發(fā)酵條件對(duì)Bacillus amyloliquefaciens SYBCH47降解亞硝酸鹽的影響

王 爽，徐 君，張言周，管政兵，蔡宇杰，廖祥儒

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

亞硝酸鹽是潛在的致癌物，可參與反應(yīng)生成亞硝胺類化合物，在水果蔬菜儲(chǔ)藏或發(fā)酵過(guò)程中極易積累，對(duì)食品安全問(wèn)題構(gòu)成威脅。大量研究表明，攝入過(guò)量亞硝酸鹽可導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥[1]。同時(shí)，亞硝胺類化合物還有致突變和致畸的作用。調(diào)查表明，某些癌癥（食道癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等）可能與亞硝胺類物質(zhì)有關(guān)。因此，食品中對(duì)亞硝酸鹽含量有明確的限量標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)酵食品中亞硝酸鹽超標(biāo)、肉制品中含亞硝酸鹽過(guò)量、水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽含量超標(biāo)等導(dǎo)致食品安全問(wèn)題[2]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，水體中高濃度的亞硝酸鹽既危害養(yǎng)殖生物，同時(shí)又引起養(yǎng)殖品種發(fā)生病害[3]。因此發(fā)現(xiàn)有效控制及減少亞硝酸鹽的方法亟待解決。

目前，添加食用安全的微生物是減少食品中亞硝酸鹽的主要方法之一，主要有短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、 植物乳桿菌（Lactobacillus plantrum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）[2]。 關(guān)于能有效降解亞硝酸鹽菌種的報(bào)道主要有乳酸菌及少數(shù)芽孢桿菌，如巨大芽孢桿菌[4]、蠟樣芽孢桿菌[2]等。沈錫權(quán)等[5]研究表明，在冬瓜生鹽過(guò)程中，前期主要菌群為乳酸菌，后期主要為芽孢桿菌。大多數(shù)乳酸菌為厭氧菌，用其降解亞硝酸鹽存在一定的局限性。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)可高效降解亞硝酸鹽的新菌種[6]。作者所在實(shí)驗(yàn)室從蜂蜜中分離得到一株解淀粉芽孢桿菌，經(jīng)檢測(cè)具有降解亞硝酸鹽的能力。解淀粉芽孢桿菌分布廣泛、易于分離培養(yǎng)、對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害、對(duì)環(huán)境無(wú)污染，代謝產(chǎn)物豐富、具有較強(qiáng)抗逆能力，生長(zhǎng)快、穩(wěn)定性好，適合作為生防菌生產(chǎn)和應(yīng)用[7]。解淀粉芽孢桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，具有抑制真菌與細(xì)菌的能力。目前，解淀粉芽孢桿菌在抑制病原菌方面、環(huán)境保護(hù)方面及動(dòng)物飼料反面的應(yīng)用已受到廣泛關(guān)注[3]。據(jù)報(bào)道，飼料中添加芽孢桿菌可改善養(yǎng)殖水質(zhì)，增強(qiáng)消化酶活性、機(jī)體免疫和腸黏膜抗氧化功能等[8]。亞硝酸鹽的代謝主要受參與該過(guò)程的關(guān)鍵酶活性和菌體的生長(zhǎng)速率的影響[9]。作者試圖探索該菌對(duì)亞硝酸鹽的降解能力和影響因素，為將其應(yīng)用于發(fā)酵食品及水產(chǎn)養(yǎng)殖中亞硝酸鹽的降解轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

試驗(yàn)菌種：解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciensH47），作者所在實(shí)驗(yàn)室分離自蜂蜜。

1.2 培養(yǎng)基

1）LB 培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 10，胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5；pH 調(diào)至 7.1±0.1。

2）亞硝酸鈉培養(yǎng)基（g/L）：LB培養(yǎng)基，亞硝酸鈉0.15；pH 調(diào)至 7.1±0.1。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 試劑亞硝酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；含量測(cè)定所用試劑及配置方法參考GB 5009.33—2010。

1.3.2 儀器分光光度計(jì)：SHIMADZU公司 ；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；TGL-16M型高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)菌種降解亞硝酸鹽的能力將保藏于-80℃甘油管中的試驗(yàn)菌以2%的接種體積分?jǐn)?shù)接到50 mL LB培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)12 h，進(jìn)行菌種活化。將活化種子液以1%接種體積分?jǐn)?shù)分別接種到50 mL亞硝酸鈉液體培養(yǎng)基和50 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于 2、4、6、8、10、12 h取樣測(cè)定菌體濃度、pH及亞硝酸鈉含量。平行試驗(yàn)做3次重復(fù)，求平均值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別以菌體濃度、pH值及亞硝酸鈉降解率為縱坐標(biāo)作圖。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)菌對(duì)亞硝酸鹽降解影響因素的研究

1）培養(yǎng)條件：將保藏于-80℃甘油管中的試驗(yàn)菌以2%的接種體積分?jǐn)?shù)接到50 mL LB培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)12 h，進(jìn)行菌種活化。將活化后的種子液以1%接種體積分?jǐn)?shù)接種到50 mL亞硝酸鈉培養(yǎng)基和50 mL LB培養(yǎng)基中，分別于30℃恒溫培養(yǎng)和 200 r/min 搖床培養(yǎng)。于 2、4、6、8、10、12 h 取樣測(cè)定菌體濃度、pH及亞硝酸鈉質(zhì)量濃度。平行試驗(yàn)做3次重復(fù)，求平均值。以底物濃度為橫坐標(biāo)，以菌體濃度及亞硝酸鹽降解率為縱坐標(biāo)作圖。

2）底物濃度：配制亞硝酸鈉質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、250 mg/L 的 50 mL LB 培養(yǎng)基。 按1%的接種體積分?jǐn)?shù)加入活化后的種子液，于30℃恒溫培養(yǎng)，分別于2、6、10 h后測(cè)定發(fā)酵液中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度。平行試驗(yàn)做3次重復(fù)，求平均值。以底物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，分別以菌體濃度、亞硝酸鹽降解量及亞硝酸鹽降解率為縱坐標(biāo)作圖。

3）溫度：向亞硝酸鈉培養(yǎng)基中加入1%活化后種子液，分別置于 20、25、30、35 ℃下恒溫培養(yǎng)，10 h后測(cè)菌體濃度，pH和亞硝酸鹽質(zhì)量濃度。平行試驗(yàn)做3次重復(fù)，求平均值。以溫度為橫坐標(biāo)，分別以菌體濃度及亞硝酸鹽降解率為縱坐標(biāo)作圖。

4）接種體積分?jǐn)?shù)：分別按0.2%、1%、5%接種體積分?jǐn)?shù)向亞硝酸鈉培養(yǎng)基中接入種子液。置于30℃下恒溫培養(yǎng)，于2、5、10 h測(cè)菌體濃度及亞硝酸鹽質(zhì)量濃度。平行試驗(yàn)做3次重復(fù)，求平均值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體濃度和亞硝酸鹽降解率為縱坐標(biāo)作圖。

1.4.3 亞硝酸鹽的測(cè)定測(cè)定方法根據(jù)標(biāo)GB 5009.33—2010中第二法——分光光度法對(duì)亞硝酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定，方法略有改動(dòng)。

1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 吸取 0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.75、1.00、1.25 mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（ 相 當(dāng) 于 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.75、5.0、6.25 μg亞硝酸鈉），分別置于25 mL帶塞比色管中。向比色管中分別加入 1 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5 min，再加入 0.5 mL鹽酸萘乙二胺溶液，加去離子水至比色管刻度處，混勻，靜置 12～15 min，以零管作為零點(diǎn)，于波長(zhǎng) 538 nm下測(cè)吸光度，繪制亞硝酸鈉含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）樣品測(cè)定：取5 mL發(fā)酵液以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心2 min，取4 mL上清液加1 mL亞鐵腈化鉀溶液，搖勻，再加入1 mL乙酸鋅溶液，反應(yīng)30 min。8 000 r/min離心5 min。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)亞硝酸鹽質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。

3）亞硝酸鹽降解能力表示方法：

4）菌體濃度及pH的測(cè)定：菌體濃度用分光光度計(jì)測(cè)發(fā)酵液在OD600下的吸光度，以初始培養(yǎng)基作對(duì)照。pH用pHS-3C型酸度計(jì)測(cè)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)菌降解亞硝酸鹽的能力及亞硝酸鹽對(duì)實(shí)驗(yàn)菌生長(zhǎng)的影響

含有亞硝酸鈉的培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)有一定的影響，見(jiàn)圖1、圖2。圖1顯示試驗(yàn)菌株在含有亞硝酸鈉和不含亞硝酸鈉的LB培養(yǎng)基中相比，吸光度值較高。說(shuō)明試驗(yàn)菌株可能利用亞硝酸鈉作為氮源生長(zhǎng)或亞硝酸鈉的存在改變細(xì)胞膜的通透性，對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。圖2顯示，從4～8 h亞硝酸鈉降解率顯著增加，此時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而從8～12 h降解率增加趨于平緩。在8 h時(shí)，亞硝酸鈉降解率達(dá)到99.58%，12 h時(shí)降解率達(dá)到99.83%。與不含亞硝酸鈉的發(fā)酵液相比，在含有亞硝酸鈉的發(fā)酵液中發(fā)酵液pH較高，且從4 h時(shí) pH便不再降低，可能是由于此時(shí)亞硝酸鈉被還原，使發(fā)酵液pH升高。

圖1 亞硝酸鈉對(duì)B.amyloliquefaciens SYBCH47生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of NaNO2on the growth of B.amyloliquefaciens SYBCH47

圖2 B.amyloliquefaciens SYBCH47對(duì)亞硝酸鹽的降解能力Fig.2 AbilityofB.amyloliquefaciensSYBCH47to degrade nitrite

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)及亞硝酸鹽降解率的影響

根據(jù)生物脫氮理論，亞硝酸鹽的降解可能源于兩個(gè)途徑：第一種途徑為反硝化作用，即：NO2-→NO→N2O→N2，此途徑中還原酶為 cytochrome cd1型Nir或copper-containing型 Nir，該途徑中還涉及Nor和Nos[10]；第二種途徑為亞硝酸鹽的同化或異化作用，即NO2-→NH4+。此途徑中還原酶為NrfA[11]，NirA或NirBD[12]。傳統(tǒng)認(rèn)為細(xì)菌的反硝化過(guò)程是在厭氧條件下完成的，自 Robertson等[13]發(fā)現(xiàn)了好氧反硝化細(xì)菌Thiosphaera pantotroph后，對(duì)好氧反硝化菌株的報(bào)道陸續(xù)增加，如Pseudomonas aeruginosa[13]、Pseudomonaschloritidis-mutans［15］、Alcaligenes piechaudii［16］、Bacillus licheni-form［17］等[18]。

因此，通過(guò)測(cè)定靜止培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)的菌體吸光度及亞硝酸鹽降解率來(lái)確定溶氧量對(duì)菌體生長(zhǎng)及亞硝酸鹽降解能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。兩種培養(yǎng)條件下，菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期基本相同，但搖床培養(yǎng)菌體濃度最大值遠(yuǎn)高于靜止培養(yǎng)，亞硝酸鹽降解率基本同時(shí)達(dá)到最大，且最大值沒(méi)有明顯差異（P>0.05）。

圖3 培養(yǎng)條件對(duì)B.amyloliquefaciens SYBCH47生長(zhǎng)及降解亞硝酸鹽的影響Fig.3 Effect of culture condition on the growth and nitrite degradation of B. amyloliquefaciens SYBCH47

2.3 底物質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及亞硝酸鹽降解率的影響

加入 50、100、150、200、250 mg/L 亞硝酸鈉的LB培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)滅菌后用1.4.3所述方法檢測(cè)亞硝酸鈉 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 38.5、81.4、107.9、147.8、191.9 mg/L。將活化后菌種接種于含不同質(zhì)量濃度亞硝酸鈉的培養(yǎng)基中，亞硝酸鈉的降解結(jié)果見(jiàn)圖4-5。10 h后在含亞硝酸鈉50～200 mg/L的培養(yǎng)基中降解率都超過(guò)99%，但在250 mg/L時(shí)降解率為94.6%，可能是由于亞硝酸鈉質(zhì)量濃度過(guò)高對(duì)菌株的毒性增大所致。

2.4 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及亞硝酸鹽降解率的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌種生長(zhǎng)及亞硝酸鹽降解的影響見(jiàn)圖6。菌體在含亞硝酸鈉的培養(yǎng)基中最適生長(zhǎng)溫度為40℃。40℃時(shí)菌種生長(zhǎng)速率最快，相應(yīng)的亞硝酸鈉降解速率也最大。25℃及45℃時(shí)菌體生長(zhǎng)變緩慢，亞硝酸鈉降解率降低。培養(yǎng)10 h后，雖然30℃和35℃菌體濃度低于40℃培養(yǎng)條件的菌濃，但30、35、40℃培養(yǎng)條件下的亞硝酸鈉降解率都能達(dá)到99%以上，表明微生物及相關(guān)的酶的溫度適應(yīng)性較強(qiáng)。

圖4 NaNO2質(zhì)量濃度對(duì)B.amyloliquefaciens SYBCH47生長(zhǎng)及亞硝酸鹽降解量的影響Fig.4 Effect of NaNO2concentration on the growth and nitrite degradation amount of B.amyloliquefaciens SYBCH47

圖5 NaNO2質(zhì)量濃度對(duì)B.amyloliquefaciens SYBCH47降解亞硝酸鹽的影響Fig.5 Effect of NaNO2concentration on nitrite degradation of B.amyloliquefaciens SYBCH47

2.5 接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌體生長(zhǎng)及亞硝酸鹽降解率的影響

不同接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌體生長(zhǎng)及亞硝酸鹽的降解結(jié)果見(jiàn)圖7-8。隨著添加量的增大，菌數(shù)增加。1%接種體積分?jǐn)?shù)與5%接種體積分?jǐn)?shù)終亞硝酸鹽降解率基本相同（P>0.05），為節(jié)約成本應(yīng)選擇以1%接種體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行接種。

圖6 溫度對(duì)B.amyloliquefaciens SYBCH47的生長(zhǎng)及降解亞硝酸鹽的影響Fig.6 Effect of temperatures on the growth and nitrite degradation of B.amyloliquefaciens SYBCH47

圖7 接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)B.amyloliquefaciens SYBCH47生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of inoculum size on the growth of B.amyloliquefaciens SYBCH47

圖8 接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)B.amyloliquefaciens SYBC H47降解亞硝酸鹽的影響Fig.8 Effect of inoculum size on nitrite degradation of B.amyloliquefaciens SYBCH47

3 結(jié)語(yǔ)

利用生物法降解亞硝酸鹽采用生長(zhǎng)細(xì)胞作為反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行亞硝酸鹽的降解，其不足之處在于降解過(guò)程受到微生物生長(zhǎng)規(guī)律的限制，易出現(xiàn)系統(tǒng)不穩(wěn)定的現(xiàn)象。 目前，除利用加入微生物降解食品中的亞硝酸鹽外，還可利用Nir進(jìn)行亞硝酸鹽的生物降解，與全細(xì)胞催化劑相比，酶具有反應(yīng)效率高、催化特異性強(qiáng)、過(guò)程易分離和控制等優(yōu)勢(shì)。 但是要得到大量的食用安全的 Nir至今還沒(méi)有很好的方法[2，19]。因此，探索試驗(yàn)菌株的產(chǎn)酶條件并從試驗(yàn)菌株發(fā)酵液中有效分離純化亞硝酸鹽還原酶以及測(cè)定酶學(xué)性質(zhì)需要進(jìn)一步研究?？蛇\(yùn)用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)深入研究并闡明亞硝酸鹽還原酶表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理，利用基因操作技術(shù)，針對(duì)性的構(gòu)建高效表達(dá)亞硝酸鹽還原酶的基因工程菌。

通過(guò)對(duì)B.amyloliquefaciensSYBCH47亞硝酸鹽降解能力探究，表明該菌具有高效降解亞硝酸鹽的能力。試驗(yàn)菌株在含有亞硝酸鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率及終質(zhì)量濃度略高于不含亞硝酸鹽的培養(yǎng)基。原因可能是該菌能利用亞硝酸鹽作為氮源或是亞硝酸鹽改變了細(xì)胞的通透性，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。在30～40℃能快速生長(zhǎng)并在10 h內(nèi)對(duì)亞硝酸鹽的降解率達(dá)到99%以上，最適溫度為40℃。在亞硝酸鈉質(zhì)量濃度50～200 mg/L范圍內(nèi)，亞硝酸鹽的終降解率略有升高，變化并不明顯，在其質(zhì)量濃度為250 mg/L時(shí)，降解率明顯降低。作者探索了試驗(yàn)菌株降解亞硝酸鹽的影響因素，為進(jìn)一步將該菌運(yùn)用于發(fā)酵食品及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供了參考。