR7000862—SRR7000864。采用TopHat 2[19]軟件將其與參考基因組序列比對，運(yùn)用HTSeq軟件[20]統(tǒng)計每個轉(zhuǎn)錄本的reads數(shù)，然后用DESeq2 R包[21]進(jìn)行差異分析，保留log2(變化倍數(shù))大于1的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行熱圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員的鑒定及序列特征分析

在小麥基因組中共鑒定到159個幾丁質(zhì)酶基因家族成員，如表1所示，這些幾丁質(zhì)酶基因主要分成2個亞家族，即GH-18和GH-19家族，分別有82個和77個基因。小麥幾丁質(zhì)酶基因編碼蛋白質(zhì)序列長度為157～739個氨基酸，分子質(zhì)量為16 648.96～79 774.66 u，理論等電點介于4.10～10.25。對小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員進(jìn)行染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，本研究鑒定到的159個小麥幾丁質(zhì)酶基因家族中的154個基因不均勻分布在21條染色體上，5個定位在尚未組裝完整的scaffold上。3號染色體上幾丁質(zhì)酶基因數(shù)目最多，共49個，其中3A、3B、3D染色體上分別有18、16、15個；2號染色體次之，含有31個，2A、2B、2D染色體上分別有12、8、11個；7A、7B、7D染色體上分別有8、12、7個； 1A、1B、1D染色體上分別有9、8、6個；5A、5B、5D染色體上分別有7、4、4個；4A、4B、4D染色體上分別有1、1、3個；6號染色體上數(shù)目最少，共4個，6A、6B、6D染色體上分別有2、1、1個。從染色體組的角度來看,同一編號染色體A、B、D 3套染色體組含有的幾丁質(zhì)酶基因數(shù)目差別不大，表明幾丁質(zhì)酶基因在A、B、D 3套染色體組進(jìn)化過程中沒有發(fā)生明顯的基因丟失現(xiàn)象。

表1 小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員信息

續(xù)表1 小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員信息

續(xù)表1 小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員信息

續(xù)表1 小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員信息

2.2 小麥幾丁質(zhì)酶家族成員的分類

利用本研究鑒定到的小麥幾丁質(zhì)酶家族成員蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并與已知擬南芥幾丁質(zhì)酶家族成員蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，然后根據(jù)已知擬南芥幾丁質(zhì)酶家族成員分類信息對小麥幾丁質(zhì)酶家族基因成員進(jìn)行分類，結(jié)果(圖1)表明，小麥幾丁質(zhì)酶家族成員分為5類，GH-19和GH-18亞家族分別聚在2個不同的分支。GH-18亞家族包括Ⅲ類和Ⅴ類，其中，Ⅱ類含有34個成員，Ⅴ類含有48個成員。GH-19亞家族中包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ類，其中，Ⅰ類含有52個成員，Ⅱ類含有13個成員，Ⅳ類含有12個成員。

圖1 小麥幾丁質(zhì)酶家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of chitinase family members in wheat

2.3 小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

為了進(jìn)一步研究小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)小麥基因組參考序列的功能注釋信息并繪制其外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖(圖2—3)，結(jié)果表明，GH-18亞家族基因含有1～8個外顯子，其中，大部分只有1個外顯子，不含有內(nèi)含子；少量含有1～2個內(nèi)含子；TraesCS3D02G229800.2、TraesCS3A02G223700.1和TraesCS3B02G253200.1三個基因含有7～8個內(nèi)含子。GH-19亞家族基因含有1～5個外顯子，大部分成員含有1～2個內(nèi)含子，基因長度差別不大，其中，TraesCS3A02G415700.1基因內(nèi)含子長度比較長；TraesCS3D02G229800.2、TraesCS3A02G223700.1、TraesCS3B02G253200 .1和TraesCS3A02G415700.1四個基因長度比其他幾丁質(zhì)酶基因長很多，而且內(nèi)含子長度比外顯子長度長，說明在進(jìn)化過程中這4個基因內(nèi)部可能發(fā)生了大片段的插入。對GH-18和GH-19亞家族成員中的保守基序進(jìn)行分析(圖4—5)發(fā)現(xiàn)，GH-18亞家族82個成員中有79個包含保守基序5，67個成員中包含保守基序1、保守基序2、保守基序3、保守基序4；GH-19亞家族77個成員中有74個包含保守基序1、保守基序4，其中，GH-19亞家族的第Ⅳ亞類不含有保守基序2，剩下65個成員中62個含有此基序。綜上所述，相同亞家族的幾丁質(zhì)酶基因幾乎具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和保守基序。

圖2 小麥GH-18亞家族成員基因結(jié)構(gòu)分析

圖3 小麥GH-19亞家族成員基因結(jié)構(gòu)分析

圖4 小麥GH-18亞家族成員保守基序分析

2.4 小麥幾丁質(zhì)酶基因家族成員的表達(dá)分析

通過分析4個小麥品系的RNA-Seq數(shù)據(jù)，得到幾丁質(zhì)酶基因家族成員在小麥接種禾谷鐮刀菌前后的表達(dá)譜。由圖6可知，雖然幾丁質(zhì)酶基因在不同小麥品系中被誘導(dǎo)表達(dá)的程度存在差異，但是在4個小麥品系被禾谷鐮刀菌侵染后，一些基因(TraesCS1A02G203600.1、TraesCS1D02G249600.1、TraesCS3A02G260100.1、TraesCS6D02G199500.1、TraesCS6A02G216100.1、TraesCS2D02G349400.1、TraesCS2A02G350900.1、TraesCS2A02G350800.1、TraesCSU02G026200.1、TraesCS7B02G256000.1、TraesCS1B02G158000.1、TraesCS1D02G140500.1、TraesCS1A02G141500.1、TraesCS3A02G373800.1、TraesCS3B02G406000.1)的表達(dá)均明顯上調(diào)，說明幾丁質(zhì)酶基因在小麥應(yīng)答禾谷鐮刀菌過程中起重要的作用。

圖5 小麥GH-19亞家族成員保守基序分析

3 結(jié)論與討論

本研究從小麥基因組中共鑒定到159個幾丁質(zhì)酶基因，分為GH-18和GH-19兩個亞家族，相同亞家族成員幾乎具有相似的外顯子-內(nèi)含子基因結(jié)構(gòu)和保守基序，并且聚類在同一分支上。此外，在A、B、D 3套染色體組中鑒定到的幾丁質(zhì)酶基因家族基因數(shù)目差別不大，說明幾丁質(zhì)酶基因在A、B、D 3套染色體組長期進(jìn)化中沒有發(fā)生明顯的基因丟失現(xiàn)象。

近年來，植物幾丁質(zhì)酶基因在很多農(nóng)作物抗逆抗病過程中具有重要的作用[9-16]。本研究分析了幾丁質(zhì)酶基因家族成員在3個小麥抗病品系和1個小麥感病品系被禾谷鐮刀菌侵染前后的表達(dá)變化，結(jié)果表明，一些幾丁質(zhì)酶基因家族成員的表達(dá)明顯被禾谷鐮刀菌誘導(dǎo)，而且同一家族的不同基因成員的表達(dá)量也存在明顯的差異。這種現(xiàn)象可能由于基因家族在擴(kuò)張的過程中同一家族不同基因成員負(fù)責(zé)不同生物或者非生物脅迫應(yīng)答功能不同所致。