BMP4過表達轉(zhuǎn)基因C57BL/6品系小鼠子代造血干細胞歸巢能力觀察

張小晴，李娟，柴爍，高夢夢，李玉云

(蚌埠醫(yī)學院，安徽蚌埠 233000)

造血干細胞移植(HSCT)是目前針對血液系統(tǒng)惡性疾病最有效的治療措施之一，目前臨床報道以及研究顯示HSCT仍存在一系列難題，如移植物抗宿主病(GVHD)、HSC稀少導致難以足量提取、以及歸巢和重建效率的改善等[1,2]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)是TGF-β超家族的成員之一，起初被用于骨骼發(fā)育，軟骨形成等方面的研究[3,4]。骨骼系統(tǒng)和血管系統(tǒng)作為造血微環(huán)境的重要組成部分，可對HSC的自我跟新和分化發(fā)揮調(diào)控作用[5,6]。后隨著基因編輯技術的發(fā)展，學者們發(fā)現(xiàn)BMP4敲除的小鼠會因為造血衰竭而死于宮內(nèi)，深入的研究發(fā)現(xiàn)BMP4能介導中胚層中的造血系細胞的形成，同時在胚胎期注射BMP4可以促進造血集落的形成。從而開啟了BMPs在造血系統(tǒng)，尤其是胚胎造血方面的研究，然而BMP4在成熟個體造血或出生后造血調(diào)控中發(fā)揮的功能還知之甚少，體外實驗的結(jié)果也不一致。但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓中提取的HSC表面存在BMP Ⅰ型和Ⅱ型受體[7]，包括BMP4。因此我們推測，BMP4具有調(diào)控出生后造血的功能。但是BMP4在出生后造血調(diào)控方面還有很多地方有待研究。本研究選用BMP4過表達的轉(zhuǎn)基因C57BL/6品系小鼠，從HSC歸巢角度，探討B(tài)MP4基因在成年個體的骨髓造血中的功能及機制研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8～10周的成年C57BL/6品系小鼠30只，安置于蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心的SPF級動物屏障系統(tǒng)內(nèi)，并按照動物實驗中心和蚌埠醫(yī)學院動物倫理委員會的規(guī)章制度進行繁育和實驗。野生型小鼠(60只)購于揚州大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑 Mouse tail DNA mini kit購自成都Foregene公司；PCR引物合成購自南京金斯瑞公司；瓊脂糖凝膠購自西班牙Biowest公司；TRIzol?Reagent和DNA ladder購自天津Tiangen公司；SYBR Premix DimerEraser購自日本Takara公司；40 μm細胞濾網(wǎng)購自上海Biologix公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；RBC lysis，PE-lineage抗體，CFSE示蹤劑購自美國Biolegend公司；FITC-c-kit抗體，APC-Sca-1抗體購自英國Abcam公司；IGTA-4和VCAM-1抗體購自于美國CST公司，BSA購于德國Biofroxx生物科技，BCA試劑盒和SDS-PAGE試劑盒購于上海碧云天生物技術公司，恩羅沙星購自大連美侖生物；胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.3 BMP4過表達轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建及其繁育后子代的篩選 獲取鼠源BMP4基因序列，包括全序列和外顯子序列。將外顯子序列敲入野生型C57BL/6品系小鼠NSE啟動子下游，同時設計跨內(nèi)含子的引物，使得只有轉(zhuǎn)基因小鼠才有著特異的擴增條帶(277 bp)，這一特性也用于BMP4轉(zhuǎn)基因鼠的篩選。由于轉(zhuǎn)基因BMP4鼠在繁育的過程中并不是穩(wěn)定遺傳的，在繁育過程中，子代可能會有BMP4基因的丟失，所以繁育后的子代小鼠在4周齡的時候，需剪取2 mm左右的尾巴或耳朵，裂解其DNA，普通PCR擴增后做瓊脂糖凝膠電泳，以100 bp的DNA ladder為Maker,在300 bp左右出現(xiàn)的亮條帶為陽性帶，同時做陰性對照和陽性對照。篩選出的BMP4子代陽性鼠留下實驗，子代陰性鼠全部處死。留下的BMP4陽性鼠和購買的野生鼠分籠飼養(yǎng)繁育。BMP4引物序列：5’-CACTGTGAGGAGTTTCCATC-3’，5’-GTGATGGACTAGTCTGGTGTC-3’。

1.4 子代陽性鼠骨髓HSC歸巢能力觀察 ①歸巢效率：從野生型和轉(zhuǎn)基因型未輻照鼠中各取5只小鼠作為供體鼠，以頸椎脫臼法處死，解剖分離出股骨和脛骨，用組織剪和粗面紗布去除軟組織，用2%胎牛血清的PBS進行骨髓腔沖洗，用40 μm孔徑的細胞濾網(wǎng)過濾出細胞液，然后牛鮑計數(shù)板進行人工計數(shù)1×107，用1 mL的PBS重懸，用Lineage-C-kit-sca-1雙熒光抗體染色后流式細胞儀對HSC分選，分選出的HSC以每組5×104/只進行尾靜脈注射。選取野生型C57BL/6品系小鼠20只，以10 Gy/20g(69.30 cGy/min的頻率)的鈷60(60co)分兩次進行輻照，中間間隔2 h。后隨機分為4組各每組5只，轉(zhuǎn)基因1組：BMP4轉(zhuǎn)基因鼠未接受輻照作為供體和野生型輻照小鼠作為受體;野生型1組：野生型未輻照小鼠作為供體和野生型輻照小鼠為受體;陽性對照組：野生型輻照小鼠不接受HSCT，但流式檢測前體外CFSE染色;陰性對照組：野生型輻照小鼠不接受HSCT，注射等量PBS。流式細胞儀上機，以空白對照組為基礎，以Flowjo軟件分析數(shù)據(jù)，每組BMNC中CFSE陽性區(qū)域所占百分比，得出HSC歸巢的效率。②造血歸巢趨化因子(CXCL12)mRNA：采用RT-PCR法檢測。隨機選取“①”篩選出的轉(zhuǎn)基因BMP4子代陽性鼠和野生型C57BL/6品系小鼠各3只(分別計為轉(zhuǎn)基因2組和野生型2組)，分別編號，每一只對應相應的離心管。以頸椎脫臼法處死以后進行解剖，分離出雙側(cè)股骨和脛骨，用組織鉗剪去軟組織以后，在含有PBS的研缽中研磨，12 000 r/min離心去上清，每個離心管加入2 mL紅細胞裂解液去除紅細胞，再次以12 000 r/min 離心去除上清后加入2 mL的TRIzol法提取細胞總RNA，用核酸測定儀測出RNA濃度和純度，濃度>500 ng/μL，純度的OD值1.8～2.0可用于后續(xù)RNA實驗。取≤2 μg進行逆轉(zhuǎn)錄，整個過程在冰上進行。逆轉(zhuǎn)錄反應條件：42 ℃、60 min，70 ℃、5 min。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按RT-PCR試劑盒說明進行上樣，每組設置3個復孔，反應體系：SYBR GreenⅠmix(Rox)10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，RNase-free水補足至20 μL。反應條件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、35 s，40個循環(huán)。計算每組平均-2ΔΔCt，ΔCt(n)=Ct目的基因(n)-Ct內(nèi)參基因(n)；ΔΔCT(n)=ΔCt(n)-ΔCt(1)；然后算出2-ΔΔCT。取3次平均值比較對照組和實驗組兩種基因的表達水平。CXCL12引物序列：5’-TGCATCAGTGACGGTAAACCA-3’，5’-CACAGTTTGGAGTGTTGAGGAT-3’，內(nèi)參GAPDH引物序列：5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。③整合素α4(ITGA4)、血管內(nèi)皮細胞黏附分子1(VCAM-1)蛋白：采用Western blotting法檢測。隨機選取“①”篩選出的轉(zhuǎn)基因BMP4子代陽性鼠和野生型C57BL/6品系小鼠各3只(分別計為轉(zhuǎn)基因2組和野生型2組)，分別編號，每一只對應相應的離心管，方法同上，只是離心后的沉淀用蛋白裂解液RIPA裂解，BCA法定量檢測蛋白的濃度，并做標準曲線。配制制備1.0 mm SDS-PAGE膠，為10%的分離膠和6%的濃縮膠，按照計算的濃度每個泳道加入40 μg總蛋白進行電泳分離，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%BSA封閉1～2 h，4 ℃一抗過夜，二抗孵育，ECL化學發(fā)光試劑自顯影。顯影后的結(jié)果用Image J軟件進行掃描灰度值，根據(jù)灰度值的大小判斷蛋白水平表達的高低，蛋白相對表達水平則為目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白的灰度值的百分比(以β-tublin和GAPDH為內(nèi)參)。

2 結(jié)果

轉(zhuǎn)基因1組、野生型1組、陽性對照組、陰性對照組歸巢效率(0.352 0±0.0223 0)%、(0.721 0±0.032 0)%、(37.200 0±0.556 0)%、(0.101 3±0.018 0)%，轉(zhuǎn)基因組與野生組、陰性組比較，野生組與陰性組比較，P均<0.05。轉(zhuǎn)基因2組和野生型2組CXCL12 mRNA、ITGA4蛋白、VCAM-1蛋白相對表達量比較見表1。

表1 轉(zhuǎn)基因2組和野生型2組CXCL12 mRNA、ITGA4蛋白、VCAM-1蛋白相對表達量比較

注：與野生型2組比較，*P<0.05。

3 討論

HSC是一類能維持造血以及造血穩(wěn)態(tài)的多能干細胞，具有各系血細胞分化性并能持續(xù)終生。目前HSC已成為血液病、干細胞領域研究的重點對象，臨床上采用的HSC移植也是目前治療血液系統(tǒng)惡性疾病的主要手段。BMP4起初被用于骨骼方面的研究。后隨著基因編輯技術的發(fā)展，學者們發(fā)現(xiàn)BMP4敲除的小鼠會因為造血衰竭而死于宮內(nèi)，深入的研究發(fā)現(xiàn)BMP4能介導中胚層中的造血系細胞的形成，同時在胚胎期注射BMP4可以促進造血集落的形成。從而開啟在胚胎造血方面的研究，然而BMP4在成熟個體造血或出生后造血調(diào)控中發(fā)揮的功能還知之甚少，體外實驗的結(jié)果也不一致。但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓中提取的HSC表面存在BMP Ⅰ型和Ⅱ型受體，其配體包括BMP4。因此我們推測，BMP4具有調(diào)控出生后造血的功能。無論BMP4對造血系統(tǒng)有著何種貢獻，我們都需要一個理想的活體模型來驗證我們的猜想。鑒于BMP4基因敲除的胚胎致死性嚴重阻礙了學者們的研究進程，我們利用C57BL/6品系小鼠構(gòu)建了一個神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)啟動子調(diào)控的BMP4(NSE-BMP4)轉(zhuǎn)基因活體模型，在NSE啟動子的調(diào)控下，上調(diào)BMP4的表達水平。因為該品系小鼠強壯適合做模型鼠，另外該NSE-BMP4模型本身就是一個BMP4過表達的活體模型，比較能直觀反應BMP4升高的情況下的外周血及造血微環(huán)境各方面的改變。由于造血微環(huán)境的復雜性，在HSCT過程中HSC遷移和定植的調(diào)控我們還不充分了解，而歸巢效率和重建功能是評價HSCT的主要標準，直接影響到治療效果及預后。因此本研究將從HSC歸巢的角度，初步探討B(tài)MP4基因再造血系統(tǒng)中所發(fā)揮的功能及初步進行機制的探討。

目前，BMP4已被證實可調(diào)控造血相關因子的表達水平。研究[8]通過ChiP和熒光素酶實驗驗證了BMP4下游的Smads蛋白可結(jié)合到CXCL12的啟動子，對后者的表達發(fā)揮負調(diào)控功能。隨后Khurana等[9]運用多種BMP4信號通路抗體和抑制劑證明了BMP4存在非經(jīng)典通路，即Smad蛋白非依賴途徑，通過P38-MAPK途徑上調(diào)HSC的ITGA4的表達水平，CXCL12和ITGA4都可以促進HSC的歸巢和定植[10～13]，但是通過的途徑不同，CXCL12是通過SMAD途徑表達，而ITGA-4則通過P38-MAPK途徑表達。TGA4和CXCL12雖都是HSC遷移、動員和定植的輔助因子。前者與造血微環(huán)境中的VCAM-1和Fibronectin結(jié)合發(fā)揮生物學功能，后者作為趨化因子對HSC有著招募和支持的作用。VCAM-1+巨噬細胞亞群是造血祖細胞(HSPCs)的先導細胞[14]，與ITGA4結(jié)合促進HSC歸巢，但是我們進一步驗證BMP4轉(zhuǎn)基因小鼠VCAM-1沒有顯著性差異，所以我們暫且否定了這個信號的作用。由于BMP4敲除的胚胎致死性[15,16]，Goldman等[17]運用BMP4敲低的模型來研究其在出生后造血中的貢獻，通過骨髓和外周血各參數(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)BMP4表達水平的降低并沒有干擾到生理情況下的造血。因此，BMP4對出生后造血的調(diào)控尚存在很大的分歧。而我們在BMP4過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，RT-PCR結(jié)果顯示CXCL12水平是極度降低的，Western blotting檢測結(jié)果顯示ITGA4水平相對升高，VCAM-1沒有變化，整體對HSCT的影響是負調(diào)節(jié)的，不利于HSC歸巢。根據(jù)造血微環(huán)境調(diào)控因子表達和功能的異質(zhì)性，我們推測升高的ITGA4無法補償CXCL12的下調(diào)，從而導致了歸巢和重建效率的降低，具體機制有待進一步研究。我們利用CFSE標記HSC注射到輻照小鼠體內(nèi)追蹤HSC的歸巢，結(jié)果顯示BMP4轉(zhuǎn)基因的小鼠與野生型鼠相比HSC歸巢效率是降低的。輻照小鼠在接受BMP4轉(zhuǎn)基因鼠的HSCT后造血重建能力也是降低的。因此我們得出結(jié)論BMP4過表達的轉(zhuǎn)基因C57BL/6品系小鼠HSC歸巢、重建能力與野生型相比是下降的。根據(jù)造血微環(huán)境調(diào)控因子表達和功能的異質(zhì)性[18,19]，筆者推測升高的ITGA4無法補償CXCL12的下調(diào)，從而導致了歸效率的降低，具體機制有待進一步研究。

總之，造血微環(huán)境中BMP4水平的上調(diào)抑制了HSC的歸巢和造血重建能力。因此本研究將為HSCT，特別是中老年惡性血液疾病患者的HSCT治療提供一定的實驗室依據(jù)。