氯化鋰通過(guò)TGFBI促進(jìn)角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖和自噬

聶丹瑤，黎 明，葉 琳，賀溫玲，劉欣華

0引言

顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良(granular corneal dystrophy，GCD)是臨床常見(jiàn)的角膜營(yíng)養(yǎng)不良之一，屬于常染色體顯性遺傳病，其發(fā)病率約為5.52/10000。由于5q31染色體上的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGFBI)基因發(fā)生突變，使得TGFBI蛋白(TGFBIp)在角膜基質(zhì)層和彈力層聚集，并發(fā)生代謝障礙，導(dǎo)致患者雙側(cè)角膜出現(xiàn)混濁，最終造成視力損害[1]。在GCD早期，尚無(wú)有效的治療或緩解方法[2]。隨著GCD病情的惡化，可以采用手術(shù)方法來(lái)切除病變組織，包括板層角膜移植術(shù)和準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)[3]，但由于術(shù)后復(fù)發(fā)甚至加重的原因，其效果并不理想。因此，積極探索新的治療靶點(diǎn)將會(huì)有良好的應(yīng)用前景。研究表明，TGFBI突變與GCD的發(fā)生密切相關(guān)。TGFBI在細(xì)胞增殖、分化、遷移和粘附等方面具有重要作用[4]，但TGFBI在GCD中具體的功能和機(jī)制還不完全清楚。氯化鋰(lithium chloride，LiCl)作為藥物廣泛應(yīng)用于精神和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[5]。研究表明，LiCl可抑制TGFBI的表達(dá)，并增加角膜成纖維細(xì)胞和癌細(xì)胞中糖原合成酶激酶-3 (Glycogen synthase kinase-3, GSK-3)與微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)的比例[6]。本研究進(jìn)一步探討LiCl在突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞中的功能及相關(guān)機(jī)制，期待未來(lái)可為角膜營(yíng)養(yǎng)不良患者的藥物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料收集2017-01/12就診于深圳市眼科醫(yī)院并接受手術(shù)治療的顆粒樣角膜營(yíng)養(yǎng)不良病變患者3例，獲取3個(gè)角膜組織。所有角膜營(yíng)養(yǎng)不良患者均經(jīng)TGFBI基因突變DNA測(cè)序分析確診，且無(wú)遺傳或全身代謝性疾病史。同時(shí)，選取來(lái)自三個(gè)不同個(gè)體捐獻(xiàn)的正常角膜組織3個(gè)。角膜組織的取材及使用都經(jīng)過(guò)患者知情同意，該研究經(jīng)深圳市眼科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有角膜組織在無(wú)菌條件下被切成20mg的組織塊分裝，-80℃保存。實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基(Sigma，D1152)、胰蛋白酶(Gibco, 15090-046)、胎牛血清(FBS, Gibco, 26140087)、青霉素-鏈霉素雙抗(Gibco，15070-063)、DMSO(Sigma，D8418)、兔源單克隆抗TGFBI抗體(Abcam, Cambridge, UK)，兔源多克隆抗LC3抗體(Abcam)、兔源單克隆抗GAPDH抗體(Boster, Wuhan, China)、pcDNA3.0載體(Invitrogen, USA)、Bestar qPCR RT Kit(DBI, USA)、Bestar? SybrGreen qPCR-master Mix(DBI, USA)、RIPA(Beyotime, China)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Beyotime, China)。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)角膜組織中TGFBI和LC3表達(dá)分別采用4%多聚甲醛固定GCD患者行板層角膜移植術(shù)切除的角膜組織和捐獻(xiàn)的正常角膜組織，石蠟包埋后切片，厚度4μm。37℃干燥過(guò)夜后，于1%過(guò)氧化氫溶液中浸泡20min。3%牛血清白蛋白室溫下孵育1h，并于兔源單克隆抗TGFBI抗體和兔源多克隆抗LC3抗體一抗(1∶500)4℃孵育過(guò)夜，鼠抗兔HRP標(biāo)記IgG(1∶1000)二抗孵育后，DAB顯色，蘇木素染核后脫水封片。顯微鏡下觀察GCD角膜組織和正常角膜組織中TGFBI和LC3的表達(dá)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)文獻(xiàn)[7]提供方法，取板層角膜移植術(shù)切除下來(lái)正常角膜組織的基質(zhì)層組織，生理鹽水清洗3次，抗生素液(100μg/mL鏈霉素+100U/mL青霉素)處理30min。在無(wú)菌條件下，去除角膜上皮層，將角膜基質(zhì)層放入10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7d后，Hanks液清洗，0.125%胰蛋白酶消化，離心后收集細(xì)胞。

1.2.3野生型和突變型TGFBI質(zhì)粒構(gòu)建采用PCR法擴(kuò)增TGFBI。野生型TGFBI引物：正向引物5’-CCC AAG CTT ATG GCG CTC TTC GTG CG -3’, 反向引物: 5’- CCG CTC GAG CTA ATG CTT CAT CCT CTC TAA TAA CTT TT -3’。突變型TGFBI引物：正向引物5’- AGC TGT ACA CGG ACC ACA CGG AGA AGC TGA G -3’，反向引物 5’- CTC AGC TTC TCC GTG TGG TCC GTG TAC AGC T -3’。1%瓊脂糖凝膠電泳TGFBI擴(kuò)增產(chǎn)物。將回收的TGFBI擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3.0質(zhì)粒酶切后進(jìn)行電泳回收，T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化并提取重組質(zhì)粒。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染和處理首先將構(gòu)建的野生型和突變型TGFBI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染空載體作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后留取0、12、24、36、48h的細(xì)胞做活性檢測(cè)并提取轉(zhuǎn)染后24h的細(xì)胞蛋白。其次，將LiCl溶于PBS中，并采用0、5、10、20、40mmol/L LiCl處理正常角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞6h，留取處理后24h時(shí)的細(xì)胞做活性檢測(cè)。然后，同等濃度梯度的LiCl(KCl作為對(duì)照)處理突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞6h，留取處理后24h時(shí)的細(xì)胞提取蛋白。根據(jù)正常角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞的濃度梯度處理后的細(xì)胞活性結(jié)果，后續(xù)則采用20mmol/L LiCl處理突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞，觀察不同時(shí)間(0、1、6、12h)后， TGFBI與LC3蛋白表達(dá)變化。最后，采用20mmol/L LiCl處理突變型TGFBI過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞12h，留取處理后24h時(shí)的細(xì)胞做活性檢測(cè)，并提取蛋白備用。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力取上述處理后的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞，調(diào)整為1×103cells/mL濃度并鋪于96孔板中，每孔100μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。每組細(xì)胞在特定時(shí)間加入CCK-8試劑，5% CO2孵箱37℃條件培養(yǎng)3h后，于酶標(biāo)儀下測(cè)定450nm波長(zhǎng)處吸光度值(OD值)。

1.2.6 Western-blot法檢測(cè)TGFBI和LC3表達(dá)RIPA提取了角膜營(yíng)養(yǎng)不良及正常角膜組織及上述不同處理后的細(xì)胞總蛋白，按 BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組蛋白濃度。取40μg 各組總蛋白于8% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉，兔源單克隆抗TGFBI抗體(1∶2000)，兔源多克隆抗LC3抗體(1∶1000)、兔源單克隆抗抗GAPDH抗體(1∶5000)4℃孵育過(guò)夜。鼠抗兔HRP標(biāo)記的IgG二抗(1∶5000)室溫孵育1h后，ECL顯色。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 TGFBI和LC3角膜組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常角膜組織相比，TGFBI和LC3在GCD患者角膜組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1A)。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常角膜組織相比，TGFBI和LC3在GCD患者角膜組織中顯著高表達(dá)(圖1B)。

2.2 TGFBI過(guò)表達(dá)抑制角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞活性分別構(gòu)建野生型和突變型TGFBI過(guò)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)野生型和突變型TGFBI過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞中TGFBI表達(dá)明顯增加，提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功；與空載體轉(zhuǎn)染組相比，LC3在野生型TGFBI組細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)明顯差異，而在突變型TGFBI組細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，提示突變型TGFBI可顯著上調(diào)LC3表達(dá)(圖2A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空載體轉(zhuǎn)染組、野生型TGFBI組、突變型TGFBI組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后12、24、36h，野生型TGFBI組細(xì)胞活性均較空載體轉(zhuǎn)染組明顯減弱；突變型TGFBI組細(xì)胞活性較野生型TGFBI組顯著減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。

圖1TGFBI與LC3蛋白在角膜組織中的表達(dá)A：免疫組織化學(xué)檢測(cè)TGFBI與LC3蛋白的表達(dá)(×100)；B：Western-blot法檢測(cè)TGFBI與LC3蛋白的表達(dá)。C：正常角膜組織；CD：GCD患者角膜組織。

2.3 LiCl對(duì)角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞活性的影響分別采用0、5、10、20、40mmol/L LiCl處理正常角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞6h，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，LiCl對(duì)正常角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞無(wú)毒性作用(圖3)。

2.4 LiCl對(duì)突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞中TGFBI表達(dá)的影響分別采用5、10、20、40mmol/L LiCl處理突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞6h，Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，LiCl可抑制TGFBI蛋白表達(dá)水平，且隨著LiCl濃度的增加，TGFBI蛋白表達(dá)水平降低(圖4A)。采用20mmol/L LiCl分別處理突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞0、1、6、12h，Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在20mmol/L LiCl作用下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，TGFBI蛋白表達(dá)水平降低(圖4B)。

2.5 LiCl對(duì)突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞自噬和活性的影響采用20mmol/L LiCl處理突變型TGFBI過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞12h，Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGFBI和LC3蛋白表達(dá)水平在LiCl處理組顯著下調(diào)(圖5A)。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性在LiCl處理組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5B)。

3討論

自噬(autophagy)在細(xì)胞調(diào)控中起著重要作用，負(fù)責(zé)降解細(xì)胞內(nèi)損傷蛋白質(zhì)及功能失調(diào)細(xì)胞器。LC3作為自噬體膜上的標(biāo)志蛋白，具有以L(fǎng)C3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式存在[8]。在自噬過(guò)程中，LC3-Ⅰ經(jīng)過(guò)一系列過(guò)程可轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ，LC3-Ⅱ可與自噬體特異性結(jié)合，被廣泛用作自噬泡標(biāo)記物[9]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，自噬與角膜營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)[10]。此外，研究表明，LiCl可通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制TGFBI的表達(dá)[11]。然而，突變型TGFBI與角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞功能之間的關(guān)系尚未被研究。本研究通過(guò)TGFBI (G/A 371)的轉(zhuǎn)染，研究突變后角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)LiCl的敏感性。此外，我們發(fā)現(xiàn)，突變型TGFBI可促進(jìn)自噬，突變型TGFBI的變化與角膜營(yíng)養(yǎng)不良細(xì)胞的自噬增強(qiáng)有關(guān)。同時(shí)，我們證實(shí)，LiCl通過(guò)抑制自噬促進(jìn)突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖活性。

TGFBI作為一種分泌蛋白，可被TGF-β誘導(dǎo)[12]。研究表明，TGFBI蛋白在角膜營(yíng)養(yǎng)不良病變基質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)。TGFBI可通過(guò)MMP-1、MMP-3和TIMP-1促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而參與角膜的生理病理過(guò)程[13]。也有研究表明，在角膜成纖維細(xì)胞中，LiCl抑制TGF-β介導(dǎo)的TGFBI的表達(dá)[11]。研究也發(fā)現(xiàn)，角膜細(xì)胞在受到損傷刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生TGFBI，此外，角膜移植術(shù)和準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)后的GCD患者中也有TGFBI產(chǎn)生[14]。我們的研究進(jìn)一步證實(shí)，與野生型TGFBI相比，突變型TGFBI對(duì)角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖活性的抑制作用更加強(qiáng)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，野生型TGFBI不能誘導(dǎo)角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞自噬，而突變型TGFBI可顯著誘導(dǎo)角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞自噬。因此，這些結(jié)果表明TGFBI突變促進(jìn)角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞自噬。

圖2TGFBI過(guò)表達(dá)抑制角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞活性A：Western-blot法檢測(cè)TGFBI與LC3蛋白的表達(dá)；B：CCK-8法檢測(cè)TGFBI過(guò)表達(dá)對(duì)角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞活性的影響。aP<0.05vs空載體轉(zhuǎn)染組；cP<0.05vs野生型TGFBI組。

圖3LiCl對(duì)角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞活性的影響。

圖4LiCl對(duì)突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞中TGFBI表達(dá)的影響A： LiCl作用濃度對(duì)突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞中TGFBI表達(dá)的影響；B: LiCl作用時(shí)間對(duì)突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞中TGFBI表達(dá)的影響。

圖5LiCl對(duì)突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞自噬和活性的影響A：LiCl對(duì)突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞LC3表達(dá)的影響；B：LiCl對(duì)突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞活性的影響。NC: 未經(jīng)LiCl處理的突變型細(xì)胞對(duì)照組。aP<0.05vs未經(jīng)LiCl處理的突變型細(xì)胞對(duì)照組。

LiCl作為GSK-3抑制劑，可抑制GSK-3磷酸化。研究表明，LiCl可參與多種生理調(diào)控過(guò)程，如基因表達(dá)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及糖原合成等[15]。最近的研究也表明，LiCl下調(diào)原發(fā)性角膜成纖維細(xì)胞中TGFBI的表達(dá)水平，并促進(jìn)自噬[16]。本研究進(jìn)一步證明，LiCl可抑制突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞中TGFBI的表達(dá)水平，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。LiCl也可抑制突變型TGFBI轉(zhuǎn)染的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞自噬，并促進(jìn)細(xì)胞增殖活性。提示LiCl可作為治療角膜營(yíng)養(yǎng)不良的潛在治療靶點(diǎn)。