多菌種純種微生物在綿柔型芝麻香白酒中的應(yīng)用

張建良，于飛躍，楊海波，李 行

（江蘇乾隆江南酒業(yè)股份有限公司，江蘇宿遷 201700）

白酒是我國的傳統(tǒng)優(yōu)勢食品，產(chǎn)業(yè)規(guī)模較大、經(jīng)濟(jì)貢獻(xiàn)率較高，是食品工業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。近年來，我國白酒行業(yè)盡管受到諸多因素的影響，但仍保持了較快的發(fā)展勢頭，未來白酒產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展仍將保持穩(wěn)定的增長[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人際交往越為密切和頻繁。這種背景下促進(jìn)了交際主平臺餐飲業(yè)的爆發(fā)性成長。無酒不成席，酒不僅是傳統(tǒng)意義上的一種飲用享受(享受型消費(fèi))，也是中國人社交禮儀的重要道具(交際型消費(fèi))。近幾年，隨著消費(fèi)者健康保健意識的增強(qiáng)，白酒消費(fèi)已明顯出現(xiàn)低度化、清淡化、健康化、綿柔化的趨勢，正是這種飲酒與健康的矛盾，給綿柔型芝麻香白酒帶來了極大的發(fā)展機(jī)遇[2]。微生物菌群在白酒釀造過程中起著重要作用，它是酒體質(zhì)量、產(chǎn)量的重要保證。主要包含霉菌、細(xì)菌和酵母菌三大類[3-4]。本研究從芝麻香大曲、糧醅和酒醅中篩選分離出1 株耐高溫酵母和3 株高溫細(xì)菌，經(jīng)馴化和純菌種培養(yǎng)，用于綿柔型芝麻香白酒的制曲。又采用多糧高氮配料和高溫發(fā)酵工藝，促進(jìn)了功能因子的生成，提升了綿柔型芝麻香白酒酒體口感的綿柔度、豐滿度和綜合品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

樣本：用于菌株分離的芝麻香大曲、糧醅、酒醅，源于本公司。

原輔料：高粱、小麥、麩皮、大米、糯米、玉米等由本公司采購。

儀器設(shè)備：2 cm 50/30 μ m 固相微萃取三相頭divinylbenzene/carboxen/poly(dimethylsiloxane)(DVB/CAR/PDMS)購于上海Sigma-Aldrich 貿(mào)易有限公司；水為Milli Q 超純水(Millipore，Badford，MA，USA)；全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀(GC×GC-TOFMS，Pegasus 4D，LecoCorporation，USA)，其中GC × GC 系統(tǒng)由安捷倫7890N 氣相色譜和冷噴調(diào)制器KT-2001 組成，質(zhì)譜檢測器為美國LECO Pegasus 4D飛行時間質(zhì)譜。

1.2 試驗方法

1.2.1 優(yōu)勢菌株篩選

采用平板劃線法和稀釋涂布法：分離樣品經(jīng)富集培養(yǎng)，適當(dāng)稀釋后平板劃線或稀釋涂布，挑選單菌落。酵母菌篩選時富集溫度為45 ℃，為避免細(xì)菌和霉菌之間的干擾，富集時在培養(yǎng)基中分別加入100 mg/L 的氨芐青霉素和制霉素。細(xì)菌富集溫度為65 ℃。

1.2.2 強(qiáng)化制曲

優(yōu)勢菌株分別進(jìn)行純培養(yǎng)，按比例混合復(fù)配，接入制曲料中，按傳統(tǒng)方法進(jìn)行制曲，制曲溫度控制在65～70 ℃。

1.2.3 多糧高溫發(fā)酵

高粱、小麥、麩皮、大米、糯米、玉米按比例混合，接入純培養(yǎng)技術(shù)制成的綿柔型芝麻香白酒復(fù)合多微功能曲，通風(fēng)堆積發(fā)酵48 h，轉(zhuǎn)入窖池發(fā)酵36 d。

1.2.4 風(fēng)味物質(zhì)成分分析

頂空固相微萃取(HS-SPME)：取2 mL 白酒樣品，8 mL 超純水及3.0 g 氯化鈉于20 mL 頂空瓶混合均勻，用帶PTFE/藍(lán)色硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封后由MPS 2 進(jìn)行HS-SPME，實(shí)驗過程參照文獻(xiàn)方法[5]。HS-SPME 萃取及進(jìn)樣過程由Gerstel 公司多功能自動進(jìn)樣系統(tǒng)(MPS 2)完成，萃取頭為2 cm 50/30 μ m DVB/CAR/PDMS 三相萃取頭。萃取溫度50 ℃，樣品平衡時間5 min，萃取時間50 min，乳化器轉(zhuǎn)速500 r/min。完成萃取過程后萃取頭于GC 進(jìn)樣口250 ℃解吸附5 min，進(jìn)行GC×GC-TOFMS分析。

全二維氣相色譜、飛行質(zhì)譜（GC×GC-TOFMS）分析：一維色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm ID，0.25 μ m)，二維色譜柱Rxi-200(1.5 m × 0.18 mm ID,0.2 μ m)色譜條件：GC 進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣模式采用不分流模式進(jìn)行。第一維柱溫箱升溫程序：起始溫度40 ℃保持2 min 后，以5 ℃/min 升溫至230 ℃保持5 min。調(diào)制器調(diào)制時間為4 s，熱調(diào)制時間為1 s，調(diào)制補(bǔ)償溫度為20 ℃。第二維柱溫箱升溫程序：起始溫度60 ℃保持2 min，后以5 ℃/min 升溫至250 ℃保持5 min。樣品運(yùn)行采用恒流模式，載氣為高純氦氣(純度＞99.9995 %)，流速為1 mL/min。

圖1 優(yōu)勢菌株分離

質(zhì)譜條件：EI 離子源，電壓為70 eV，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為280 ℃。檢測器電壓為1365 V。采集質(zhì)量數(shù)范圍為35～500 amu，采集頻率為100 spectrum/s。數(shù)據(jù)采集由LECO 公司Pegasus 4D工作站控制。

GC×GC-TOFMS 數(shù)據(jù)處理：實(shí)驗采集的TOFMS 數(shù)據(jù)由美國力可（LECO）公司ChromaTOF工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，自動識別信噪比大于50 的色譜峰后進(jìn)行自動積分解卷積和質(zhì)譜庫比對，質(zhì)譜庫為NIST 14 和Wiley 9，所有比對結(jié)果自動生成峰形圖譜。峰形圖譜經(jīng)過進(jìn)一步人工解譜及同系物二維色譜出峰規(guī)律比對驗證后作為初步鑒定結(jié)果。最后剔除烷烴類等沒有風(fēng)味貢獻(xiàn)的化合物，選擇相似度大于800，反相似度大于800，可能性大于4000的化合物作為最終鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與分離

芝麻香大曲、糧醅和酒醅為分離樣品，采用高溫富集馴化、平板稀釋劃線的方法進(jìn)行菌株的分離，獲得了1 株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、1 株耐酸乳桿菌(Lactobacillus acetotolerans)、1株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和1 株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），部分結(jié)果見圖1。

該酵母菌耐高溫，可以在50 ℃生長，產(chǎn)醇產(chǎn)酯能力強(qiáng)；兩株芽孢桿菌可以在70 ℃生長，產(chǎn)淀粉酶活力較高；乳酸菌具有較高的耐酸能力。微生物菌群是釀造的靈魂，黃淮流域獨(dú)特的區(qū)域優(yōu)勢造就了獨(dú)特的釀造微生物。上述核心功能微生物分離于芝麻香的大曲、糧醅和酒醅，將其應(yīng)用到綿柔型芝麻香白酒的生產(chǎn)中，有利于綿柔型芝麻香白酒獨(dú)特風(fēng)格和功能因子的形成，提升產(chǎn)品品質(zhì)。

2.2 多菌株純培養(yǎng)強(qiáng)化制曲

將上述4 株菌分別進(jìn)行純培養(yǎng)，按一定比例混合，與傳統(tǒng)芝麻香麩曲工藝相結(jié)合，進(jìn)行強(qiáng)化制曲?；诩兣囵B(yǎng)菌株的耐熱特性，制曲溫度可以從傳統(tǒng)的62 ℃提高到65～70 ℃，有效抑制了雜菌的生長，為綿柔型芝麻香白酒典型風(fēng)味物質(zhì)和功能因子的形成奠定了生態(tài)基礎(chǔ)。綿柔型芝麻香白酒復(fù)合多微功能曲，是多菌種純培養(yǎng)技術(shù)的成功應(yīng)用，它能夠使釀造性能穩(wěn)定，精準(zhǔn)控制微生物，大幅度提高綿柔型芝麻香白酒酒體口感的綿柔度、豐滿度，調(diào)控白酒質(zhì)量，增加白酒風(fēng)味物質(zhì)和功能因子，提升白酒口感舒適度和利于健康的有益成分。

2.3 多糧高溫發(fā)酵

以高粱和小麥為主原料，麩皮、大米、糯米、玉米為輔料合理配比，接入純培養(yǎng)技術(shù)制成的綿柔型芝麻香白酒復(fù)合多微功能曲，高溫兩段式發(fā)酵。

第一段采用開放式發(fā)酵（堆積發(fā)酵），更大限度的增加微生物與空氣的接觸面，使微生物代謝更加旺盛，保證重要風(fēng)味物質(zhì)及其前體物質(zhì)的形成。第二階段采用密閉式發(fā)酵（窖池發(fā)酵），通過控制入池溫度、分層踩窖及使用窖池專用布泥封窖池等方式，優(yōu)化入池工藝參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對酒醅功能微生物結(jié)構(gòu)和功能的定向調(diào)控，保證綿柔型芝麻香白酒獨(dú)特風(fēng)格的形成。

經(jīng)實(shí)踐表明，輔料整粒投料有助于提升酒醅的骨力，有利于促進(jìn)微生物的生長和發(fā)酵，并且將原輔料用熱水浸泡，有助于原輔料吸水糊化，在蒸煮時，采用谷糠放在原輔料上一起清蒸，能夠有效去除原輔料上的邪雜味，同時原料也達(dá)到了一定程度的糊化，利于培菌糖化。堆積結(jié)束后，溫度設(shè)置為40～45 ℃，有助于正常發(fā)酵、產(chǎn)酯，產(chǎn)出的酒與現(xiàn)有的芝麻香型相比，入口圓潤醇和，無雜味，細(xì)膩豐滿，具有明顯的感官特征和獨(dú)特的個性。采用熱水泡糧及原料清蒸，有助于高粱淀粉吸水糊化，蒸煮時易透心，有利于醇甜物質(zhì)生成，能夠有效排除因混合蒸燒而帶來的生料味及異雜味，又可以提升酒質(zhì)的純凈度和口感的爽凈度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用多菌株純培養(yǎng)高溫發(fā)酵工藝，產(chǎn)出的酒香氣幽雅飄逸，入口綿柔醇厚，無雜味，具有明顯的感官特征和獨(dú)特的個性。

2.4 風(fēng)味物質(zhì)成分分析

二維氣相色譜解決了一維色譜峰容量低、分離度不好的問題。本文采用全二維氣相色譜-高分辨質(zhì)譜，從綿柔型芝麻香白酒中共檢測到517 種揮發(fā)性組分，其中酯類145 種，醇類69 種，酸類25 種，醛、酮、縮醛類92 種，含氮組分25 種，呋喃類32 種，烯萜類17種，其他89種。

2.4.1 主要風(fēng)味物質(zhì)

白酒中的有機(jī)酸、醇、酯、醛酮成分是主要風(fēng)味物質(zhì)[6]。采用氣相色譜法分析綿柔型芝麻香白酒的揮發(fā)性成分，結(jié)果見表1。由表1 可以看出，綿柔型芝麻香白酒有機(jī)酸種類和含量較高，總醇的含量較高，醛、酮類化合物的總量較高，酯類化合物種類多。較高的多元醇含量與適當(dāng)?shù)乃岷渴蔷d柔型芝麻香白酒典型風(fēng)格的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.4.2 含硫化合物

揮發(fā)性含硫化合物由于其極低的香氣閾值和獨(dú)特的香氣特征，成為食品中一類十分重要的香氣物質(zhì)，在食品風(fēng)味化學(xué)研究中受到廣泛關(guān)注[7]。但由于揮發(fā)性含硫化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣，性質(zhì)不穩(wěn)定，大多在食品中濃度低，因此很難被檢測到。本文利用全二維氣相色譜-TOF 質(zhì)譜，采用頂空萃取進(jìn)樣的方式，從綿柔型芝麻香白酒中檢測到23 種含硫化合物，如表2 所示，其中17 號3，4-二甲基噻吩首次從白酒中檢測到。這些硫化物的檢出對進(jìn)一步研究揮發(fā)性組分對構(gòu)成綿柔型芝麻香白酒獨(dú)特的香氣特征具有重要作用。

綿柔型芝麻香白酒的指紋譜見圖2。從指紋譜分析可以看出，綿柔型芝麻香白酒中的揮發(fā)性成分與清香型、濃香型和醬香型相似，包含了大部分含硫指紋譜峰，與醬香型白酒相似度更高。圖中的指紋譜峰標(biāo)號為表2 中含硫化合物的序號。盡管綿柔型芝麻香白酒與醬香型白酒揮發(fā)性成分相似，但是含硫指紋譜色譜峰更加豐富，同時與其他香型的指紋譜峰相比，相同的指紋譜如3 號、6 號、8 號和13 號，綿柔型芝麻香中的含量和比例與其他3 種香型的白酒也不同。正是由于所含有的特征組分和含量的不同，導(dǎo)致綿柔型芝麻香白酒特殊的口感和功效。

表1 綿柔型芝麻香白酒主要風(fēng)味成分分析表 (mg/L)

表2 綿柔型芝麻香白酒揮發(fā)性含硫組分表

圖2 不同香型白酒揮發(fā)性化合物指紋圖譜比較

2.4.3 萜烯類化合物和吡嗪類化合物

萜烯類化合物既是構(gòu)成白酒香氣特征的一類重要香氣化合物，也是白酒中重要的生理活性物質(zhì)，同時作為功能性組分，具有較強(qiáng)的抑菌活性和抗凝血活性[8]。吡嗪類化合物是白酒中含氮化合物的主要成分，同時也是白酒香氣成分的重要組成物質(zhì)，雖然吡嗪類化合物在白酒中含量甚微，但它具有預(yù)防心血管疾病作用，對白酒的保健功能起著重要作用[9-10]。本文對綿柔型芝麻香白酒中的烯萜類和吡嗪類組分進(jìn)行了定量分析，結(jié)果如圖3 所示。從圖3 可看出，古云烯、長葉烯、石竹烯、丁子香烯是構(gòu)成綿柔型芝麻香白酒的主要烯萜成分，總含量為200 μ g/L。2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基、5-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和四甲基吡嗪為主要的吡嗪類化合物，總含量為328 μ g/L。

3 結(jié)論

采用多菌株純培養(yǎng)，多糧高氮配料，高溫兩段式發(fā)酵生產(chǎn)綿柔型芝麻香白酒，并對產(chǎn)品的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析，研究得出以下結(jié)論：

3.1 應(yīng)用多菌種純培養(yǎng)技術(shù)，釀酒酵母、耐酸乳桿菌、地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌經(jīng)馴化、純菌種培養(yǎng)后按一定比例混合，可以精準(zhǔn)控制微生物，穩(wěn)定釀造性能，促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)和功能因子的形成。

圖3 綿柔型芝麻香白酒主要萜烯類和吡嗪類物質(zhì)含量分析

3.2 多糧配比，尤其是小麥、麩皮和糯米的添加，形成了微量成分的多樣性，高氮配料可能對吡嗪類化合物的生成有促進(jìn)作用。

3.3 綿柔型芝麻香白酒的風(fēng)味物質(zhì)雖然與醬香型白酒更接近，但含硫化合物、萜烯類化合物和吡嗪類化合物的種類和含量并不相同。