響應(yīng)面分析法優(yōu)化一株窖泥源酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）RL1菌株產(chǎn)丁酸發(fā)酵培養(yǎng)基

彭志云，趙 東，胡曉龍，何培新，張 勇，鄭 燕，牛廣杰

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001；3.河南省百泉春酒業(yè)有限公司，河南新鄉(xiāng) 453000）

丁酸（Butyric Acid）是一種重要的四碳短鏈有機酸，廣泛地應(yīng)用于化工、食品和制藥等行業(yè)。丁酸及其衍生物有多種用途，比如，丁酸可作為生產(chǎn)塑料和纖維制品的添加劑以增加其柔韌性、疏水性和耐光性[1]，也可以通過生物轉(zhuǎn)化為丁醇來緩解石油能源枯竭和日益增長的需求壓力，是一種具有巨大潛力的能源物質(zhì)；丁酸酯可作為飲料、食品以及化妝品中的果味香料[2]；丁酸在胰島素抵抗以及血紅蛋白病和直腸癌的治療等方面的應(yīng)用具有很大潛力[3-5]。厭氧條件下，丁酸可以由不同種屬細(xì)菌菌株產(chǎn)生，而梭菌屬由于具有較高的丁酸產(chǎn)率和產(chǎn)量被選作丁酸生產(chǎn)的優(yōu)勢種屬，目前用于工業(yè)化研究的梭菌屬細(xì)菌主要有C.tyrobutyricum[6-12]、C.butyricum[13-15]和C.thermobutyricum[16]，而C.tyrobutyricum因能夠產(chǎn)生高濃度丁酸且具有高酸耐受性、高選擇性等優(yōu)勢，成為丁酸工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)研究的最佳菌株。

響應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)是一種開發(fā)、改進和優(yōu)化多個變量對目標(biāo)物響應(yīng)變化的有力工具，它將統(tǒng)計學(xué)與數(shù)學(xué)相結(jié)合，通過建立和分析回歸方程來量化目標(biāo)產(chǎn)物特性與過程變量之間的函數(shù)關(guān)系[17]。與單因素試驗和正交試驗相比，RSM 不僅能夠研究變量之間的交互作用，而且因為試驗次數(shù)少、周期短、回歸方程精確度高等優(yōu)勢廣泛地應(yīng)用于生物、化工、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

培養(yǎng)基是微生物生長和發(fā)酵的基礎(chǔ)，培養(yǎng)基中的成分和濃度對丁酸的生產(chǎn)具有很大影響，本研究采用響應(yīng)面法來優(yōu)化C.tyrobutyricumRL1 發(fā)酵培養(yǎng)基來提高丁酸的產(chǎn)量，首先通過Plackett-Burman設(shè)計對培養(yǎng)基中的9 個主要因素進行篩選，找出影響丁酸產(chǎn)量的顯著因素，再利用最陡爬坡實驗逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最后通過Box-Behnken 設(shè)計及響應(yīng)值分析來確定顯著影響因素的最佳濃度，從而獲得C.tyrobutyricumRL1的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 供試菌株

C.tyrobutyricumRL1，本實驗室前期從窖泥中分離保存。

1.1.2 主要試劑

丁酸、2-乙基丁酸（色譜純），購自日本TCI 公司；其余試劑均為市售分析純。

1.1.3 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS），上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺（SW-CJ-ID 型），蘇州凈化設(shè)備有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋（C-11）、培養(yǎng)袋（C-41），日本三菱；智能生化培養(yǎng)箱（SHP-250），上海鴻都電子科技有限公司；電子天平（ME204E），梅特勒-托利多儀器有限公司；離心機TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠；氣相色譜儀（7820A）和HP-INNOWAX 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.255 mm×0.25 μm），美國安捷倫公司。

1.1.4 培養(yǎng)基的制備

種子活化培養(yǎng)基：即增強梭菌培養(yǎng)基（RCM 培養(yǎng)基），參照Hu[18]文獻中報道的方法配制。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，酵母粉5，蛋白胨5，氯化鈉5，乙酸鈉3，磷酸氫二鉀2.5，七水合硫酸鎂0.6，硫酸銨3，七水合硫酸亞鐵0.03，硫代乙醇酸鈉0.5，碳酸鈣5，pH6.8，121 ℃滅菌20 min，培養(yǎng)基中葡萄糖和碳酸鈣均與其他組分分開滅菌，于接種前加入。

1.2 試驗方法

1.2.1 RL1菌株種子的活化和培養(yǎng)方法

取-20 ℃甘油保藏的菌懸液300 μL 接種于裝有10 mL 種子活化培養(yǎng)基的試管中，于添加除氧劑的厭氧袋中34 ℃厭氧活化培養(yǎng)24 h，作為一級種子。將一級種子以3 %（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接至工作體積為100 mL 且裝液量同為100 mL 的厭氧瓶中（在RL1 產(chǎn)氣后接入無菌輸液管用于排氣），34 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，作為二級種子。將活化好的二級種子以3 %（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接至上述同樣條件的厭氧瓶中，34 ℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h。

1.2.2 發(fā)酵液前處理

取培養(yǎng)72 h 的發(fā)酵液15 mL，10000 r/min 離心10 min 去除菌絲體及碳酸鈣，取10 mL 稀釋適當(dāng)倍數(shù)的上清液，加25 μL 72 %硫酸進行酸解，使上清液中的有機酸游離出來，加入40 μL 2-乙基丁酸作為內(nèi)標(biāo)充分混勻，乙醚萃取，再用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾即得待測液。

1.2.3 發(fā)酵液中丁酸濃度的定量分析

發(fā)酵液中丁酸濃度的檢測采用氣相色譜（GC）和內(nèi)標(biāo)法進行定量分析。

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用RCM 培養(yǎng)基準(zhǔn)確配制50 mg/mL 的丁酸母液，并依次稀釋配成8 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液（每個濃度平行3次）。每個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液取10 mL，加入40 μL 2-乙基丁酸（內(nèi)標(biāo)）充分混勻，乙醚萃取，經(jīng)孔徑為0.22 μm 微孔濾膜過濾，上樣。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，丁酸與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.3.2 色譜條件

采用安捷倫7820A 氣相色譜儀進行丁酸濃度檢測。色譜條件參照陳興杰等的報道[19]并稍作修改：進樣口溫度200 ℃，柱箱起始溫度100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 的升溫速率升溫至220 ℃，保持2 min。檢測器溫度250 ℃；氣體流量：氫氣35 mL/min，空氣400 mL/min，尾吹氣20 mL/min；進樣方式：分流進樣，分流比為20∶1；進樣體積：1 μL。

1.2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗設(shè)計

1.2.4.1 Plackett-Burman設(shè)計

利用Plackett-Burman 設(shè)計考察基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的9 個成分對RL1 產(chǎn)丁酸的影響。通過Design-Expert.8.05b 軟件對試驗進行設(shè)計，選取試驗次數(shù)N=12 的設(shè)計方案，考察因素及編碼值分別為葡萄糖(X1)、酵母粉(X2)、蛋白胨(X3)、乙酸鈉(X4)、氯化鈉(X5)、七水合硫酸鎂(X6)、硫酸銨(X7)、七水合硫酸亞鐵(X8)和碳酸鈣(X9)，每個因素選取高低兩個水平，分別用+1和-1表示。具體試驗設(shè)計方案見表1。

1.2.4.2 最陡爬坡試驗

響應(yīng)面擬合方程需要建立在最佳值區(qū)域附近才能充分反映真實情形。最陡爬坡試驗是一種能夠快速有效地接近最佳響應(yīng)區(qū)域的試驗方法，它以Plackett-Burman 實驗擬合模型為基礎(chǔ)，根據(jù)顯著因素效應(yīng)的正負(fù)及大小來設(shè)定爬坡方向及變化步長，而其他非顯著因素既可根據(jù)效應(yīng)的正負(fù)和大小設(shè)定（例如表現(xiàn)為正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值），也可從經(jīng)濟角度出發(fā)選取較低值。

1.2.4.3 Box-Behnken設(shè)計

響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology，RSM)是一種解決多變量問題的常用統(tǒng)計方法，它通過合理的試驗設(shè)計得出相應(yīng)的數(shù)據(jù)并建立多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系從而確定最佳工藝參數(shù)。

根據(jù)Plackett-Burman 試驗和最陡爬坡試驗找出試驗的顯著因素與水平，采用Box-Benhnken 設(shè)計對發(fā)酵培養(yǎng)基組分進行響應(yīng)面分析試驗。每個因素取低中高3 個水平，編碼為(-1，0，1)，試驗的設(shè)計及結(jié)果分析均采用軟件Design-Expert.8.05b。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將配制好的不同濃度的丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按照上述方法處理并進行氣相色譜檢測，每個濃度做3 個平行樣品。取丁酸和2-乙基丁酸峰面積比的平均值，以丁酸濃度（g/L）為縱坐標(biāo)，丁酸與2-乙基丁酸的峰面積之比(A/A)為橫坐標(biāo)作圖（圖1），得到丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5.9716x+0.4495（R2=0.9987,n=5）。

圖1 丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 Plackett-Burman試驗篩選顯著影響因素

把發(fā)酵液中的丁酸濃度（g/L）作為因變量，采用Plackett-Burman 試驗研究培養(yǎng)基中各組分對RL1 產(chǎn)丁酸的影響，篩選出對丁酸生成影響顯著的因素。試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。利用Design-Expert 8.05b 軟件對表1 結(jié)果進行統(tǒng)計分析，Plaekett-Burman 試驗中各因素水平的濃度以及顯著性分析結(jié)果如表2 所示。由表中信息可知，整體模型顯著，且在α=0.05 的顯著水平上，對丁酸生成影響顯著的3 個因素分別是葡萄糖(X1)、碳酸鈣(X9)、蛋白胨(X3)。選取這3個因素進行下一步操作試驗。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果

表2 Plackett-Burman試驗結(jié)果分析

2.3 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果

對Plackett-Burman 的試驗結(jié)果分析找出對丁酸生成影響不顯著的因素，其中起正效應(yīng)作用的酵母粉、乙酸鈉和氯化鈉取高水平值，起負(fù)效應(yīng)的七水合硫酸鎂、硫酸銨和七水合硫酸亞鐵取低水平值。對丁酸生成具有顯著正效應(yīng)作用的葡萄糖、碳酸鈣和蛋白胨的變化方向以及步長的設(shè)計及結(jié)果見表3。

2.4 Box-Behnken設(shè)計篩選顯著因素的最佳濃度

2.4.1 Box-Benhnken試驗設(shè)計及方差分析

通過Plackett-Burman 試驗確定對丁酸生成影響顯著的因素，再由最陡爬坡試驗確定其接近響應(yīng)值區(qū)時的濃度，最后采用Box-Benhnken 試驗設(shè)計進行響應(yīng)面分析，顯著因素的水平見表4，Box-Behnken試驗設(shè)計表及結(jié)果見表5。

表3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果 (g/L)

表4 響應(yīng)面因素設(shè)計水平表

以發(fā)酵液中丁酸濃度為響應(yīng)值，利用Design-Expert.8.05b 軟件對表5 中的試驗結(jié)果進行二次回歸分析，得到的回歸分析模型方程為：

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計表及結(jié)果

該模型可信度分析結(jié)果及模型回歸方程的方差分析分別見表6和表7。

表6 模型可信度分析

表7 回歸方程的方差分析表

模型可信度分析見表6，其中決定系數(shù)R2=0.9921，表明該模型可以解釋99.21 %試驗中響應(yīng)值的變化，方程擬合度較高。變異系數(shù)可以衡量試驗中各觀測值變異程度的大小，其值越低，試驗的可靠性越高。本試驗中CV=1.27%，數(shù)值較低，說明試驗操作的準(zhǔn)確度較高，操作可信。信噪比是判斷模型是否能夠提供充足信息以進行數(shù)據(jù)分析的一個重要參數(shù)，當(dāng)信噪比大于4 時，可以認(rèn)為模型能提供足夠的信號，本試驗中信噪比為24.021，符合分析所需要求。綜上表明，該模型可信度較高，可以用來分析和預(yù)測RL1的最佳培養(yǎng)基成分。

由表7 可知，該多元二次回歸方程模型的顯著性檢驗P=0.0001，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.05，表明該模型具有良好的統(tǒng)計學(xué)意義。自變量X1、X2及二次項X1X2、X2X3、X12、X22、X32相關(guān)系數(shù)的P＜0.05，表明這些因素以及因素之間的交互作用會顯著影響發(fā)酵液中丁酸的生成。失擬項代表試驗數(shù)據(jù)與模型的擬合程度，本試驗P=0.5439＞0.05，失擬不顯著，因此該回歸方程可以代替真實數(shù)據(jù)對試驗結(jié)果進行分析。

2.4.2 響應(yīng)面與等高線

保持3 個因素中任一因素處于中間值不變，可以分析剩余兩個因素之間的相互作用。利用Design-Expert.8.05b 軟件繪制響應(yīng)面分析圖及等高線，葡萄糖與蛋白胨、葡萄糖與碳酸鈣以及蛋白胨與碳酸鈣之間的交互作用對響應(yīng)值的影響分別見圖2、圖3、圖4。

葡萄糖是RL1 發(fā)酵產(chǎn)丁酸的物質(zhì)基礎(chǔ)。由圖2、圖3 可知，在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵液中的丁酸濃度隨著葡萄糖濃度的增加不斷升高，當(dāng)葡萄糖濃度大于85.29 g/L時，丁酸濃度不再升高且隨著葡萄糖濃度的增加逐漸降低，丁酸的合成受到抑制。其原因可能是，RL1 主要利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，葡萄糖濃度越高，對丁酸的生成越有利，但隨著發(fā)酵過程中丁酸濃度的不斷增加，培養(yǎng)基中的pH 值一直降低，當(dāng)pH 值降低到某個特定值時，菌體的生長以及代謝產(chǎn)物的生成開始受到抑制，而且這種抑制作用隨著發(fā)酵的進行不斷增強。此外，葡萄糖的過度代謝也會加速其他酸性副產(chǎn)物（如乙酸等）的積累，導(dǎo)致pH值迅速降低。

圖2 葡萄糖和蛋白胨對丁酸生產(chǎn)影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖3 葡萄糖和碳酸鈣對丁酸生產(chǎn)影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖4 蛋白胨和碳酸鈣對丁酸生產(chǎn)影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

氮源是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)、核酸及其他含氮化合物的基礎(chǔ)，在微生物生長代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。蛋白胨含有豐富的氮源、氨基酸等，是微生物發(fā)酵常用且重要的氮源物質(zhì)，但是過量的蛋白胨也會抑制丁酸的生成，由圖2和圖4可知，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛却笥?.37 g/L時，隨著蛋白胨濃度的增加，丁酸濃度逐漸降低。

微生物生長過程中pH 值對菌株生長和代謝有至關(guān)重要的作用。隨著RL1 利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸的進行，培養(yǎng)基中的pH 值開始逐漸降低，菌體生長越旺盛，產(chǎn)酸越多，pH 值降低得越快，因此在培養(yǎng)基中添加一定量的碳酸鈣，不僅可以給微生物提供微量鈣元素還可以對發(fā)酵過程中的pH 值的變化起緩沖作用，避免發(fā)酵液pH 值劇烈降低。由圖3、圖4 可知，當(dāng)碳酸鈣的添加量低于11.6 g/L 時，隨著其添加量的增加，丁酸濃度逐漸增加，當(dāng)達(dá)到11.6 g/L后，丁酸濃度不再上升，并開始降低，表明此時的碳酸鈣已經(jīng)接近最大緩沖能力，增加碳酸鈣的添加量不僅不能緩解pH 值的降低，微溶于發(fā)酵液中過量的鈣離子也開始對丁酸的生成形成抑制作用。

綜合以上分析，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖、蛋白胨、碳酸鈣的添加量分別為85.29 g/L、9.37 g/L 和11.6 g/L時，丁酸濃度達(dá)最大值。應(yīng)用軟件深入分析，預(yù)測在這種情況下發(fā)酵液中丁酸的最大濃度為23.09 g/L。為檢驗?zāi)Ｐ涂煽啃?，分別在優(yōu)化前和優(yōu)化后的培養(yǎng)基上進行重復(fù)試驗，得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上RL1 所產(chǎn)丁酸濃度為14.23 g/L，而最佳培養(yǎng)基上的丁酸濃度為22.96 g/L。試驗驗證結(jié)果與預(yù)測值接近，說明該模型可以真實地反映培養(yǎng)基中的主要組分對丁酸生成量的影響，且優(yōu)化后較優(yōu)化前丁酸濃度提高了61.35%。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法對RL1 產(chǎn)丁酸培養(yǎng)基進行優(yōu)化。首先采用Plackett-Burman 設(shè)計對培養(yǎng)基中的葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、乙酸鈉、氯化鈉、七水合硫酸鎂、硫酸銨、七水合硫酸亞鐵、碳酸鈣9 個因素進行篩選，確定出葡萄糖、碳酸鈣和蛋白胨是影響丁酸生成的顯著因素。改變3 種顯著因素的濃度，利用最陡爬坡路徑逼近最大產(chǎn)酸響應(yīng)區(qū)域，通過Box-Behnken 設(shè)計及其響應(yīng)值分析確定出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L)：葡萄糖85.29，酵母粉7.5，蛋白胨9.37，氯化鈉7.5，乙酸鈉4.5，磷酸氫二鉀2.5，硫酸鎂0.3，硫酸銨1.5，硫酸亞鐵0.015，硫代乙醇酸鈉0.5，碳酸鈣11.6，此時丁酸濃度最大預(yù)測值為23.09 g/L。對模型準(zhǔn)確性進行試驗驗證，得到的實際濃度為22.96 g/L，培養(yǎng)基優(yōu)化后的丁酸濃度較優(yōu)化前的14.23 g/L提高了61.35%，優(yōu)化效果顯著。