血清異常糖鏈糖蛋白聯(lián)合尿細(xì)胞角蛋白-19檢測(cè)對(duì)膀胱癌早期診斷的價(jià)值

吳萬(wàn)文，呂蔡，劉振湘，徐海霞，張淑芳

膀胱癌是世界第七大常見(jiàn)癌癥，是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤之一［1］。男性占總發(fā)生率的80%左右［2-3］。在膀胱癌早期診斷上，膀胱鏡檢查及尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)被公認(rèn)為臨床上的金標(biāo)準(zhǔn)；但膀胱鏡檢查存在創(chuàng)傷大，尿脫落細(xì)胞學(xué)存在敏感性低等局限性，誤診、漏診現(xiàn)象明顯，致患者常錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)［4］。臨床上膀胱癌的病理分期及細(xì)胞分級(jí)對(duì)于該病的診斷、治療及預(yù)后判斷很重要，但目前尚缺乏一種真正能應(yīng)用于臨床的生物學(xué)標(biāo)志物。異常糖鏈糖蛋白又稱(chēng)腫瘤異常蛋白（TAP），是腫瘤細(xì)胞新陳代謝過(guò)程中釋放到血液中的一類(lèi)異常糖基化蛋白，已被證明其與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系密切［5-6］。細(xì)胞角蛋白（CK）-19是一種水溶性酸性多肽分子，主要分布于上皮細(xì)胞中，當(dāng)膀胱上皮細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，CK-19便被釋放到尿液中［7］。本研究旨在探討血清TAP聯(lián)合尿CK-19檢測(cè)對(duì)膀胱癌早期診斷的應(yīng)用價(jià)值，為膀胱癌早期診斷提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2015年6月—2018年9月于?？谑腥嗣襻t(yī)院泌尿外科確診的膀胱癌患者（膀胱癌組）50例，男38例，女12例，平均年齡（57.84±10.39）歲；其中病理檢測(cè)結(jié)果根據(jù)WHO 2004分級(jí)系統(tǒng)分為乳頭狀瘤8例，低度惡性?xún)A向的乳頭狀瘤15例，低級(jí)別膀胱癌11例和高級(jí)別膀胱癌16例。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，淺表性（Tis～T1期）膀胱癌27例，浸潤(rùn)性（T2～T4期）23例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均為首次經(jīng)病理學(xué)手段確診為膀胱癌。（2）受試前無(wú)相關(guān)手術(shù)治療史。（3）受試前1個(gè)月內(nèi)未接受放、化療及其他治療。（4）配合并自愿完成所有檢測(cè)項(xiàng)目。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤、泌尿系惡性疾病、精神病等相關(guān)疾病的患者。（2）中途放棄，檢測(cè)數(shù)據(jù)不全者。選擇同期45例泌尿系良性疾病者為對(duì)照組，男32例，女13例，平均年齡（58.97±11.28）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：僅患尿道感染、尿路結(jié)石、慢性前列腺炎等泌尿系良性疾病，未患其他惡性腫瘤性疾病；配合并自愿完成所有檢測(cè)項(xiàng)目。2組性別構(gòu)成（χ2=0.292）、年齡（t=0.508）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究所有對(duì)象遵循自愿原則，均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑與儀器 血清TAP檢測(cè)試劑盒（凝集法）購(gòu)自浙江瑞生醫(yī)療科技有限公司；CK-19檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士康生物工程有限公司；顯微鏡購(gòu)自日本Olympus；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek。

1.3方法

1.3.1樣本采集 所有對(duì)象在采樣1周前均未行膀胱鏡檢、導(dǎo)尿、膀胱灌注等泌尿系侵入性操作。采集研究對(duì)象手指末端的2滴新鮮全血用于TAP檢測(cè)；同時(shí)采集新鮮尿液100～200 mL，新鮮尿液指無(wú)尿狀態(tài)下飲水500 mL，1～2 h后第1次膀胱排空的尿液。

1.3.2血清TAP檢測(cè) 取手指末端的2滴新鮮全血分別滴于玻片上，在玻片上推成約占玻片長(zhǎng)度2/3的兩片均勻血片，室溫下靜置15 min待干；后取TAP檢測(cè)試劑在2片血片上各均勻滴加3滴，室溫下靜置15 min待干；后于顯微鏡下觀察凝集物的大小并測(cè)量面積，記錄所觀察的最大凝集物面積代表該樣本TAP的水平。

1.3.3尿CK-19檢測(cè) 取收集的新鮮尿液于2 h內(nèi)嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測(cè)CK-19的水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。偏態(tài)分布計(jì)量資料采用M（P25，P75）表示，組間多重比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12組患者血清TAP及尿液CK-19水平比較 與對(duì)照組比較，膀胱癌組血清TAP及尿液CK-19水平均升高（均P＜0.01），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of the serum TAP and urinary CK-19 levels between the two groups表1 2組患者血清TAP及尿液CK-19水平比較

2.2二元Logistic回歸分析建立TAP與CK-19聯(lián)合診斷模型 以是否膀胱癌為因變量（是=1，否=0），TAP和CK-19為自變量，經(jīng)二元Logistic回歸分析建立膀胱癌TAP與CK-19聯(lián)合診斷模型：logit［TAP聯(lián)合CK-19］=-4.118+0.030×TAP+0.327×CK-19，作為膀胱癌早期診斷新指標(biāo)，見(jiàn)表2。

Tab.2 The results of binary Logistic analysis表2 二元Logistic回歸分析結(jié)果

2.3ROC曲線及診斷效能分析 TAP聯(lián)合CK-19檢測(cè)ROC的AUC值、約登指數(shù)均高于TAP和CK-19，提示TAP聯(lián)合CK-19診斷價(jià)值優(yōu)于兩者單獨(dú)檢測(cè)，見(jiàn)表3、4，圖1。

Tab.3 ROC curve analysis of early diagnostic indicators of bladder cancer表3 各膀胱癌早期診斷指標(biāo)ROC曲線結(jié)果分析

Tab.4 Comparison of efficacy of different methods in early diagnosis of bladder cancer表4 不同方法對(duì)膀胱癌早期診斷效能比較

Fig.1 The ROC curve of serum TAP,urine CK-19 and their combined detection圖1 血清TAP、尿CK-19及二者聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線

3 討論

目前，膀胱黏膜活檢以及輔助的尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)被認(rèn)為是膀胱癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)；然而，這些方法具有各自的局限性，因此尋找一種無(wú)創(chuàng)的早期診斷方法并對(duì)預(yù)后進(jìn)行評(píng)估顯得十分重要。近些年，越來(lái)越多的血清和尿液中的膀胱癌標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)。例如TAP、膀胱癌抗原、生存素、特異性核基質(zhì)蛋白4、CK-17、CK-19等［8］。而本研究通過(guò)二元Logistic回歸分析建立TAP與CK-19聯(lián)合診斷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAP聯(lián)合CK-19檢測(cè)的ROC曲線下面積及約登指數(shù)均高于TAP及CK-19單獨(dú)檢測(cè)的結(jié)果，提示兩者聯(lián)合檢測(cè)可作為膀胱癌早期診斷的新指標(biāo)，并能提升單一指標(biāo)檢測(cè)的診斷價(jià)值及效能。

致癌因素的刺激促進(jìn)原癌基因和抗癌基因的逐漸變異，繼而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生?；蛲蛔儗?dǎo)致了功能蛋白的變化，進(jìn)而導(dǎo)致一大類(lèi)不規(guī)則的糖鏈糖蛋白的產(chǎn)生［9］。其中一種是鈣-組蛋白復(fù)合物，另一種是糖鏈異常的糖蛋白，其主要分布在細(xì)胞膜上，是由變異基因翻譯后形成的功能異常的糖蛋白；與正常糖蛋白比較，其具有較長(zhǎng)的糖鏈和復(fù)雜的分支結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量也存在很大差異［10］。TAP是異常糖蛋白、鈣組蛋白以及細(xì)胞癌變后基因表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)合物，其可間接反應(yīng)癌細(xì)胞的數(shù)量和癌變程度。當(dāng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)到一定數(shù)量時(shí)，TAP會(huì)釋放到外周血中，通過(guò)凝集法被檢測(cè)出。祁潔等［11］證實(shí)，血清TAP檢測(cè)乳腺癌的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度均高于癌胚抗原和糖鏈抗原153，可作為乳腺癌早期篩查的重要指標(biāo)。吳永梅等［12］證實(shí)，TAP檢測(cè)是常見(jiàn)消化道腫瘤篩查、早期診斷及預(yù)后判斷的科學(xué)、有效的方法。劉麗燕等［13］證實(shí)，外周靜脈血TAP檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）敏感性較高，可用于患者的療效監(jiān)測(cè)和評(píng)估。本研究顯示，50例膀胱癌患者中有35例被檢測(cè)為真陽(yáng)性，仍有15例檢測(cè)為T(mén)AP陰性，筆者猜測(cè)可能存在以下幾個(gè)因素：（1）處于終末期的膀胱癌患者體內(nèi)蛋白質(zhì)水平較低，可導(dǎo)致分泌不規(guī)則的糖鏈糖蛋白的量顯著低于試劑盒的檢測(cè)范圍。（2）患者體內(nèi)癌細(xì)胞增殖不活躍，進(jìn)而導(dǎo)致不規(guī)則的糖鏈糖蛋白的分泌水平較低，而45例泌尿系良性疾病患者（對(duì)照組）有4例檢測(cè)為T(mén)AP陽(yáng)性，一定程度上可能反映了這4例患者潛在的患癌風(fēng)險(xiǎn)，但仍需進(jìn)一步檢測(cè)來(lái)確認(rèn)。

CK-19是分子質(zhì)量大約在40 ku的Ⅰ類(lèi)細(xì)胞角蛋白家族成員，是在早期發(fā)育過(guò)程中最早被發(fā)現(xiàn)的角蛋白。此外，許多癌前組織和惡性組織均發(fā)現(xiàn)CK-19的表達(dá)，例如肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌等，提示CK-19在多種癌癥的早期診斷方面可能具有潛在優(yōu)勢(shì)。CK-19陽(yáng)性的肝細(xì)胞癌被證明具有早期轉(zhuǎn)移、低分化與高侵襲性等惡性生物學(xué)特性，提示其對(duì)癌癥干細(xì)胞、血管生成、腫瘤細(xì)胞侵襲性以及凋亡的作用明顯［14］。郭曉斌等［15］證實(shí)，CK-19診斷老年早期NSCLC的敏感度為85.71%，特異度為82.50%，ROC曲線下面積為0.84，優(yōu)于癌胚抗原及鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原。晉學(xué)飛等［16］證實(shí)，人類(lèi)軟骨糖蛋白39與CK-19在膀胱癌患者的尿液中高表達(dá)，兩者聯(lián)合檢測(cè)有利于膀胱癌的早期診斷。呂慧匯［17］證實(shí)，在膀胱癌的早期診斷中，尿CK-19檢測(cè)的敏感度顯著高于傳統(tǒng)尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，且尿端粒酶、生存素聯(lián)合CK-19檢測(cè)與單指標(biāo)檢測(cè)比較能顯著提升檢測(cè)的敏感度和準(zhǔn)確性。Huang等［18］的Meta分析結(jié)果顯示，在1 262例膀胱癌患者中，血清CK-19檢測(cè)的敏感度為42%、特異度為94%，尿液CK-19檢測(cè)的敏感度為82%、特度為80%，兩者差異顯著；但ROC曲線下面積分別為0.88和0.87，差異不明顯，提示血清和尿液CK-19均可作為膀胱癌診斷的重要指標(biāo)。而本研究通過(guò)二元Logistic回歸分析建立TAP與CK-19聯(lián)合檢測(cè)的新診斷指標(biāo)，結(jié)果顯示兩者聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下面積、約登指數(shù)、敏感度和特異度均大于單指標(biāo)檢測(cè)的結(jié)果，提示兩者聯(lián)合檢測(cè)能提升膀胱癌早期診斷的價(jià)值及效能。

綜上所述，血清TAP及尿液CK-19在膀胱癌患者中高表達(dá)；且兩者聯(lián)合檢測(cè)能提升單指標(biāo)檢測(cè)的診斷價(jià)值及效能，有助于膀胱癌的早期診斷。但本研究仍存在樣本量偏少，試劑盒檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確的局限性。因此，血清TAP聯(lián)合尿液CK-19檢測(cè)在臨床上的推廣應(yīng)用仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本去證實(shí)。