HPLC測定水飛薊賓緩釋納米球的體外釋放度

梅康康，胡容峰

（1.安徽省兒童醫(yī)院，安徽 合肥 230051；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012）

水飛薊賓是從菊科植物水飛薊果實中提取分離得到的有效成分，臨床主要用于治療急慢性肝炎、各種肝損傷、肝纖維化和早期肝硬化等[1-2]。水飛薊賓療效好、毒性低，但水飛薊賓屬二氫黃酮醇類化合物，難溶于水，口服生物利用度低，極大地限制了其臨床療效[3-4]。已有研究者制備了具有生物可降解性的靜脈注射緩釋納米球制劑，以期達到在提高水飛薊賓的體外溶出和體內(nèi)吸收的同時，具備良好的肝靶向性的目的[5-6]。本研究建立了水飛薊賓緩釋納米球體外釋放過程中的含量測定方法，可為其體外研究提供有效的質(zhì)量控制手段。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AG285型電子天平（瑞典Mettler Toledo公司）；79-1型磁力攪拌器（江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；超濾離心管（截留分子量為3000，美國Millipore公司）；高效液相色譜儀（包括LC-20AB泵，SPD-M20A紫外檢測器及島津LCsolution色譜工作站，日本島津）；C18色譜柱（依利特，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 試藥

水飛薊賓對照品（江蘇先聲漢合制藥，純度99.94 %，批號：012308）；聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，LA/GA=75/25，MW=8600，合肥工業(yè)大學(xué)控釋藥物研究室，批號：071219）；泊洛沙姆（Lutrol?F68，德國BASF公司，批號：0401278）；水飛薊賓緩釋納米球膠體溶液（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，批號：080615）；甲醇為色譜純，丙酮等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 溶劑的確定 取水飛薊賓緩釋納米球膠體溶液及空白膠體溶液，分別加入不同種類和比例的溶劑進行考察。經(jīng)試驗優(yōu)選的方法為：取膠體溶液適量，加入兩倍體積的乙腈，溶解后用流動相稀釋定容即可。

2.1.2 色譜條件 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 3.0）配制：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加水900 ml，用稀磷酸調(diào)pH至3.0，用水稀釋至1000 ml。流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 3.0）（49:51）；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：288 nm；進樣量：20 μl。在此色譜條件下，水飛薊賓分離得到水飛薊賓a和水飛薊賓b兩個峰，兩峰均達到基線分離?？瞻?、空白加對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 專屬性色譜圖

2.1.3 標準曲線 精密稱取水飛薊賓對照品12.5 mg，置入50 ml量瓶，用甲醇溶解、稀釋并定容，作為儲備液。然后精密吸取不同體積的儲備液，用流動相稀釋成0.125，1.25，12.5，25，50，100 μg/ml的系列標準溶液，分別取20 μl進樣，在上述色譜條件下進樣測定，結(jié)果在0.125～100 μg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積（A）與藥物濃度（C）有良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=27 593C+1423.1，r=0.9999。

2.1.4 檢測限和定量限 精密稱取水飛薊賓對照品，用甲醇溶解并用流動相稀釋得到10.0 ng/ml的溶液，按2.1.2項色譜條件測定，得到水飛薊賓的峰高約為基線噪音的10倍。再精密量取該溶液2 ml，置入10 ml量瓶，流動相稀釋至刻度，得到水飛薊賓的峰高約為基線噪音的3倍。結(jié)果表明，水飛薊賓在該色譜條件下的檢測限為2.0 ng/ml，定量限為10 ng/ml。

2.1.5 精密度

2.1.5.1 日內(nèi)精密度 精密吸取2.1.3項下1.25 μg/ml水飛薊賓標準溶液，按2.1.2項色譜條件測定，同天連續(xù)進樣5次，結(jié)果峰面積平均值為33 586.556，RSD為1.14 %，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.1.5.2 日間精密度 精密吸取2.1.3項下1.25 μg/ml水飛薊賓標準溶液，按2.1.2項色譜條件測定，隔天進樣1次，共5 d，結(jié)果峰面積平均值為33 719.125，RSD為1.31 %，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性 取水飛薊賓緩釋納米球膠體溶液適量，加入兩倍體積的乙腈，溶解后用流動相稀釋并定容，平行制備5份供試品溶液，按2.1.2項色譜條件測定，水飛薊賓含量的平均值為0.99 mg/ml，RSD為1.29 %，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 回收率 取空白緩釋納米球膠體溶液適量，用兩倍體積的乙腈溶解，分別精密加入適量的對照品溶液，流動相稀釋并定容，按2.1.2項色譜條件測定，結(jié)果水飛薊賓的平均回收率為99.95 %，RSD為0.25 %（n=9），表明該方法測定結(jié)果準確，符合要求。結(jié)果見表1。

表1 回收率結(jié)果

2.1.8 溶液穩(wěn)定性 精密吸取2.1.3項下12.5 μg/ml水飛薊賓標準溶液，分別于0，3，6，9，12，24 h，按2.1.2項色譜條件測定，按水飛薊賓峰面積計算RSD為0.38 %；另取水飛薊賓緩釋納米球膠體溶液適量，乙腈溶解后使用流動相稀釋定容，同法測定RSD為0.52 %。結(jié)果表明，溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.9 耐用性 精密吸取2.1.3項下25 μg/ml水飛薊賓標準溶液，分別調(diào)整緩沖液的pH值、流動相中甲醇和緩沖液的比例、流速等條件，同法測定，考察水飛薊賓a峰和水飛薊賓b峰之間的分離度。結(jié)果表明，水飛薊賓a和水飛薊賓b完全分離，該法耐用性好。

2.1.10 包封率及載藥量 取水飛薊賓緩釋納米球膠體溶液置超濾離心管中，低溫離心（4 ℃，12 000 r/min）10 min[7-8]。精密吸取濾液適量，HPLC測定水飛薊賓的含量，計算未包封水飛薊賓的量（M1）。另精密吸取一定量的水飛薊賓緩釋納米球膠體溶液置入量瓶，加入2兩倍體積的乙腈溶解水飛薊賓和PLGA，流動相稀釋并定容，測定水飛薊賓的含量，計算膠體溶液中的水飛薊賓量（M2）。MPLGA為PLGA的投料量。按下式計算包封率，載藥量和藥物利用率[9]。

2.1.11 超濾膜的吸附性評價 采用超濾離心法測定納米粒包封率的先決條件是藥物不被超濾膜吸附，因此，試驗考察了超濾離心管中超濾膜對藥物的吸附性。精密量取對照品貯備液，用水稀釋成高、中、低3種濃度，各取0.5 ml，置入超濾離心管，離心（4 ℃，12 000 r/min）10 min，HPLC測定濾液的峰面積，以下式計算回收率，結(jié)果見表2。說明超濾膜對水飛薊賓無吸附，可用于水飛薊賓緩釋納米球包封率的測定。回收率（%）=（濾液峰面積/母液峰面積）×100 %

表2 以回收率評價離心超濾管對藥物的吸附性

2.2 釋放度測定

2.2.1 釋放度方法 精密量取水飛薊賓緩釋納米球膠體溶液適量，加入溶出介質(zhì)分散后，置入透析袋，兩端扎緊，投入內(nèi)盛100 ml溶出介質(zhì)（pH 7.4磷酸鹽緩沖液）溶出杯中，37±0.5 ℃，60 r/min恒速攪拌，于一定時間點吸取1 ml釋放液，同時補加1 ml溶出介質(zhì)。所取樣過0.45 μm濾膜，測定水飛薊賓濃度，以各時間點的實測藥物濃度與按標示量計算得到的100 ml溶出介質(zhì)中的藥物濃度之比，計算累積釋放百分數(shù)Q（%）[10]。

2.2.2 溶出介質(zhì)的選擇 藥物從水飛薊賓緩釋納米球內(nèi)部的釋放需伴隨PLGA的降解，因此其釋藥速度與PLGA在介質(zhì)中的降解速度有關(guān)。PLGA為乳酸和羥基乙醇酸經(jīng)聚合而成的高分子材料，其水解受溶液pH影響較大，因此溶液pH可影響水飛薊賓緩釋納米球中藥物的釋放。人體組織pH約7.4，故為更好地模擬體內(nèi)水飛薊賓緩釋納米球釋藥情況，選擇pH 7.4磷酸鹽緩沖液為水飛薊賓緩釋納米球體外釋藥規(guī)律研究的溶出介質(zhì)。

2.2.3 色譜條件 流動相：甲醇：0.05 mo/L磷酸鹽緩沖液（pH 3.0）（49:51）；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μl；檢測波長：288 nm。在此色譜條件下，水飛薊賓分離得到水飛薊賓a和水飛薊賓b兩個峰，兩峰均達到基線分離?？瞻?、空白加對照品及樣品色譜圖見圖2。

圖2 專屬性色圖譜

2.2.4 標準曲線 精密稱取水飛薊賓對照品12.5 mg，置入50 ml量瓶，用適量甲醇溶解、溶出介質(zhì)稀釋并定容，作為儲備液。然后精密吸取不同體積的儲備液，溶出介質(zhì)稀釋成0.5，1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μg/ml的標準溶液，分別取20 μl進樣，按2.2.3項色譜條件測定，結(jié)果在0.5～20.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積（A）與藥物濃度（C）有良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=30 618C-2085.8，r=0.9999。

2.2.5 檢測限和定量限 精密稱取水飛薊賓對照品，用適量甲醇溶解并用溶出介質(zhì)稀釋得到15.0 ng/ml的溶液，按2.2.3項色譜條件測定，得到水飛薊賓的峰高約為基線噪音的10倍。再精密量取該溶液2 ml，置入10 ml量瓶，溶出介質(zhì)稀釋至刻度，得到水飛薊賓的峰高約為基線噪音的3倍。結(jié)果表明，水飛薊賓在該色譜條件下的檢測限為3.0 ng/ml，定量限為15 ng/ml。

2.2.6 精密度

2.2.6.1 日內(nèi)精密度 精密吸取2.2.4項下濃度為5.0 μg/ml水飛薊賓標準溶液，按2.2.3項色譜條件測定，同天連續(xù)進樣5次，按峰面積計算RSD為1.08 %，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.2.6.2 日間精密度 精密吸取2.2.4項下濃度為5.0 μg/ml水飛薊賓標準溶液，按2.2.3項色譜條件測定，隔天進樣1次，共5 d，按峰面積計算RSD為1.26 %，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取水飛薊賓緩釋納米球膠體溶液適量，按2.2.1項釋放度測定方法，在相同取樣時間點，平行制備5份供試品溶液，按2.2.3項色譜條件測定，釋放液中水飛薊賓含量的平均值為4.6 μg/ml，RSD為1.42 %，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率 精密量取2.2.4項下0.5 μg/ml標準溶液1.0 ml，加入適量的對照品溶液，溶出介質(zhì)稀釋定容后，按2.2.3項色譜條件測定，結(jié)果水飛薊賓的平均回收率為101.85 %，RSD為1.53 %（n=9），表明該方法測定結(jié)果準確，符合要求。結(jié)果見表3。

表3 回收率測定結(jié)果

2.2.9 溶液穩(wěn)定性 精密稱取水飛薊賓適量，甲醇溶解后并用溶出介質(zhì)配制成濃度約1.0 μg/ml溶液，置37 ℃水浴中，于0，3，6，9，12，24 h，按2.2.3項色譜條件測定，按水飛薊賓峰面積計算RSD為0.34 %，結(jié)果表明，水飛薊賓在37 ℃溶出介質(zhì)中24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10 耐用性 取2.2.4項下10 μg/ml標準溶液，分別調(diào)整緩沖液的pH值、流動相中甲醇和緩沖液的比例、流速等條件，同法測定，考察水飛薊賓a峰和水飛薊賓b峰之間的分離度。結(jié)果表明，水飛薊賓a和水飛薊賓b完全分離，該法耐用性好。

3 討論

水飛薊賓緩釋納米球體外含量測定選擇HPLC而沒有選擇紫外分光光度法，是考慮到水飛薊賓緩釋納米球制劑中，樣品藥物濃度較低，紫外分光光度法無法滿足檢測要求；另外預(yù)試驗中掃描空白輔料的紫外圖譜，發(fā)現(xiàn)在藥物吸收峰處有吸收；因此，水飛薊賓緩釋納米球制劑的體外分析方法選擇了HPLC。

水飛薊賓緩釋納米球中藥物的測定方法不同于水飛薊賓溶液，需要將納米球溶解，藥物才能釋放出來。選擇合適的溶劑系統(tǒng)，聚合物和藥物可同時溶解，聚合物不干擾主藥的測定，試樣中的主成份與輔料不經(jīng)過分離，溶液中的藥物濃度即可直接測定。另外，載藥納米球膠體溶液中，除被包裹或吸附于納米球的藥物外，在膠體溶液中可能還含有少量的游離藥物。最后，根據(jù)水飛薊賓、PLGA和附加劑的性質(zhì)，選擇乙腈作為溶劑，HPLC法測定水飛薊賓緩釋納米球膠體溶液中水飛薊賓的含量，輔料峰不干擾水飛薊賓的測定，所得方法專屬性強，精密度高。

天然或合成的水飛薊賓并非單一化合物，而是一對同分異構(gòu)體（水飛薊賓a和水飛薊賓b）的混合物，且它們都具有藥理活性，為了便于計算，故將水飛薊賓a和水飛薊賓b兩個峰的峰面積之和作為定量用。關(guān)于載藥量的計算，采用包裹的藥物重量與載體投料重量之比來計算，更直觀的體現(xiàn)了PLGA對藥物的包裹能力，便于納米球制備工藝中考察PLGA載藥的能力。

在測定游離藥物時，考察了離心超濾管中濾膜對藥物的吸附性，結(jié)果顯示藥物不被超濾膜吸附。而采用常規(guī)冷凍超速離心來進行游離藥物的測定時，發(fā)現(xiàn)所測的包封率比超濾離心法要小，推測是離心時轉(zhuǎn)速不夠，未能形成足夠大的離心力使所有納米球都能沉淀下來。采用透析法測定游離藥物時，由于水飛薊賓難溶于水，所需時間較長，不利于樣品的快速檢測。因此，最后選擇超濾離心法。