T-RFLP和454焦磷酸測序方法分析制麥過程細(xì)菌群落的動態(tài)變化

邱 然 ，陸 健 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

制麥?zhǔn)且粋€復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括諸多的生理生化反應(yīng)。大麥在發(fā)芽過程中，激活和合成水解酶類，降解蛋白質(zhì)和淀粉等大分子物質(zhì)，轉(zhuǎn)化成氨基酸和糖類，供啤酒酵母生長代謝使用[1]。在制麥生態(tài)系統(tǒng)中，除了發(fā)芽的大麥，還有豐富的微生物菌群[2]，其代謝產(chǎn)物對麥芽品質(zhì)影響很大，并最終影響啤酒質(zhì)量。微生物的性質(zhì)和數(shù)量會對制麥過程和最終產(chǎn)物啤酒產(chǎn)生有利或不利的影響[3]。因此，深入了解制麥過程中微生物菌落的性質(zhì)和數(shù)量，有利于控制制麥過程和改善麥芽品質(zhì)，進(jìn)而提升啤酒質(zhì)量[4]。

確定大麥和麥芽微生物組成的傳統(tǒng)方法是采用涂平板計數(shù)和菌落鑒定的方法。這種方法首先要進(jìn)行微生物培養(yǎng)。在現(xiàn)階段，自然界中大多數(shù)的微生物都是不可培養(yǎng)的，在實驗室中能夠培養(yǎng)的菌種僅占自然界微生物種類的極小部分，還有相當(dāng)多的微生物因無法培養(yǎng)而未被人們所認(rèn)識。因此，傳統(tǒng)方法用于研究制麥生態(tài)系統(tǒng)中總微生物構(gòu)成可能會出現(xiàn)嚴(yán)重偏差，導(dǎo)致實驗結(jié)果與實際不一致[5]。目前，傳統(tǒng)方法正逐漸被不需要進(jìn)行微生物培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法所補(bǔ)充和替代[6]，如指紋識別技術(shù)、基因測序等。其中末端限制片段長度多態(tài)性（T-RFLP）分析技術(shù)不依賴于細(xì)菌培養(yǎng)，并且整合了自動測序儀的高分辨率和高通量特征，重現(xiàn)性好，分辨率高，自動化程度高，能迅速產(chǎn)生大量重復(fù)、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。對于分析復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)比其他的指紋識別技術(shù)具有更明顯的優(yōu)勢，已經(jīng)被廣泛用于生態(tài)系統(tǒng)和棲息地中的微生物菌群的多樣性和分子動力學(xué)的研究[7]。隨著科技的不斷進(jìn)步，454焦磷酸測序技術(shù)已經(jīng)能快速鑒定微生物菌落，比克隆和Sanger測序更有效，避免了經(jīng)典分析技術(shù)在多樣性研究中的局限性以及由此引起的種群丟失、結(jié)構(gòu)不清等弊病，可以直接反映出生態(tài)系統(tǒng)中微生物原始的構(gòu)成情況，也是研究微生物群體多樣性的重要手段。然而，到目前為止，還少見T-RFLP和454焦磷酸測序方法用于分析麥芽制造過程中微生物多樣性的報道。

乳酸菌在制麥和釀造工業(yè)已有較多應(yīng)用，如利用乳酸菌在制麥和釀造過程中控制腐敗和真菌毒素，以提高麥芽質(zhì)量和安全性[8]。某些特定的乳酸菌會產(chǎn)生抗菌物質(zhì)與溶解氧競爭，限制有害細(xì)菌的生長，縮短麥汁過濾時間[9]。LAITILA等[10]證明在浸麥水中添加乳酸菌可以提高大麥發(fā)芽力。盡管在啤酒釀造工業(yè)中乳酸菌的重要性已經(jīng)得到了高度認(rèn)可，但到目前為止，大部分研究主要集中在個別菌株上[11]，與大麥和麥芽制造過程相關(guān)的乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)和特性尚未得到詳細(xì)研究。

本研究以兩個不同收獲年份、同批次但不同制麥方式的大麥為樣品，利用T-RFLP技術(shù)系統(tǒng)考察了細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)變化情況，并重點研究了制麥過程中的乳酸菌。另外，使用454焦磷酸測序技術(shù)對乳酸菌16S rRNA基因進(jìn)行測序，研究制麥過程中內(nèi)源性乳酸菌菌群特性。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

實驗材料：2012年和2013年的國產(chǎn)江蘇啤酒大麥單二。麥芽制造由塔式制麥系統(tǒng)和微型制麥系統(tǒng)按照相同的制麥工藝進(jìn)行。浸麥：4周—7 d—5周—7 d—5周—3 d，浸麥度 43%～44%；發(fā)芽：15℃，120 h；干燥：45℃3 h—1 h—55℃3 h—1 h—65℃ 3 h—1 h—70℃ 1 h—1 h—75℃ 1 h—1 h—87℃ 3 h。取樣點設(shè)在發(fā)芽1 d、發(fā)芽5 d和最終成品麥芽。所有供試樣品由中糧麥芽（大連）有限公司提供。

實驗儀器：微型制麥設(shè)備，澳大利亞Jeo White麥芽公司產(chǎn)品；PCR儀，Bio-Rad T100，美國伯樂公司產(chǎn)品；變性梯度凝膠電泳儀，Bio-Rad；凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司；熒光儀，Invitrogen Qubit?2.0，賽默飛世爾公司產(chǎn)品；自動測序儀，373A，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)菌總DNA提取

準(zhǔn)確稱量大麥及麥芽樣品150 g裝入帶有無菌小玻璃珠（212～300 μm）的 500 mL 三角瓶中，向每個瓶中加入 100 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8，10 mmol/L），室溫，160 r/min 搖床振蕩 1 h。離心，棄上清后，將所得沉淀加入液氮在研缽中研磨數(shù)次，取出裝入1.5 mL離心管中，-20℃冷卻保藏，待用。按照文獻(xiàn)[4]的方法提取細(xì)菌總DNA。

1.3 T-RFLP分析

用于16S rRNA基因T-RFLP分析的2套引物分別為細(xì)菌通用引物 516F（5’-TGCCAGCAG CCGCGGTA-3’；5’FAM-labelled） 和 1541R（5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’）；乳酸菌引物 7F（5’-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’；5’HEX-labelled）和 677R（5’-CACCGCTACACATGGAG-3’）。其中7F為非特異引物，677R是根據(jù)4個重要乳酸菌[12]設(shè)計的，包括Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus和Weissella。

反應(yīng)體系為20 μL，其中含有0.15 mmol/L的dNTP，0.5 mmol/L引物，1單位的TaqDNA聚合酶，1倍的PCR反應(yīng)緩沖液，1 μL基因組DNA。

運(yùn)行程序為：94℃預(yù)變性2 min，前30個循環(huán)在94℃變性45 s，64℃（通用引物）或66℃（乳酸菌引物）退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)30次，結(jié)束后72℃保持10min。被標(biāo)記的PCR產(chǎn)物（約200 ng）用MspI或HinfI在37℃消化4 h，最后用373A自動測序儀對限制性片段進(jìn)行分析（重復(fù)兩次）。

利用T-REX軟件分析每個樣本的數(shù)據(jù)和峰值區(qū)域。根據(jù)電泳圖譜對T-RFLP數(shù)據(jù)進(jìn)行出峰分類。利用DNA序列限制性酶切位點在線服務(wù)平臺（http：//rna.lundberg.gu.se/cutter2/） 預(yù)測 DNA 擴(kuò) 增片段的酶切位點。對非靶標(biāo)DNA末端限制性片段去除后，用Sorensen相似性指數(shù)分析數(shù)據(jù)，運(yùn)用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。為了區(qū)分峰值與噪音，數(shù)據(jù)分析僅局限于大于樣品總峰值區(qū)域1%的TRF。利用微生物菌群分析網(wǎng)站（MiCA）的電腦模擬消化法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)庫和本研究的454測序結(jié)果來確定微生物種類。MiCA網(wǎng)站有利用核糖體數(shù)據(jù)庫RDP Release 10編輯得到的高質(zhì)量16S rRNA基因序列。

1.4 16S rRNA基因擴(kuò)增子的測序

運(yùn)用454測序儀研究與制麥相關(guān)的乳酸菌菌群。用正向引物341F（5’-CCTACGGGAGGCAG CAG-3’）和乳酸菌反向特異引物677R擴(kuò)增樣品。擴(kuò)增出約423 bp的產(chǎn)物，覆蓋了16S rRNA基因V3～V4區(qū)域，適合于454焦磷酸測序[13]。對DNA樣品進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗證，擴(kuò)增產(chǎn)物使用Qiagen PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。用熒光儀對純化后的產(chǎn)物定量，取等量濃度產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序過程按照454羅氏GS FLX說明書進(jìn)行。利用Biopython將序列根據(jù)5’和3’特有標(biāo)記對應(yīng)到相應(yīng)的樣品。每50 bp移動窗口中，根據(jù)Phred最小值25進(jìn)行序列刪減（0.3%的誤差率）。最短和最長序列設(shè)定為315和330個核苷酸，舍棄不確定的堿基序列和同源多聚體數(shù)量多于8的序列。用Uchime嵌合體檢測程序檢測嵌合體，去除嵌合體后與SILVA參考序列比對。利用臨界算法去掉3%的差異序列，將序列分成不同的OTU。通過在GenBank上比對來確定該OTU。再利用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（RDP）的網(wǎng)站（http：//rdp.cme.msu.edu/）進(jìn)一步確定結(jié)果。將兩次乳酸菌數(shù)據(jù)混合，剔除單體（在所有樣本中僅有一個序列的OTU）后，利用Mothur和R生成稀疏曲線，評估樣本和OTU數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

2.1T-RFLP分析

為了研究制麥過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)，采用TRFLP技術(shù)研究完整的細(xì)菌菌群和乳酸菌菌群。末端限制性片段長度多態(tài)性方法是將PCR引物中的一條進(jìn)行熒光標(biāo)記，用合適的限制性內(nèi)切酶將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物消化，在酶切后產(chǎn)生的許多不同長度的限制性片段中只有末端帶有熒光標(biāo)記的片段才能被監(jiān)測到。通過分析這些熒光信號生成的T-RFLP圖譜，可以揭示樣品中微生物的數(shù)量、種類和種群規(guī)模，從而幫助了解微生物菌群的結(jié)構(gòu)、功能及動態(tài)變化。

2.1.1 細(xì)菌菌群 在14個樣本中（見圖1），MspI消化獲得38個不同細(xì)菌的TRF，HinfI消化獲得53個TRF。每個樣品用MspI消化后的TRF數(shù)量為4～16個，用HinfI消化后的TRF數(shù)量為6～26個，說明制麥過程細(xì)菌多樣性相對有限。圖1為采用TRFLP 技術(shù)分析收獲于 2012 年[圖 1（a）]和 2013 年[圖1（b）]江蘇單二大麥在不同制麥方式下微生物末端限制片段的相對數(shù)量和分布情況（HinfI消化，取兩次實驗的平均值。峰面積超過所有樣品總面積的10%的TRF被保留，其他 TRF列為一組“其他TRFs”）。幾乎所有樣品都有少數(shù)的特征TRF。所有樣本中有6個TRF總量超過3%，包括136、332、630、738、796 bp和824 bp，分別占總樣本的4%、3%、7%、16%、18%和20%。樣本中均有136、738 bp和824 bp的TRF。796 bp的TRF存在所有非大麥樣品中。這些TRF對應(yīng)種屬如下：136 bp：Enterobacter和Sphingobacterium；332 bp：Wautersiella和Cryseobacterium；630 bp：Curtobacterium和Propionobacterium；738 bp：Weissella，Lactobacillus，Lactococcus和Streptococcus；796 bp：Acinetobacter和Stenotrophomonas；824 bp：Leuconostoc和Pseudomonas。

圖1 T-RFLP分析制麥微生物末端限制片段的相對數(shù)量和分布情況Fig.1 Relative abundance and distribution of the most dominant bacterial terminal restriction fragments obtained by T-RFLP analysis

其 中Lactobacillus、Lactococcus、Streptococcus和Weissella常見于發(fā)芽過程[14]。大麥中的TRF個數(shù)約占所有樣品的75%，也就是說制麥環(huán)境中增加了1/3的外源微生物。

為了比較不同樣品中細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的區(qū)別，用NTsys 2.1e軟件對T-RFLP數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。聚類結(jié)果表明，樣品基本可以根據(jù)工藝步驟進(jìn)行分組（圖1（a）），說明細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)隨著制麥工序的不同而變化。兩個年份大麥樣品被分為一組；發(fā)芽過程的綠麥芽樣品和最終的麥芽樣品分為一組。不同發(fā)芽方式之間并沒有明顯的區(qū)別。另外，相同年份的綠麥芽和最終成品麥芽相似度更高。大麥和麥芽的細(xì)菌菌落相似性只有12%。微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化主要是因為大麥在發(fā)芽過程所處環(huán)境不同所引起，如發(fā)芽溫度16～20℃，非常適合微生物生長繁殖，導(dǎo)致微生物菌落在整個發(fā)芽過程顯著增加。同樣，成品麥芽經(jīng)過80～85℃的高溫焙焦，殺滅了大部分綠麥芽上的微生物，導(dǎo)致成品麥芽中微生物數(shù)量和種類減少。

圖2 非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類圖Fig.2 Unweighted-pair group method with arithmetic mean（UPGMA） dendrogram

2.1.2 乳酸菌菌群 經(jīng)過T-RFLP分析，乳酸菌有30個不同的TRF，用MspI酶切后每個樣品有4～15個TRF。用乳酸菌特異性引物（7F-677R）檢測乳酸菌Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus和Weissella，與整個細(xì)菌菌落相似，主要的TRF存在于所有研究樣品中，如圖3所示。然而，與整個細(xì)菌菌落相反，在過程階段未進(jìn)行區(qū)分，其樹形圖相對較分散，見圖2（b）。T-RFLP分析是基于擴(kuò)增片段經(jīng)過酶切后長度不同。所有樣品中3個最主要的TRF分別對應(yīng)553、578 bp和583 bp，相應(yīng)峰面積分別為39%、15%和23%。根據(jù)這些TRF的模擬酶切結(jié)果，推測這 3個 TRF分別是Leuconostoc、Lactobacillus和Weissella。

圖3 T-RFLP分析制麥乳酸菌末端限制片段的相對數(shù)量和分布情況Fig.3 Relative abundance and distribution of the most dominant bacterial terminal restriction fragments representing lactic acid bacteria obtained by TRFLP analysis

2.2 乳酸菌16S rRNA基因擴(kuò)增子的焦磷酸測序

采用454焦磷酸測序技術(shù)重點研究乳酸菌菌群情況，排除3%以上差異的序列后分成139個運(yùn)算分類單元（OUT），其中102個與乳酸菌有關(guān)。發(fā)芽大麥和麥芽的非乳酸菌序列占比很少，約2%。大麥的非乳酸菌序列占比較多，約13%，這可能是由于大麥樣品的乳酸菌含量較低。傳統(tǒng)MRS平板計數(shù)實驗表明，大麥中細(xì)菌有107cfu/g，乳酸菌大約有1×103cfu/g，發(fā)芽后直至麥芽中乳酸菌含量達(dá)到1×106～1×108cfu/g[15]。所以大麥樣品中存在較多的非乳酸菌序列可能是因為引物錯配導(dǎo)致一些非特異DNA被擴(kuò)增。除去單體后，與乳酸菌相關(guān)的序列有33624個，平均317 bp，屬于47個OTU。每個樣本序列數(shù)量為517～4874（平均 2402），每個 OUT 序列數(shù)量為2～9548。有14個OTU序列數(shù)量大于所有樣品總數(shù)的0.1%，這14個主要的OTU占每個樣本中乳酸菌序列超過98%，如表1和圖4所示。在所有樣本中，至少有97%的序列與大麥樣本有關(guān)，表明在麥芽生產(chǎn)過程中，大麥攜帶的微生物起著重要作用，T-RFLP分析也證明了此結(jié)論。此外，5個主要的 OUT：OTU100、101、102 為Weissella屬（魏斯菌屬），OTU093為Lactobacillus屬（乳桿菌屬）和OTU098為Leuconostoc屬（明串珠菌屬）。這5個OUT在樣品中均存在，覆蓋率達(dá)88%。

魏斯菌屬是制麥過程中最主要的乳酸菌，有3個主要OTU，占所有序列的63%。乳桿菌屬是第2優(yōu)勢屬，占所有序列的20%。第3是明串珠菌屬，占所有序列的11%。由圖4可知，2個不同年份的樣品間乳酸菌菌群存在巨大差異：2012年的乳桿菌比2013年更豐富，2013年收獲的大麥乳桿菌相對含量與2012年相比急劇下降；魏斯菌屬在2013年更加豐富，在整個過程中相對含量始終較高，平均為82%。不同年份魏斯菌屬的主要OUT也不同，2012年以O(shè)TU102為主，而2013年以O(shè)TU101為主。其次，兩種發(fā)芽方式主要的種屬也不同：2012年塔式制麥以乳酸桿菌為主，而微型制麥以魏斯菌屬為主。此外，Pediococcus幾乎只在2012年的微型制麥系統(tǒng)中檢測到，發(fā)芽1 d后占乳酸菌菌群11.2%，5 d后占4.6%，占麥芽的12.3%。對于大麥來說，片球菌在2012年占32.6%，在2013年含量較低，僅占大麥乳酸菌菌群1.6%，在制麥過程中約占0.1%。

表1 制麥過程乳酸菌主要運(yùn)算分類單元Table1 Lactic acid bacteria operational taxonomic units identified in this study

圖4 采用454焦磷酸測序技術(shù)分析制麥過程中優(yōu)勢乳酸菌的相對數(shù)量和分布情況Fig.4 Relative abundance and distribution of the most dominantlacticacid bacteria during malting based on 454 pyrosequencing

與T-RFLP相比，聚類分析基本是把樣品按照年份分組，見圖2（c）。用454焦磷酸測序分析發(fā)現(xiàn)：在麥芽生產(chǎn)過程中，不同制麥方式的同一批次大麥中乳酸菌菌落結(jié)構(gòu)具有顯著差異。例如，Pediococcus僅在微型制麥系統(tǒng)中被檢測到。據(jù)報道，Pediococcus可以提高麥芽質(zhì)量[10]：有利于制麥過程中有益酵母生長并且限制有害細(xì)菌和鐮刀真菌生長，同時提高麥芽的特性，包括降低麥汁粘度和β-葡聚糖含量，提高木聚糖酶和微生物β-葡聚糖酶活性，最終改善麥芽過濾性能。另外，微型制麥的麥芽脆度較高，未溶解的大麥較少，這些都有助于提高麥芽質(zhì)量。但Pediococcus是否起作用還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 語

在制麥過程中，大麥中整個細(xì)菌菌落組成有限，通過T-RFLP分析發(fā)現(xiàn)菌落結(jié)構(gòu)在制麥過程中是變化的，可能是在制麥過程中受環(huán)境影響所致。454焦磷酸測序法分析乳酸菌菌群結(jié)果表明：在樣品中均有 5個 OTU，分別是代表了Weissella、Lactobacillus和Leuconostoc。454測序結(jié)果還表明，不同年份收獲的大麥其菌群結(jié)構(gòu)不同，而T-RFLP法并未檢測到這點。此外，454測序結(jié)果顯示：同一批次大麥在不同的制麥系統(tǒng)中乳酸菌菌落結(jié)構(gòu)也存在顯著不同。

T-RFLP和454焦磷酸測序結(jié)果都證明大麥本身攜帶的微生物種類與制麥過程條件無關(guān)。然而，微生物的相對數(shù)量卻由制麥過程工藝參數(shù)決定。隨著對這些微生物的深入了解及有效控制，本研究結(jié)果將作為微生物制麥技術(shù)的基礎(chǔ)依據(jù)。