吸附交聯(lián)法固定化蔗糖異構(gòu)酶及其在異麥芽酮糖制備中的應(yīng)用

耿夢(mèng)華 ，陳 晟 ，吳 敬 ，吳 丹 *

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

異麥芽酮糖（isomaltulose），又名帕拉金糖，是蔗糖的同分異構(gòu)體[1-3]。與蔗糖相比，異麥芽酮糖熱量低、甜度低、不致齲齒[4]。人體食用異麥芽酮糖后，會(huì)在血液中以較緩慢的速度代謝為果糖和葡萄糖，不影響體內(nèi)胰島素的分泌，特別適合于糖尿病人及肥胖人群食用[5]。因此，現(xiàn)在越來越多的人開始關(guān)注和食用異麥芽酮糖。

異麥芽酮糖的生產(chǎn)方法主要有生物轉(zhuǎn)化法和化學(xué)轉(zhuǎn)化法。由于化學(xué)轉(zhuǎn)化法的高能耗、高污染等問題，目前國內(nèi)外生產(chǎn)異麥芽酮糖普遍采用基于生物催化的蔗糖異構(gòu)化法[6-12]，即利用微生物合成的蔗糖異構(gòu)酶（EC 5.4.99.11，sucrose isomerase，SIase）以蔗糖為底物酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)異麥芽酮糖，催化作用反應(yīng)式如圖1。生物轉(zhuǎn)化法主要有細(xì)胞轉(zhuǎn)化法和酶轉(zhuǎn)化法兩種。細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是直接發(fā)酵菌體或?qū)⒕w固定化來轉(zhuǎn)化蔗糖。生產(chǎn)強(qiáng)度低、菌體濃度低及易污染雜菌等問題是在利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)異麥芽酮糖時(shí)無法避免的，而酶轉(zhuǎn)化法一般不存在上述問題，所以目前一般是將蔗糖異構(gòu)酶從微生物細(xì)胞中提取出來，再通過游離酶或固定化酶將蔗糖轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖。相比于游離酶，固定化酶由于其良好的操作穩(wěn)定性及存儲(chǔ)穩(wěn)定性、產(chǎn)物易分離等優(yōu)點(diǎn)而使酶的工業(yè)化應(yīng)用更加經(jīng)濟(jì)。

目前關(guān)于蔗糖異構(gòu)酶固定化的報(bào)道較少。國外僅見FABIANO等[13]以硅藻土吸附法與微膠囊包埋法兩種方法對(duì)Erwinia sp.來源的蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定化，然而這兩種方法所制得的固定化酶酶活力回收率及操作穩(wěn)定性都較差；國內(nèi)僅見南京工業(yè)大學(xué)的WU等[14]以ε-poly-L-lysine修飾過的介孔TiO2為載體對(duì)蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定化，所得固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性與酶活力回收率，且材料較為新穎，但是考慮到成本問題，此方法并不能用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，尋求一種成本經(jīng)濟(jì)、操作簡單、酶活力回收率高且操作穩(wěn)定性良好的蔗糖異構(gòu)酶的固定化方法仍然是目前亟待解決的問題。

圖1 蔗糖異構(gòu)酶生物催化蔗糖反應(yīng)式Fig.1 Reaction of sucrose isomerase biocatalysis sucrose

殼聚糖是天然的堿性多糖，吸附性強(qiáng)，常用于酶的固定化[15-16]。本研究擬以殼聚糖微球?yàn)檩d體、戊二醛為交聯(lián)劑，對(duì)重組工程菌來源的蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定化，考察各種固定化條件對(duì)酶活回收率的影響，并對(duì)固定化酶的最佳轉(zhuǎn)化條件及固定化酶重復(fù)使用穩(wěn)定性進(jìn)行探討，以期為提高蔗糖異構(gòu)酶的利用效率、降低異麥芽酮糖的生產(chǎn)成本提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

菌種：短小芽孢桿菌（B.brevis/pSVEB-palILSP）由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

試劑：牛肉蛋白胨（CP）購自杭州木木生物科技有限公司，大豆蛋白胨（CP）購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，殼聚糖（脫乙酰度＞90%，CP）購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，戊二醛（CP）購自阿拉丁公司，異麥芽酮糖、海藻酮糖（GR）購自Sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)AR級(jí)。

儀器：AR 2140型電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，冷凍立式離心機(jī)購自日本Hitachi公司，Agilent 1200高效液相色譜購自美國Agilent公司，小型高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，UV-1100紫外可見分光光度計(jì)購自日本Shimadzu公司，空氣恒溫?fù)u床購自上海精密儀器儀表有限公司，HZ-9212 SB水浴恒溫振蕩器購自太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蔗糖異構(gòu)酶游離酶的制備 將藏于本實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱的短小芽孢桿菌甘油管以體積分?jǐn)?shù)2‰的接種量接種于含有30 μg/mL新霉素的10 mL的 TM 培養(yǎng)基中，于200 r/min、30℃培養(yǎng) 8～10 h，制得種子液。按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接入含有30μg/mL新霉素的50 mL的TM培養(yǎng)基，30℃，200 r/min培養(yǎng)48 h后，將發(fā)酵液在12000 r/min、4℃下離心10 min，上清液即為SIase粗酶液。

1.2.2 蔗糖異構(gòu)酶固定化方法的優(yōu)化 殼聚糖載體的制備：將一定質(zhì)量的殼聚糖溶解于體積分?jǐn)?shù)2.0%的醋酸溶液中，待形成均一透明的膠體后用注射器將其滴加到4 mol/L的氫氧化鈉溶液中（滴加時(shí)注意針頭與液面的距離并保持垂直），形成直徑為2.0 mm左右的微球，后用蒸餾水洗至中性。將制好的殼聚糖微球加入到一定濃度的戊二醛溶液中，4℃放置2 h后用蒸餾水洗去多余的戊二醛，將殼聚糖小球4℃條件下保存于蒸餾水中備用。

蔗糖異構(gòu)酶的固定化：稱取5.0 g濕殼聚糖微球，加入10 mL含一定單位酶活的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0），于 4 ℃振蕩吸附交聯(lián)一定時(shí)間后取出抽濾，用蒸餾水洗去未交聯(lián)游離酶，即得到固定化酶。

采用單因素實(shí)驗(yàn)分別研究殼聚糖質(zhì)量濃度（2、3、4、5 g/dL）、戊二醛加量（體積分?jǐn)?shù)）（0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、2.0%、3.0%）、酶加量（30、50、70、100、200 U/g）和固定化時(shí)間（4、6、12、16、20、24 h）對(duì)固定化效果的影響。

1.2.3 酶活力測定 將900 μL含有蔗糖的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0）加入到1.5 mL的EP管中，加入100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，使得蔗糖的終質(zhì)量濃度為100 g/L。將混合液振蕩混勻，置30℃的水浴中反應(yīng)15 min，高溫滅酶，離心取上清。利用HPLC檢測反應(yīng)樣品中異麥芽酮糖的含量。

酶活力單位定義：上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1 μmol異麥芽酮糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

固定化酶活力的測定只需要將100 μL適當(dāng)稀釋的酶用一定質(zhì)量的固定化酶代替，其他步驟相同。固定化酶活收率計(jì)算公式如下：

式（1）中，R為固定化酶活回收率；K0為加入游離酶總活力；K1為固定化酶總活力。

1.2.4 固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖工藝優(yōu)化

1）溫度對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的影響。用pH 6.0的磷酸緩沖液溶解400 g/L的蔗糖作為底物，固定化酶加量為20 U/g，反應(yīng)初始pH 6.0， 分別置于 20、25、30、35、40、45、50 ℃水浴恒溫振蕩器中，150 r/min，轉(zhuǎn)化12 h。HPLC檢測，計(jì)算產(chǎn)物得率。

2）pH值對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的影響。分別用 pH 值為 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的磷酸緩沖液配制400 g/L的蔗糖作為底物，固定化酶加量為20 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒溫振蕩器，轉(zhuǎn)化12 h。HPLC檢測，計(jì)算產(chǎn)物得率。

3）加酶量對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的影響。以pH 4.5的400 g/L的蔗糖作為底物，固定化酶加量分別為 5、10、15、20、25 U/g 和 30 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)化12 h。HPLC檢測，計(jì)算產(chǎn)物得率。

4）底物質(zhì)量濃度對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的影響。分別配制pH 4.5的 200、300、400、500、600、700 g/L 和 800 g/L 的蔗糖溶液，固定化酶加量為15 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)化12 h。HPLC檢測，計(jì)算產(chǎn)物得率。

5）反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的影響。以pH 4.5的400 g/L的蔗糖作為底物，加酶量為15 U/g，置于30℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的水浴恒溫振蕩器中，每隔一定時(shí)間取樣500 μL。HPLC檢測，計(jì)算產(chǎn)物得率。

1.2.5 HPLC檢測法計(jì)算異麥芽酮糖產(chǎn)物得率 轉(zhuǎn)化后的樣品滅酶后離心，取上清適當(dāng)稀釋，過濾后備用。HPLC檢測條件參考程勝等[17-18]的方法：流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)80%的乙腈，超聲脫氣20 min，流速為0.8 mL/min；柱溫 30℃。

式（2）中，I為異麥芽酮糖產(chǎn)物得率；A1為樣品峰面積；C為標(biāo)樣濃度；V為樣品體積；k為樣品稀釋倍數(shù)；A0為標(biāo)樣峰面積；m為底物蔗糖質(zhì)量。

1.2.6 固定化酶的操作穩(wěn)定性研究 以pH 4.5的600 g/L的蔗糖溶液為底物，固定化酶加量為15 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)化10 h后將反應(yīng)液移出，用磷酸緩沖液（pH 4.5）淋洗固定化酶至檢測不出糖，加入底物進(jìn)行新一批的反應(yīng)，連續(xù)轉(zhuǎn)化16批。用HPLC檢測每批異麥芽酮糖生成量，計(jì)算各批次產(chǎn)物得率及固定化酶的殘余酶活，考察固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 蔗糖異構(gòu)酶游離酶的制備

SDS-PAGE電泳如圖2，在大約65×103處即為目的蛋白條帶。

圖2 蔗糖異構(gòu)酶SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the sucrose isomerase

2.2 蔗糖異構(gòu)酶固定化方法的優(yōu)化

2.2.1 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)固定化酶活回收率的影響 在戊二醛加量為1%、加酶量為50 U/g、固定化時(shí)間為12 h的條件下研究不同殼聚糖濃度對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶酶活回收率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，于3 g/dL的殼聚糖質(zhì)量濃度下酶活力回收率達(dá)到最大值為53.8%。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，殼聚糖濃度大小會(huì)影響溶液的密度和黏度，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度為1 g/dL時(shí)，制得的殼聚糖溶液黏度低。隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增加，酶活力和酶活力回收率均達(dá)到較好的效果。殼聚糖的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大則濃度過高，粘結(jié)成塊，這一現(xiàn)象與湯衛(wèi)華等[19]的研究結(jié)果一致。因此選擇殼聚糖的質(zhì)量濃度為3 g/dL。

圖3 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶活力回收率的影響Fig.3 Effect of chitosan conversation on recovery of immobilized enzyme

2.2.2 戊二醛加量對(duì)固定化酶活回收率的影響在殼聚糖質(zhì)量濃度為3.0 g/dL、加酶量為50 U/g、固定化時(shí)間為12 h的條件下研究戊二醛加量對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶酶活回收率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 戊二醛加量對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶活力回收率的影響Fig.4 Effect of glutaraldehyde concentration on recovery of immobilized enzyme

由圖4可知，酶活力回收率與戊二醛含量呈倒U型關(guān)系。戊二醛不僅是固定化酶反應(yīng)的交聯(lián)劑，同時(shí)可使酶變性。戊二醛加量增多，殼聚糖微球內(nèi)的游離醛基數(shù)則隨之增多，但過量的戊二醛基會(huì)導(dǎo)致酶失活。當(dāng)戊二醛加量為0.75%時(shí)，酶活回收率達(dá)到最大值55.6%。因此，選擇固定化酶的最適戊二醛加量為0.75%。

2.2.3 游離酶加量對(duì)固定化酶活回收率的影響 在殼聚糖質(zhì)量濃度為3.0 g/dL、戊二醛加量為0.75%、固定化時(shí)間為12 h的條件下研究不同酶加量對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶酶活回收率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 游離酶加量對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶活力回收率的影響Fig.5 Effect of free enzyme concentration on activity and recovery of immobilized enzyme

由圖5可以看出，當(dāng)加酶量為50 U/g時(shí)，酶活達(dá)到最大為27.6 U/g，繼續(xù)加大酶加量則固定化酶的活力增加不顯著。這可能和載體與酶的固定化作用方式有關(guān)。在酶加量與固定化上的游離醛基數(shù)量未達(dá)到平衡時(shí)，固定化酶的酶活隨給酶量的增加而增大，但當(dāng)載體上的醛基與酶作用達(dá)到飽和之后繼續(xù)加大酶加量，酶活不會(huì)再增加，相應(yīng)的酶活力回收率逐漸降低。綜合考慮酶制劑的成本、酶活和酶活力回收率，選擇加酶量為50 U/g。

2.2.4 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活回收率的影響在殼聚糖質(zhì)量濃度為3.0 g/dL、戊二醛加量為0.75%、加酶量為50 U/g的條件下，研究固定化時(shí)間對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶酶活力回收率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 固定化時(shí)間對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶活力回收率的影響Fig.6 Effect of immobilization time on activity and recovery of immobilized enzyme

由圖6可以看出，當(dāng)固定化時(shí)間達(dá)到16 h后，載體與酶的作用達(dá)到飽和，此時(shí)酶活力回收率達(dá)到70.3%，酶活為 35.2 U/g，酶固載量為 0.04 mg/g，因此選擇的固定化時(shí)間是16 h。

2.3 固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖工藝優(yōu)化

2.3.1 溫度對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的影響 如圖7所示，30℃時(shí)，異麥芽酮糖產(chǎn)物得率達(dá)到最大值83.4%。溫度升高或降低，產(chǎn)物得率均呈下降趨勢(shì)。這與蔗糖異構(gòu)酶同時(shí)具有水解與異構(gòu)活性有關(guān)。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，高溫可能有利于蔗糖的水解反應(yīng)，酶轉(zhuǎn)化體系中單糖含量會(huì)隨著溫度的升高而增加。而低溫雖然有利于異構(gòu)化，但此時(shí)酶的構(gòu)象更利于生成海藻酮糖。這與ZHANG等[20]研究Klebsiellasp.LX3蔗糖異構(gòu)酶的發(fā)現(xiàn)一致。綜合以上因素，以30℃為后續(xù)研究的反應(yīng)溫度。

圖7 溫度對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)物得率的影響Fig.7 Effect of temperature on the yield of isomaltulose

2.3.2 初始pH對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的影響 見圖8，當(dāng)初始pH為4.5時(shí)，異麥芽酮糖產(chǎn)物得率最高，達(dá)到84.8%。推測pH可能影響酶活性部位有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)，高于或低于最適pH值時(shí)，酶處于不利于催化的解離狀態(tài)。因此以4.5為最適pH。

圖8 初始pH對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)物得率的影響Fig.8 Effect of initial pH on the yield of isomaltulose

2.3.3 底物質(zhì)量濃度對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的影響 見圖9，底物質(zhì)量濃度為500 g/L時(shí)，產(chǎn)物得率達(dá)87.9%。而以500～700 g/L蔗糖為底物時(shí)，雖然轉(zhuǎn)化率基本保持恒定，但考慮到高質(zhì)量濃度的蔗糖時(shí)體系水活力較低，后續(xù)以質(zhì)量濃度600 g/L的蔗糖進(jìn)行試驗(yàn)。

圖9 底物質(zhì)量濃度對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)物得率的影響Fig.9 Effect of sucrose concentrations on the yield of isomaltulose

2.3.4 固定酶用量對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的影響 見圖10，異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化率隨著酶加量的增加而升高，當(dāng)酶用量為15 U/g時(shí)，產(chǎn)物得率達(dá)到最大85.2%。但隨著酶用量的繼續(xù)增加，異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化率稍微降低。故而以15 U/g為最優(yōu)酶加量。

圖10 加酶量對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)物得率的影響Fig.10 Effect of enzyme concentration on the yield of isomaltulose

2.3.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定化蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的影響 見圖11，在轉(zhuǎn)化10 h時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值87.8%，10 h后轉(zhuǎn)化率基本不變。因此，最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間可以選擇為10 h。

圖11 反應(yīng)時(shí)間對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)物得率的影響Fig.11 Effect of reaction time on the yield of isomaltulose

2.4 固定化酶的操作穩(wěn)定性研究

圖12為固定化酶連續(xù)轉(zhuǎn)化16次的產(chǎn)物得率與殘余酶活。固定化酶連續(xù)轉(zhuǎn)化10次，酶活保留率超過50%；連續(xù)轉(zhuǎn)化16次，產(chǎn)物得率仍有87.52%，顯示該固定化酶具有較好的操作穩(wěn)定性及較高的異麥芽酮糖合成能力。

圖12 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.12 Operational stability of immobilized enzyme

3 結(jié)語

本研究以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，采用吸附交聯(lián)法對(duì)重組工程菌來源的蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定化。結(jié)果表明，最佳固定化條件：殼聚糖質(zhì)量濃度3 g/dL、戊二醛加量0.75%、酶加量 50 U/g、固定化時(shí)間16 h，此時(shí)固定化酶活力回收率達(dá)到70.3%。重組酶制備異麥芽酮糖的最佳轉(zhuǎn)化條件：溫度 30 ℃、初始pH 4.5、酶用量 15 U/g，轉(zhuǎn)化 10 h，蔗糖質(zhì)量濃度600 g/L，異麥芽酮糖最大產(chǎn)物得率可以達(dá)到87.8%。在最佳的轉(zhuǎn)化條件下連續(xù)轉(zhuǎn)化16次，產(chǎn)物得率無明顯降低，顯示該固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性及較高的異麥芽酮糖合成能力，為固定化酶法合成異麥芽酮糖的工業(yè)化提供了一定的參考價(jià)值。