乳酸桿菌產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)條件的優(yōu)化

宋昊芮，李 彥，王 樂，姚一帆

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長沙 410114)

乳酸桿菌分泌到胞外的糖類化合物EPS，為粘液多糖和莢膜多糖.EPS在食品加工中可用于增稠、穩(wěn)定、乳化及制成保健藥物抑制癌癥. 影響EPS產(chǎn)量的內(nèi)因是種屬,外因包括培養(yǎng)基的葡萄糖含量、初始pH值、培養(yǎng)溫度等，國內(nèi)外已有許多相關(guān)研究和結(jié)論,因菌株種類不同有所差別.本實(shí)驗(yàn)是從自制泡菜汁中提取乳桿菌經(jīng)，經(jīng)生化鑒定確認(rèn)其細(xì)菌菌屬，再從乳桿菌中提取EPS并用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖含量測定，并采用單因素法對(duì)LAB EPS產(chǎn)量影響因素進(jìn)行初步探究，然后設(shè)計(jì)四因素三水平(溫度、pH值和葡萄糖含量、時(shí)間)正交試驗(yàn)，最終確定菌株獲得高產(chǎn)胞外多糖的最佳實(shí)驗(yàn)條件組合.

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

原材料：果蔬；白糖；白醋；食鹽.

儀器：電子天平(TD6002B)；電子分析天平(BSA124S)；紫外可見分光光度計(jì)(UV-5200)；METASH微量高速離心機(jī)(TG16-W)；立式壓力蒸汽滅菌器(DY04-13-44-00)；恒溫培養(yǎng)箱(DPX-9052B-2)；生化培養(yǎng)箱(LRH-250)；顯微鏡(BM1000)；pH計(jì)(DELTA320)；雙人雙面垂直凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)；萬用電爐(DL-1).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制作泡菜 泡菜腌制汁由涼白開水3 000 mL，加白糖80.0 g、白醋100.0 g、食鹽30.0 g，常溫配制.泡菜原料為黃瓜100 g，白蘿卜100 g，長豆角100 g，蒜11.93 g，辣椒5.86 g.泡菜原料倒入泡菜壇，注入泡菜汁約400～450 mL(距壇口1 cm左右，保證兼性厭氧乳酸桿菌的生長)，保鮮膜封口，蒸餾水液封于常溫避光干燥處7～10 d.

1.2.2 乳酸桿菌的分離純化 將腌后泡菜汁吸取1 mL接種到MRS液體培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱37 ℃靜置培育過夜.吸取1.0 mL樣品液稀釋10-6，10-7，10-83個(gè)稀釋度后，分別于含1% CaCO3的固體MRS培養(yǎng)基涂平板上，每個(gè)梯度進(jìn)行3組平行和1組空白實(shí)驗(yàn)，恒溫37 ℃培養(yǎng)24～48 h.挑取菌落為白色且四周有分散現(xiàn)象、表面粘稠、產(chǎn)生乳酸菌溶解圈等具有乳酸菌典型特征的圓形明顯的單株菌落，平板劃線分離純化后接種到MRS固體斜面上，置于4 ℃冰箱中保存.革蘭氏染色陽性、V-P試驗(yàn)陽性、明膠液化試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性且接觸酶試驗(yàn)與葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)不產(chǎn)氣泡并能凝乳的菌株認(rèn)定為乳酸菌.

1.2.3 乳酸桿菌胞外多糖提取 取5 mL乳桿菌發(fā)酵液于試管，加80%(體積分?jǐn)?shù))的三氯乙酸100 μL，脫除蛋白質(zhì)，10 000 r/min冷凍離心15 min除菌體，上清液倒入透析袋流水透析48 h.透析液入試管，加95%的無水乙醇(比例為1∶3)，于4 ℃冰箱靜置過夜，得絮狀沉淀.低溫4 ℃，10 000 rad/min離心15 min，倒掉上清液，得白色沉淀即為胞外多糖.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard Curve of Glucose

1.2.4 乳桿菌EPS的測定 乳酸菌胞外多糖含量用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚-硫酸法測定.取乳桿菌發(fā)酵液10 mL， 加三氯乙酸離心除蛋白質(zhì).上清液裝入透析袋中透析，加2～3倍體積的95%乙醇于透析液中用來沉淀多糖，離心得沉淀溶于蒸餾水，即得水溶性乳酸菌胞外多糖.乳酸菌胞外多糖水溶液在490 nm處的吸光度用苯酚-硫酸法測得， 對(duì)應(yīng)的糖含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找，即得乳酸菌的胞外多糖產(chǎn)量.胞外多糖含量(%)=((待測液質(zhì)量濃度×250)/(樣品質(zhì)量×103))×100%.

1.2.5 乳桿菌胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化 選取不同培養(yǎng)溫度、不同葡萄糖含量、不同培養(yǎng)基pH值、不同培養(yǎng)時(shí)間為影響因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)糖量多少選擇最佳培養(yǎng)條件.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.

1.2.6 單因素影響試驗(yàn) (1)溫度的影響.不同培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸桿菌產(chǎn)胞外多糖的影響如圖2所示.

由圖2可知，從10 ℃開始，乳酸桿菌產(chǎn)胞外多糖呈線性增加，至37 ℃時(shí)達(dá)到峰值，培養(yǎng)溫度繼續(xù)上升產(chǎn)胞外多糖呈下降趨勢(shì).

(2)pH值的影響.不同pH值對(duì)乳酸桿菌產(chǎn)胞外多糖的影響如圖3所示.

由圖3可知，培養(yǎng)pH值為3～9，在pH值為6時(shí)乳酸桿菌產(chǎn)胞外多糖達(dá)到峰值，隨后下降.

圖2 不同溫度EPS生長曲線Fig. 2 EPS Growth Curves at Different Temperatures

圖3 不同pH值EPS的生長曲線Fig. 3 EPS Growth Curves with Different pH

(3)培養(yǎng)時(shí)間的影響.不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸桿菌產(chǎn)胞外多糖的影響如圖4所示.

由圖4可知，培養(yǎng)時(shí)間為10 h時(shí)，乳酸桿菌產(chǎn)胞外多糖達(dá)到峰值，隨后趨向于動(dòng)態(tài)平衡.

(4)葡萄糖含量的影響.葡萄糖含量對(duì)乳酸桿菌產(chǎn)胞外多糖的影響如圖5所示.

由圖5可知，葡萄糖含量為1.5%時(shí)，乳酸桿菌產(chǎn)胞外多糖達(dá)到峰值.

圖4 不同培育時(shí)間EPS生長曲線Fig. 4 EPS Growth Curve at Different Times

圖5 不同葡萄糖含量EPS生長曲線Fig. 5 EPS Growth Curves with Different Glucose Content

1.2.7 正交試驗(yàn) 設(shè)計(jì)培養(yǎng)溫度、葡萄糖含量、培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)時(shí)間的正交試驗(yàn)，4因素3水平正交試驗(yàn)表見表1.

表1 影響EPS產(chǎn)量因素的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)表1設(shè)定的3個(gè)水平，測定每組的EPS吸光度值，將試驗(yàn)結(jié)果輸入軟件進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與討論

正交試驗(yàn)結(jié)果列于表2.

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化分析

由表2可知，各因素影響的大小順序依次為溫度、pH值、時(shí)間、葡萄糖含量.對(duì)LAB的EPS產(chǎn)量影響最大為培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)基中養(yǎng)分葡萄糖含量對(duì)EPS產(chǎn)量幾乎無影響.A2B2C3D1的組合培養(yǎng)條件是產(chǎn)量最高的發(fā)酵條件，即乳酸桿菌高產(chǎn)EPS的最適宜工藝條件為：溫度35 ℃，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，pH值6.5，發(fā)酵時(shí)間10 h.

筆者探究了溫度、pH值、時(shí)間、葡萄糖含量4種因素對(duì)乳酸桿菌胞外多糖產(chǎn)量的影響，當(dāng)然菌株的生長不僅跟這些因素有關(guān)，還跟培養(yǎng)基中碳和氮的比例等條件有關(guān)，因此需有待進(jìn)一步研究.