響應(yīng)面法優(yōu)化青春雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基

朱蒙蒙 ，李國(guó)瑩 ，顧秋亞 ，余曉斌 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

雙歧桿菌是動(dòng)物消化道內(nèi)具有益生作用的優(yōu)勢(shì)菌，促進(jìn)消化和礦物質(zhì)的吸收，維持腸道微生物平衡，改進(jìn)免疫系統(tǒng)反應(yīng)和提高對(duì)病原菌的抵抗力，降低癌癥、肥胖、糖尿病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)，調(diào)節(jié)血脂及血清膽固醇水平，治療炎癥、自身免疫反應(yīng)、過(guò)敏，抗腫瘤，抗衰老等[1-3]。青春雙歧桿菌（B.adolescentis）是青年個(gè)體腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，嬰兒出生2～3 d后青春雙歧桿菌開(kāi)始增殖，5 d后達(dá)到最高峰并占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在腸道內(nèi)菌群中占99%。但隨著人的年齡增高，青春雙歧桿菌在人體內(nèi)逐漸減少，體弱多病的老人腸道內(nèi)該菌幾乎消失，而健康的人仍能保持一定的青春雙歧桿菌在腸道內(nèi)存在。這也反映出人體腸道內(nèi)青春雙歧桿菌的數(shù)量乃是檢驗(yàn)人是否健康的一個(gè)指標(biāo)[4]。由于雙歧桿菌的嚴(yán)格厭氧，營(yíng)養(yǎng)條件要求苛刻[5]，生長(zhǎng)緩慢，對(duì)酸性環(huán)境抵抗力差，很難保持較高的活菌數(shù)。據(jù)報(bào)道，雙歧桿菌活菌數(shù)保持在106CFU/mL（或106CFU/g）以上才能有保健功效[6]，因此選擇增殖培養(yǎng)基是提高活菌數(shù)的重要手段之一。

目前提高雙歧桿菌培養(yǎng)液活菌數(shù)主要通過(guò)改善培養(yǎng)基組分實(shí)現(xiàn)。如改變培養(yǎng)基原有成分添加量[7]，或者培養(yǎng)基中添加增殖因子如低聚糖、氨基酸等[8-10]，或者植物浸出液培養(yǎng)基中添加碳源、氮源等成分[11-13]。大量文獻(xiàn)[14-17]采用正交試驗(yàn)對(duì)雙歧桿菌培養(yǎng)基中碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、增殖因子等因素交互作用進(jìn)行有限的優(yōu)化，但這些方法的不足在于僅能比較各因素已選定水平的優(yōu)劣，無(wú)法提供未考察區(qū)域的信息[8]。MEENA等[18]采用響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)條件、碳源、氮源含量等，混合培養(yǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌；ABDUL等[19]采用響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基中脫脂奶粉、酵母膏、葡萄糖，提高B.pseudocatenulatumG4生物量等，更加精確地確定培養(yǎng)基組分。

本研究中以青春雙歧桿菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，MRS（Man Rogosa and Sharpe Medium）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，由低聚果糖和葡萄糖的復(fù)配代替葡萄糖，正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合氮源中胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉的含量，然后確定合適的碳氮總量和碳氮比，選擇合適的緩沖鹽濃度，最后用Box-Benhnken Design（BBD）試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)成分，在提高活菌數(shù)的同時(shí)縮短培養(yǎng)時(shí)間，為雙歧桿菌增殖培養(yǎng)奠定一定的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 青春雙歧桿菌（B.adolescentis）為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 脫脂乳培養(yǎng)基：10 g/dL脫脂奶粉，1 g/dL葡萄糖；MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，牛肉膏 5.0 g，酵母粉 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，K2HPO4·3H2O 2.0 g， 檸檬酸銨 2.0 g， 乙酸鈉 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， 吐溫-801.0 mL，MnSO4·H2O 0.05 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.5，121℃滅菌20 min；固體培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基+2 g/dL瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)：蘇州空氣凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；鼓風(fēng)干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；紫外可見(jiàn)-分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C酸度計(jì)：上海精科儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平：常熟市百靈天平儀器有限公司產(chǎn)品；厭氧裝置：日本三菱公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化 將甘油管保藏的菌種涂布于固體培養(yǎng)，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，用接種環(huán)挑取單菌落接種于脫脂奶粉培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)36 h；以體積分?jǐn)?shù)2%接種量，取上述菌液于新鮮MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，活化2次后備用。

1.3.2 吸光度和pH測(cè)定 菌體密度（A600nm）由紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定，pH由PHS-3C酸度計(jì)測(cè)定。1.3.3 活菌計(jì)數(shù) 采用稀釋涂布法，以10倍梯度稀釋?zhuān)x取適當(dāng)稀釋度均勻涂布于固體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后，計(jì)數(shù)[20]。

1.3.4 培養(yǎng)基優(yōu)化 先考察復(fù)配碳源（葡萄糖和低聚果糖質(zhì)量比為 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、復(fù)配氮源組分、碳源總量（4、5、6 g/dL）與碳氮質(zhì)量比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、緩沖鹽體系質(zhì)量濃度（0、4.5、9.0、13.5、18.0 g/L）對(duì)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響，再通過(guò)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析確定最佳培養(yǎng)基組分，試驗(yàn)編碼與水平見(jiàn)表1。

1.4 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的比較

經(jīng)活化的菌種以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量分別接種于MRS和增殖培養(yǎng)基，37℃厭氣培養(yǎng)，每隔4 h取樣測(cè)得吸光度A600nm，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的A600nm為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)[15]，同時(shí)測(cè)得培養(yǎng)基pH。

表1 試驗(yàn)編碼與水平Table1 Factors and levels of central composite design（g/L）

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對(duì)青春雙歧桿菌增殖的影響

2.1.1 碳源對(duì)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響 碳源是影響微生物生長(zhǎng)和代謝的最主要的因素之一。乳酸菌代謝產(chǎn)物主要是有機(jī)酸，其主要的元素為碳。葡萄糖是雙歧桿菌培養(yǎng)基中最主要的底物，低聚糖是一類(lèi)雙歧因子，能夠促進(jìn)雙歧桿菌體外生長(zhǎng)[21]，兩者復(fù)配作為最終碳源，對(duì)青春雙歧桿菌具有增殖作用。由圖1可以看出：當(dāng)葡萄糖與低聚果糖質(zhì)量之比為 1∶1 時(shí)活菌數(shù)最大，達(dá)到 6.3×108CFU/mL，MRS培養(yǎng)基中氮源碳源總量為2 g/dL，因此2種糖的添加質(zhì)量濃度均為10 g/L。

圖1 青春雙歧桿菌在復(fù)配碳源中活菌數(shù)Fig.1 Viable count of B.adolescentis with compound carbon sources

2.1.2 氮源的正交優(yōu)化 雙歧桿菌的生長(zhǎng)需要復(fù)雜的氮源底物，豐富的氮源對(duì)其生長(zhǎng)有較大的影響[11]。由表 2 得極差值RA＞RC＞RB，即胰蛋白胨促進(jìn)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)能力最強(qiáng)，其次是酵母粉、牛肉膏，得到最優(yōu)的氮源組合是A3B2C3，而由A600nm結(jié)果可知，培養(yǎng)基氮源組合8的菌體密度最高，即A3B2C1，因此需要作進(jìn)一步的驗(yàn)證。

表 2 氮源 L9（34）正交試驗(yàn)Table2 Orthogonal test L9（34） of nitrogen source

經(jīng)驗(yàn)證方案A3B2C3的A600nm為1.476，比組合8（A3B2C1）的試驗(yàn)結(jié)果高，所以確定最優(yōu)的氮源組合是A3B2C3，即胰蛋白胨、牛肉膏和酵母粉的質(zhì)量比為5∶3∶4，MRS 培養(yǎng)基中氮源質(zhì)量濃度為 2 g/dL，因此三者的添加質(zhì)量濃度分別是8.33、5.0、6.67 g/L。

2.1.3 碳氮總量與碳氮比對(duì)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響 碳氮總量和碳氮比會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生不同的影響。從圖2可以看到，當(dāng)培養(yǎng)基中的碳氮總量為6 g/dL，碳氮質(zhì)量比為1∶1時(shí)，青春雙歧桿菌的菌體密度最大，因此確定碳氮質(zhì)量濃度為6 g/dL，碳氮比為 1∶1。

圖2 不同碳氮總量和比例下的青春雙歧桿菌菌體密度Fig.2 Density of B.adolescentis with different concentration and proportion of carbon and nitrogen sources

2.1.4 緩沖鹽對(duì)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響 雙歧桿菌代謝途徑中采用果糖-6-磷酸途徑進(jìn)行己糖發(fā)酵，產(chǎn)生乙酸、乳酸和少量的甲酸[22]，這些有機(jī)酸使得培養(yǎng)基pH值不斷降低，對(duì)細(xì)胞本身形成酸脅迫，抑制菌體的生長(zhǎng)。緩沖鹽體系能夠與酸性物質(zhì)中和，對(duì)穩(wěn)定pH和降低對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制方面起著很大的作用。結(jié)果表明：隨著緩沖鹽質(zhì)量濃度的增加，菌體密度越來(lái)越大隨后保持不變，所以緩沖鹽質(zhì)量濃度選用13.5 g/L，即檸檬酸銨、K2HPO4·3H2O、乙酸鈉分別為 3、3、7.5 g/L。

圖3 不同緩沖鹽質(zhì)量濃度下的青春雙歧桿菌菌體密度Fig.3 Density of B.adolescentis with different concentration buffer salt

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化增殖培養(yǎng)基配方

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，以碳源、氮源、緩沖鹽為自變量，OD600為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)。試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table3 Test design and results of Box-Benhnken

利用Design Expert 8.06軟件進(jìn)對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到青春雙歧桿菌菌體密度（Y）與培養(yǎng)基中的碳源（A）、氮源（B）、緩沖鹽（C）的多項(xiàng)回歸方程為：Y=1.48+0.062A-0.017B-0.047C+0.009AB+0.008AC+0.017BC-0.22A2-0.13B2-0.11C2。

2.2.2 Box-Benhnken方差分析 通過(guò)表4方差分析可得，該模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)P=0.2114不顯著。模型確定系數(shù)R2=0.9954，矯正系數(shù)R2adj=0.9895，說(shuō)明模型和試驗(yàn)設(shè)計(jì)相比擬合性比較高，很好地反應(yīng)青春雙歧桿菌菌體密度與培養(yǎng)基中碳源、氮源、緩沖鹽的關(guān)系。模型中一次項(xiàng)A、C極顯著，B顯著；交互項(xiàng)AB、BC、BC均不顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2均處于極顯著水平。

表4 Box-Benhnken方差分析Table4 Analysis of variance for Box-Benhnken

2.2.3 響應(yīng)面分析 利用Design Expert 8.06繪制出響應(yīng)面圖及其等高線(xiàn)圖（圖4～6）。其中等高線(xiàn)的形狀代表兩兩因素交互作用的強(qiáng)弱，圓形代表兩因素間的交互作用弱，橢圓則反之；等高線(xiàn)密集表明對(duì)響應(yīng)值影響較大，稀疏則表明影響較小。通過(guò)方程可得，二次項(xiàng)的系數(shù)均為負(fù)值，其所表征的拋物面開(kāi)口向下，具有極大值點(diǎn)。經(jīng)軟件分析得到青春雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基的最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖15.85 g/L、低聚果糖15.85 g/L、胰蛋白胨12.04 g/L、牛肉膏7.23 g/L、酵母粉9.63 g/L、檸檬酸銨2.75 g/L、K2HPO4·3H2O 2.75 g/L、乙酸鈉 6.875 g/L、吐溫-80 1.0 mL、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L。青春雙歧桿菌在該培養(yǎng)基成分下進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，得到OD600的平均值為1.476，與預(yù)測(cè)值1.490擬合率達(dá)99.06%，優(yōu)化模型合理可靠。

圖4 碳源與氮源對(duì)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of carbon source and nitrogen source on the growth of B.adolescentis

圖5 碳源與緩沖鹽對(duì)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of carbon source and buffered salt on the growth of B.adolescentis

圖6 氮源與緩沖鹽對(duì)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of nitrogen source and buffered salt on the growth of B.adolescentis

2.3 青春雙歧桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和pH的變化

從圖7中可以看出，青春雙歧桿菌在增殖培養(yǎng)基中沒(méi)有明顯的延滯期，28 h達(dá)到穩(wěn)定期，比優(yōu)化前縮短近12 h，此時(shí)活菌計(jì)數(shù)，培養(yǎng)基中活菌數(shù)達(dá)到8.9×109CFU/mL，是優(yōu)化前的1.73倍；在對(duì)數(shù)期，微生物的代謝產(chǎn)生大量的有機(jī)酸使得pH快速降低，在28 h后基本趨于穩(wěn)定，與優(yōu)化前相比pH降低速度過(guò)快并沒(méi)有對(duì)菌體生長(zhǎng)造成抑制。

圖7 青春雙歧桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)和pH變化Fig.7 Growth curves and pH changes of B.adolescentis

3 結(jié) 語(yǔ)

利用響應(yīng)面法對(duì)青春雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到增殖培養(yǎng)基配方：葡萄糖15.85 g/L、低聚果糖15.85 g/L、胰蛋白胨12.04 g/L、牛肉膏7.23 g/L、酵母粉 9.63 g/L、檸檬酸銨 2.75 g/L、K2HPO4·3H2O 2.75 g/L、乙酸鈉 6.875 g/L、吐溫-801.0 mL、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L。青春雙歧桿菌在增殖培養(yǎng)基中28 h達(dá)到穩(wěn)定期，比優(yōu)化前縮短12 h，活菌數(shù)達(dá)到8.9×109CFU/mL，是優(yōu)化前的1.73倍，在縮短培養(yǎng)時(shí)間的同時(shí)也提高了發(fā)酵液的活菌數(shù)。