HEK 293細胞中重組型抗體表達和分泌的監(jiān)測系統(tǒng)的構(gòu)建

何曾安，柳藝石，張慧杰，高曉冬，藤田盛久

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

生物藥物（biopharmaceuticals）是一類在生物體或生物組織中綜合利用生物化學、生物技術、微生物學、化學和藥學等多學科原理和方法制造出的，用于預防、治療或診斷的藥物。與傳統(tǒng)的小分子藥物相比，以單克隆抗體為代表的生物藥物具有較高的親和性和特異性，可高效識別靶點分子，且副作用極低。重組治療性蛋白質(zhì)正日益成為重要的醫(yī)療藥劑，用以治療癌癥及自身免疫性疾病等頑固性病癥[1]。截止2010年，包括生物抗體藥物在內(nèi)的重組蛋白質(zhì)已獲得了1 000億美元的市場銷售額[2]。

免疫球蛋白G（IgG）是重要的重組治療性生物藥物，目前已被廣泛地應用于多種疾病的治療和診斷，如傳染病、免疫缺陷病及自身免疫性疾病等[3-4]。IgG由2條γ重鏈和2條輕鏈通過二硫鍵共價連接形成四聚體蛋白質(zhì)，每個輕鏈和重鏈的N端均含有針對同一抗原的抗原結(jié)合域。在IgG的Fc結(jié)構(gòu)域上有一個高度保守的N-糖基化位點[5]。目前生物抗體藥物主要由經(jīng)過基因工程改造可大規(guī)模培養(yǎng)的宿主細胞表達生產(chǎn)，這些工程細胞株主要有中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）、幼年敘利亞地鼠腎細胞 （Baby Hamster Syrian Kidney、BHK），小鼠骨髓瘤細胞株 Sp2/0和 NSO等[6]。

如何在盡可能降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量的同時仍保持工藝的穩(wěn)定性和產(chǎn)品的一致性，依舊是抗體工業(yè)生產(chǎn)研發(fā)的方向。目前雖已有研究通過改善培養(yǎng)技術和優(yōu)化基因擴增系統(tǒng)顯著提高了CHO細胞中抗體的產(chǎn)量[7-8]，但工業(yè)生產(chǎn)中所用的CHO細胞株的抗體表達水平仍遠低于人體自身漿細胞。因此，在優(yōu)化產(chǎn)品、提升產(chǎn)量方面，哺乳動物細胞株仍有較大改造潛力，其中針對分泌途徑進行基因工程改造以提高抗體分泌量的需求尤為迫切。

為了克服哺乳動物細胞株生產(chǎn)中產(chǎn)量較低的現(xiàn)狀，充分理解目的蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運及分泌途徑中所須的相關因子就顯得尤為重要。本研究中，作者采用HEK 293細胞即人體胚胎腎細胞構(gòu)建了一個可檢測抗體轉(zhuǎn)運分泌的監(jiān)測系統(tǒng)。HEK 293細胞是由人腎胚細胞改造而成的永生化細胞株[9]，由于其具有較高的生長速率和較好的蛋白質(zhì)分泌活性，已被廣泛地應用于蛋白質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)[10]。本研究中采用人源抗雞蛋清溶菌酶抗體 （anti-Hen egg white lysozyme antibody，HyHEL10） 作 為 模 式 抗 體 。HyHEL10是一種晶體結(jié)構(gòu)已知的單克隆抗體，以雞蛋清溶菌酶（hen egg white lysozyme，HEL）為抗原，且與抗原的識別機制也已十分清楚[11-12]。為了便于監(jiān)測抗體在細胞內(nèi)部的累積以及向胞外分泌的情況，本研究中構(gòu)建的重組型抗體在重鏈N端融合有增強型綠色熒光蛋白單體 （monomeric enhanced green fluorescent protein，mEGFP）和 FLAG 標簽，分別用蛋白質(zhì)合成抑制劑和蛋白質(zhì)運輸抑制劑處理細胞后，細胞中代表抗體水平的EGFP綠色熒光信號強度發(fā)生改變。本研究所構(gòu)建的抗體表達系統(tǒng)可用于抗體分泌及折疊相關因子的篩選。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人體胚胎腎細胞HEK 293和HEK 293T細胞株：均使用含有10%胎牛血清（FCS）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco，Life technologies，USA）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.2 重組型抗體表達載體的構(gòu)建

以pME18s-HyHEL10-human-sIgG為模板，用上游引物CCCAAGCTTGAGGTGCAGCTTCAGGAG TCA和下游引物AAAAGCGGCCGCTCATTTACCCG GAGACAGGG（下劃線處分別為HindIII和NotI酶切位點）PCR擴增抗體重鏈（HyHEL10-sIgG1）。以限制性內(nèi)切酶處理并純化PCR擴增片段，用連接酶（Ligation Mix，Takara，JP）連接入載體 pMENeo2dH-mEGFP-FCD59_CD59ss[13]的HindIII和NotI位點，構(gòu)建出pME-NeodH-ssEGFP-FHyHEL10中間質(zhì)粒。

在pME-NeodH-ssEGFP-F-HyHEL10質(zhì)粒上用EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶切出抗體的重鏈可變區(qū)（VH），同時用NotI和XhoI限制性內(nèi)切酶切出抗體的重鏈恒定區(qū)（CH）。之后用連接酶（Ligation Mix，Takara，JP）將兩個片段同時連接入 pLIB2-pgkHyg逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的NotI和EcoRI酶切位點，從而構(gòu)建出pLIB2-pgkHyg-ssEGFP-FHyHEL10-sIgG1抗體重鏈表達載體。此載體可表達含有由人源hCD59信號肽引導的綠色熒光蛋白（EGFP），以及 FLAG 標簽。

以pME18s-HyHEL10-human-kappa為模板，用上游引物AAAAGAATTCATGGATCCCAAAGGAT CCC和下游引物AAAAGCGGCCGCTAACACTCTC CCC（下劃線分別為EcoRI和NotI酶切位點）擴增抗體的輕鏈（HyHEL10-human-kappa），并將純化后的PCR擴增片段連接入pLIB2-pgkBSD逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的NotI和EcoRI酶切位點，由此構(gòu)建出pLIB2-pgkBSD-HyHEL10-human-kappa抗體輕鏈表達載體。

1.3 HEK 293細胞株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

在6孔板上接種HEK 293T細胞，按照Lipofectamine2000 （Invitrogen，USA） 的說明書，將pGP、pVSV-G與重組質(zhì)粒pLIB2-pgkHyg-ssEGFPF-HyHEL10-sIgG1或pLIB2-pgkBSD-HyHEL10-human-kappa 按照 1∶1∶2（m∶m∶m）轉(zhuǎn)染到 HEK 293T細胞，用以表達分別含有重組抗體重鏈（ssEGFP-FHyHEL10-sIgG1）或抗體輕鏈 （HyHEL10-humankappa）的逆轉(zhuǎn)錄病毒。病毒表達24 h后，將含有表達輕鏈病毒的培養(yǎng)基上清液與重鏈病毒培養(yǎng)基上清液以 1∶1（V∶V）混合，轉(zhuǎn)染入 6 孔板中的 HEK 293細胞。轉(zhuǎn)染時預先加入1 000×溴化己二甲銨（SIGMA，USA）以增加病毒轉(zhuǎn)染效率。病毒轉(zhuǎn)染24 h后用殺稻瘟菌素（blasticidin，InvivoGen，USA）和潮霉素（hygromycin，InvivoGen，USA）共同篩選 1 w。 用流式細胞分選儀S3e（Bio-Rad，USA）分選富集具有中等抗體表達量的陽性細胞，并用有限稀釋法（limiting dilution cloning，LDC）分離單克隆細胞株，由此獲得HEK 293 E-F-HyHEL10穩(wěn)定表達細胞株。

1.4 流式細胞分析

用胰酶（Sangon，CN）消化處理并收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，Sangon，CN）洗滌并重懸 （細胞終濃度為5×105個/mL）。采用 BD Accuri C6（BD，USA）流式細胞分析儀分析代表重組抗體水平的EGFP綠色熒光蛋白信號。

1.5 蛋白質(zhì)印記法

將細胞接種于6孔板，以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)基上清液，同時收集并裂解細胞提取胞內(nèi)蛋白質(zhì)。分別用還原態(tài)和非還原態(tài)的4×上樣緩沖液稀釋并煮沸樣品。用10%SDS-PAGE進行蛋白質(zhì)凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜和封閉結(jié)束后，依次使用5%脫脂牛奶稀釋8 000倍的一抗 （AffiniPure Rabbit Anti-Human IgG（H+L），Jackson，USA）和二抗（Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），HRP-Conjugated，Transgen，CN）孵育PVDF膜。最后用ECL顯色試劑 （Bio-Rad，USA）顯色并觀察結(jié)果，從而檢測 E-FHyHEL10抗體表達情況。

雞蛋清溶菌酶 （hen egg white lysozyme，HEL，SIGMA，USA）用5×上樣緩沖液稀釋，95℃煮沸 5 min，在15 g/dL SDS-PAGE中進行蛋白質(zhì)凝膠電泳。將HEK 293 E-F-HyHEL10細胞接種于6 cm板，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)基上清液5 mL，作為一抗加入轉(zhuǎn)有HEL作為抗原的PVDF膜室溫孵育。并使用5%脫脂牛奶稀釋8 000倍的二抗（Peroxidase AffniPure Goat Anti-Human IgG（H+L），Jackson，USA）室溫孵育。最后以ECL顯色試劑（Bio-Rad，USA）顯色并觀察結(jié)果，用以檢測E-FHyHEL10抗體功能。

1.6 重組型抗體的純化

在10塊15 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)HEK 293 E-FHyHEL10細胞，用含10%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，再用含1%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h并收集培養(yǎng)液。 用 anti-DDDDK-tag Gel（MBL，JP）沉淀培養(yǎng)基中的E-F-HyHEL10重組抗體，之后用洗脫蛋白質(zhì) （DDDDK-tagged Protein，MBL，JP）洗脫。收集洗脫液并加入透析盒 （Slide-A-LyzerTMG2 Dialysis Cassettes，20K MWCO、3 mL，Thermo Scientific，USA）以去除多余的洗脫蛋白質(zhì)。用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒 （Beyotime Biotechnology，CN）測定純化獲得的E-F-HyHEL10抗體標準樣品質(zhì)量濃度。

1.7 銀染

將純化的E-F-HyHEL10標準樣品用10 g/dL SDS-PAGE進行蛋白質(zhì)凝膠電泳，使用快速銀染試劑盒（Beyotime Biotechnology，CN）顯色，并分析顯色結(jié)果。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

用雞蛋清溶菌酶 （HEL，SIGMA，USA）作為抗原，在 96 孔免疫板（Thermo Scientific Nunc，USA）中鋪板。封閉液（PBS，10%FCS）室溫封閉后，加入一抗孵育。一抗實驗組采用HEK 293 E-F-HyHEL10細胞的無血清培養(yǎng)基上清液。一抗對照組用純化的E-F-HyHEL10標準品并稀釋至12個質(zhì)量濃度梯度 ：0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 ng/mL。之后加入封閉液稀釋2 000倍的二抗 （Peroxidase AffniPure Goat Anti-Human IgG（H+L），Jackson，USA） 孵育。 最后以 1×TMB 溶液（eBioscience，USA） 顯色， 并用終止液 （1 mol/L H2SO4）結(jié)束顯色。 用酶標儀（Bio-Rad，USA）在 450 nm下檢測樣品吸光度。按照對照組標準品質(zhì)量濃度與吸光度的關系制作標準曲線，以此曲線函數(shù)計算出其它實驗組樣品的抗體質(zhì)量濃度。

1.9 蛋白質(zhì)合成抑制劑與分泌抑制劑的處理

在12孔板中接種HEK 293 E-F-HyHEL10細胞，培養(yǎng)24 h后更換為含有蛋白質(zhì)合成抑制劑或運輸抑制劑的無血清培養(yǎng)基處理細胞。蛋白質(zhì)分泌抑制劑選用1.25 μg/mL布雷菲德菌素A（brefeldin A，BioLegend，USA）[14]，蛋白質(zhì)合成抑制劑選用 100 μg/mL放線菌酮（cycloheximide，Cell Signaling Technology，USA）[15]，分別處理不同時間。藥物處理結(jié)束后收集細胞，用 BD Accuri C6（BD，USA）流式細胞分析儀分析胞內(nèi)抗體累積量。以BFA處理為例，對抗體胞內(nèi)累積水平進行量化分析，用如下公式計算：

公式中采用相應樣品的EGFP綠色熒光信號強度值進行計算，定義HEK 293細胞樣品的信號值為“親本細胞組”，未經(jīng)BFA處理的HEK 293 E-FHyHEL10細胞樣品信號值被定義為“BFA對照組”。依照抗體累積倍數(shù)與處理時間關系作圖，同時取培養(yǎng)基上清液進行ELISA，分析胞外抗體分泌量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組型抗體表達載體的驗證

為了構(gòu)建一個可用于監(jiān)測抗體分泌和累積情況的穩(wěn)定表達細胞株，作者首先設計構(gòu)建了2個逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達載體（圖1（a）），共同表達重組型抗體EGFP-FLAG-HyHEL10。選取的模式抗體HyHEL10，即抗蛋清溶菌酶抗體（anti-Hen egg white lysozyme antibody），是一種表征良好的抗體，具有人源IgG1亞型。其中重組抗體重鏈的N端融合有一個人源CD59的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽（hCD59ss），一個增強型綠色熒光蛋白單體 （mEGFP），以及一個FLAG標簽（圖1（b））。在分泌運輸過程中，抗體的C端通常參與識別運載受體。因此，為保持C端恒定域的原有功能，作者將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽引導的mEGFP和FLAG標簽均融合在抗體重鏈的N端。共同轉(zhuǎn)染表達HyHEL10輕鏈和重鏈的載體時，細胞可表達成熟的分泌型抗體。

核酸凝膠電泳結(jié)果顯示，雙酶切驗證重組抗體表達載體pLIB2-pgkHyg-ssEGFP-F-HyHEL10-sIgG1和pLIB2-pgkBSD-HyHEL10-human-kappa均得到兩個片段，其中重組抗體重鏈 （ssEGFP-FHyHEL10-sIgG1）大小為 2 094 bp，抗體輕鏈（HyHEL10-human-kappa）為 723 bp（圖 1（c）），且測序結(jié)果與模板序列完全匹配。

圖1 重組型抗體表達載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of vectors for recombinant immunoglobulin expression

2.2 HEK 293 E-F-HyHEL10穩(wěn)定表達細胞株的構(gòu)建

用HEK 293T細胞分別表達的含有抗體重鏈和輕鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染HEK 293細胞，從而構(gòu)建穩(wěn)定表達EGFP-FLAG-HyHEL10的HEK 293細胞株。用流式細胞術分析每株單克隆細胞株的抗體表達量，依據(jù)EGFP熒光信號的強度，最終選取具有中等抗體表達水平的4號細胞株進行后續(xù)實驗 （圖2（a））。核酸凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴增4號細胞株基因組可得到正確大小的抗體重鏈和輕鏈DNA片段（圖2（b）），證明抗體重鏈和輕鏈的表達基因已正確整合入受體細胞基因組。

作者進一步采用蛋白質(zhì)印記法驗證HEK 293 E-F-HyHEL10 No.4細胞株的胞內(nèi)裂解樣品及培養(yǎng)基上清液樣品中抗體的表達情況。由于還原條件下抗體重鏈、輕鏈間的二硫鍵被打斷，Western印記分析結(jié)果可以檢測到還原態(tài)下約75 000的重組抗體重鏈（ssEGFP-F-HyHEL10-sIgG1），以及約 27 000的抗體輕鏈（HyHEL10-human-kappa）。同時也可檢測到非還原態(tài)下200 000左右的重組抗體全長 （圖2（c））。蛋白質(zhì)印跡法在胞內(nèi)裂解樣品及培養(yǎng)基上清液樣品中均可檢測到正確大小的重組抗體，說明HEK 293 E-F-HyHEL10 No.4細胞株可以正確表達并分泌重組抗體。此外，作者推測細胞裂解樣品中被檢測出的其他條帶應該是未完全折疊且滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中的抗體重鏈，只有正確折疊聚合的抗體才可被分泌至培養(yǎng)基中。

圖2 構(gòu)建HEK 293 E-F-HyHEL10穩(wěn)定表達細胞株Fig.2 Establishment of HEK 293 cells expressing an EGFP-fused antibody

2.3 EGFP融合型抗體功能的檢測

由于表達的重組型抗體重鏈的N端融合有EGFP綠色熒光蛋白和FLAG標簽，且成熟的抗體N端是識別相應抗原的抗原結(jié)合域，故對表達的重組型抗體是否能夠依舊維持其生物功能進行了確認。實驗中使用雞蛋清溶菌酶 （HEL）作為E-FHyHEL10重組抗體的抗原。蛋白質(zhì)印記結(jié)果顯示出14 000的 HEL（圖 3（a）），說明重組型抗體可以識別相應的抗原，抗體N端融合的兩個標簽并不影響抗體功能的發(fā)揮。

為了進一步驗證重組型抗體的功能性，作者從低血清培養(yǎng)基上清液中純化出E-F-HyHEL10標準樣品（圖3（b））。用純化后稀釋至不同濃度的E-FHyHEL10孵育經(jīng)HEL鋪板的免疫96孔板，并進行酶聯(lián)免疫吸附測定，依據(jù)樣品顯色后的吸光度值與抗體加樣量擬合繪制曲線。ELISA結(jié)果顯示，隨著抗體加樣濃度的提高樣品吸光度值也相應提高，由此表明E-F-HyHEL10與HEL的結(jié)合量與抗體本身的加樣量有關（圖3（c））。此結(jié)果進一步證明EGFP融合型抗體仍具有良好的功能活性。

圖3 重組型抗體的功能驗證Fig.3 EGFP-fused antibody is functional

2.4 蛋白質(zhì)分泌運輸抑制劑對重組抗體表達和分泌的影響

布雷菲德菌素A（BFA）可通過抑制外殼蛋白復合體 I（coat protein complex I，COPI）的形成間接抑制蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）到高爾基體的分泌運輸[16]。為了監(jiān)測抗體的分泌情況，作者使用布雷菲德菌素A作為蛋白質(zhì)分泌運輸抑制劑，依照1.9中的試驗方法處理HEK 293 E-FHyHEL10細胞。流式細胞分析結(jié)果表明，BFA處理后胞內(nèi)抗體累積量有明顯提升（圖4（a））。進一步對抗體胞內(nèi)累積水平進行量化分析，如圖4（b）所示，BFA處理36 h后抗體的胞內(nèi)累積量達到最大值，是對照組的1.6倍。取培養(yǎng)基上清液進行酶聯(lián)免疫吸附測定重組抗體的胞外分泌量，結(jié)果顯示BFA作為有效的蛋白質(zhì)分泌抑制劑對抗體分泌至胞外有顯著的抑制作用，因為幾乎無法在培養(yǎng)液上清樣品中檢測到分泌的重組抗體（圖4（c））。此結(jié)果與流式細胞分析結(jié)果相吻合。

圖4 布雷菲德菌素A（BFA）對抗體表達細胞株的處理Fig.4 Treatment of brefeldin A （BFA）on HEK 293 EF-HyHEL10 cells

2.5 蛋白質(zhì)合成抑制劑對重組抗體表達和分泌的影響

使用放線菌酮 （CHX）處理HEK 293 E-FHyHEL10細胞，流式細胞分析結(jié)果顯示，CHX處理后的細胞中抗體累積量明顯降低（圖5（a））。使用1.9中的定量計算公式同樣對CHX處理樣品進行量化分析，在CHX處理12 h后抗體的胞內(nèi)累積量急劇下降至對照組的0.7倍，并在后續(xù)處理的35 h內(nèi)逐漸維持在0.5倍的水平（圖5（b））。ELISA結(jié)果顯示，無法在CHX處理的培養(yǎng)液上清液樣品中檢測到分泌的重組抗體（圖5（c））。這兩個結(jié)果共同證明，放線菌酮作為蛋白合成抑制劑抑制了抗體的合成，使得抗體無法在胞內(nèi)合成并累積，更無重組抗體分泌到胞外。

圖5 放線菌酮（CHX）對抗體表達細胞株的處理Fig.5 Treatment of cycloheximide （CHX）on HEK 293 E-F-HyHEL10 cells

3 結(jié) 語

截至目前，與細胞株基因工程改造的相關研究主要關注在以下方面：通過改造啟動子或引入基因擴增系統(tǒng)以提高基因轉(zhuǎn)錄水平；通過優(yōu)化表達原件以改善蛋白質(zhì)翻譯水平從而提高產(chǎn)量等[17-18]。盡管針對蛋白質(zhì)折疊和運輸?shù)幕蚬こ谈脑焓莾?yōu)化的主要內(nèi)容，但相應的機理研究工作仍是各項工業(yè)優(yōu)化的基礎。哺乳動物細胞中，抗體首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，經(jīng)過正確的蛋白質(zhì)糖基化和折疊后被運送到高爾基體。抗體上的糖鏈會在高爾基體中被進一步修飾改造，并被分揀入反式高爾基網(wǎng)而最終分泌至培養(yǎng)基中。針對這一抗體分泌運輸途徑開展研究的最大阻礙是缺乏可以靈活檢測抗體分泌運輸?shù)谋磉_細胞株。

作者構(gòu)建了可穩(wěn)定表達E-F-HyHEL10重組型抗體的HEK 293細胞表達系統(tǒng)，這一表達系統(tǒng)可被成功地用于靈活檢測抗體表達及分泌水平。該系統(tǒng)具有良好的抗體表達量及分泌量，同時穩(wěn)定維持了抗體的功能活性。研究結(jié)果表明，布雷菲德菌素A和放線菌酮處理細胞，對抗體的胞內(nèi)累積和胞外分泌途徑均有積極影響，說明本抗體表達系統(tǒng)可靈敏地響應蛋白質(zhì)分泌抑制劑和蛋白質(zhì)合成抑制劑的擾動，進而證明本研究中構(gòu)建的抗體表達系統(tǒng)具有靈活表征胞內(nèi)胞外抗體分泌及表達情況的特性，可實現(xiàn)抗體表達、累積和分泌水平的準確監(jiān)測。

本研究構(gòu)建的可監(jiān)測抗體分泌的穩(wěn)定表達細胞株，未來可用于篩選鑒定與抗體分泌相關的因子。比如通過用化學藥物對細胞的處理鑒定出可作用于抗體分泌的化學藥物。新一代基因編輯技術CRISPR/Cas9，是現(xiàn)今十分高效的基因編輯工具[19]，已有研究運用CRISPR/Cas9基因敲除文庫進行基因組篩選[20]。本研究構(gòu)建的重組抗體監(jiān)控系統(tǒng)中亦可引入CRISPR/Cas9基因敲除文庫，用于篩選與抗體折疊、分泌相關的基因。此外，可將研究中構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達載體系統(tǒng)引入HAP1人源單倍體細胞株[21]，構(gòu)建重組抗體單倍體細胞表達系統(tǒng)，并利用HAP1細胞的單倍體基因組優(yōu)勢進行正向遺傳學篩選。作者已先期構(gòu)建了用于篩選抗體分泌相關因子的HAP1 E-F-HyHEL10穩(wěn)定表達細胞株 （未發(fā)表）。用這一可監(jiān)控細胞株篩選獲得關鍵性因子后，未來可將這些因子應用于改造重組型抗體表達細胞株以提高生物藥品的產(chǎn)量。