D-甘露糖異構酶的克隆表達及酶法制備D-甘露糖

胡 興，張 濤，沐萬孟，繆 銘，江 波*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

甘露糖是一種單糖，其名稱來源于圣經(jīng)中的英文單詞manna（甘露）一詞[1-2]。D-甘露糖與D-葡萄糖互為C2位差向異構體（圖1），是自然界中最常見的構型。食用富含D-甘露糖的食物被認為對健康有益，D-甘露糖主要存在于膳食纖維中半纖維素中。研究表明D-甘露糖與某些特定的免疫反應相關[3]，能預防細菌或病毒感染[4]，并且可以作為添加劑用在家禽飼料中，以防止沙門菌污染[5]。此外甘露糖也可以作為原料用于多種維生素、抗腫瘤試劑和免疫刺激試劑的生產(chǎn)[6]。

目前，制備D-甘露糖的方法主要有提取法[7]、化學法[8]和生物技術[9]等方法，其中目前商業(yè)售出的D-甘露糖大都由提取法制得，但與其他方法相比，酶法等生物技術方法在D-甘露糖制備中的地位越來越重要[10]，由廉價的糖經(jīng)酶異構化生產(chǎn)D-甘露糖是一種新型的綠色技術[11]，具有毒性低、安全性高、反應條件溫和及副產(chǎn)物少等優(yōu)點。目前興起的酶法生產(chǎn)甘露糖，主要通過D-甘露糖異構酶（D-mannose isomerase，MIase，EC 5.3.1.7） 生物轉化 D-果糖而來[12]。

圖1 D-果糖、D-甘露糖和D-葡萄糖的結構Fig.1 Structure of D-fructose，D-mannose and D-glucose

然而，目前國內(nèi)有關MIase基因表達及其用于轉化果糖生產(chǎn)甘露糖的報道較少，未成系統(tǒng)。因此，本研究主要從酶法制備角度考慮，對MIase的克隆表達，以果糖為底物時的酶學性質(zhì)及生產(chǎn)應用進行分析，旨在為推動MIase的研究與開發(fā)、D-甘露糖的生物制備提供理論指導和應用基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

基因來源菌株E.coliBL21?？寺∷拗鱁.coliDH5α、表達宿主E.coliBL21（DE3） 為本實驗室保藏。E.coli表達載體pET-28a（+）購自Novagen公司。2×TaqPCR Master Mix、DNA 回收試劑盒、PCR引物合成及測序工作均委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 重組MIase的克隆及表達

E.coliBL21基因組DNA抽提按細菌基因組DNA的小量制備方法[13]進行。參考GenBank中已公開的大腸桿菌 MIase基因（yihS；NCBI基因 ID：753778095；蛋白 ID：AJH12524）序列的特征，設計合成 PCR 引物。P1：5′-GCTCTAGAATGAAATGGT TTAACACCCTAAGCC-3′，P2：5′-CCGCTCGAGTT TCGCATTAATATCCAGCAGACC-3′， 其中，P1 包含XbaI限制性酶切位點，P2包含XhoI限制性酶切位點。用E.coliBL21全基因組DNA做模板進行PCR擴增，反應條件為：94℃預變性 5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 90 s， 共循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min。將經(jīng)XbaI和XhoI雙酶切的pMD-19T-yihS，與同樣雙酶切的質(zhì)粒pET-28a（+）-yihS連接，然后轉入E.coliBL21（DE3）中。挑選單菌落進行測序驗證及酶活驗證。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將上述種子培養(yǎng)液以初始A600nm=0.02的接種量轉接至裝液量為體積分數(shù)10%的LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0）中，在37℃，200 r/min的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，測定培養(yǎng)液的吸光值，當A600nm達到0.6～0.8時，添加終濃度為1 mmol/L的異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于28℃誘導培養(yǎng)6 h。接種前培養(yǎng)基中添加終濃度為50 μg/mL卡那霉素。

1.4 MIase的分離純化

菌體收集→超聲破碎→離心（12000g，20 min）→酶上清液→Ni2+-親和層析柱→透析→SDS-PAGE鑒定。

1.5 MIase酶學性質(zhì)研究

1.5.1 溫度對酶活及熱穩(wěn)定性的影響 酶反應分別 在 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃ ，pH 7.5條件下進行，以最高酶活為相對酶活100%，比較得到MIase的最適反應溫度；酶液分別在20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下保溫 4 h，每隔 0.5 h 取樣，在40℃、pH 7.5條件下測定然后測定殘余酶活，其中定義MIase的原始活力為最高酶活100%。

1.5.2 pH對酶活及熱穩(wěn)定性的影響 將酶液分別置 于 pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的不同緩沖液中于40℃測定相對酶活力以測得最適pH，以最高酶活為相對酶活100%；酶液分別在 pH 4.0～9.0的緩沖液中 4℃下保存 24 h，在40℃，pH 7.5條件下測定殘余酶活，其中定義MIase的原始活力為最高酶活100%。

1.5.3 不同金屬離子對酶活的影響 經(jīng)Ni2+-親和層析柱純化得到的酶液置于10 mmol/L EDTA的磷酸緩沖液（pH 7.5）中于4℃透析半天以去除溶液中的金屬離子；然后用對應的不含EDTA的磷酸緩沖液（pH 7.5）于4℃透析6 h（重復3次）以去除溶液中的EDTA；為了研究不同金屬離子對酶活性的影響，反應體系中分別加入1 mmol/L的不同金屬離子， 如 Cu2+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Ni2+、Ba2+等測定對應的酶活力，其中定義不含金屬離子的酶液活力為100%。

1.6 MIase酶活定義

MIase轉化D-果糖的酶活定義為最適條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol的D-甘露糖所需酶量。產(chǎn)物D-甘露糖采用HPLC-RI法進行測定，固定相：Sugar-Pak I（300 mm × 6.5 mm i.d.）色譜柱，柱溫 85 ℃；流動相：超純水；流速為 0.4 mL/min，進樣量為10 μL；檢測器：Shodex示差折光檢測器，檢測溫度30℃。

2 結果與討論

2.1 重組質(zhì)粒 pET-28a（+）-yihS的構建

從E.coliBL21基因組中PCR擴增目的基因呈現(xiàn)出一條1.2 kb左右特異性的條帶，與預期大?。▓D2）一致，進一步獲得pMD19-T-yihS。

圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Analysis by agarose gel electrophoresis of PCR product

將 pMD19-T-yihS和 pET-28a（+）質(zhì)粒，用XbaI和XhoI進行雙酶切，用T4連接酶進行連接，構建重組質(zhì)粒pET-28a（+）-yihS，其構建過程如圖3所示，重組質(zhì)粒pET-28a（+）-yihS經(jīng)XbaI和XhoI雙酶切后，得到5.3 kb左右和1.2 kb左右2條帶；經(jīng)HindIII單酶切可見條帶大小約為6.5 kb，與理論值相當，經(jīng)測序驗證目的基因得到了正確擴增，重組質(zhì)粒構建成功。將重組載體轉化入E.coliBL21經(jīng)卡那霉素50 μg/mL LB平板篩選后，挑取陽性克隆子，并成功獲得一株包含MIase基因的大腸桿菌重組菌。

圖3 pET-28a（+）-yihS重組質(zhì)粒構建過程Fig.3 Construction of recombinant plasmid pET-28a（+）-yihS

2.2 MIase的表達及分離純化結果

SDS-PAGE電泳顯示，MIase在表達宿主E.coliBL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導后成功獲得表達，且主要為胞內(nèi)表達，其大小約為45×103（圖4，Lane 1），與文獻報道的MIase的單體分子量大小一致。經(jīng)計算，搖瓶發(fā)酵酶活約為4.2 U/mL。發(fā)酵菌體破碎后懸浮液經(jīng)12000 r/min，4℃離心即得破壁上清粗酶液，帶有His-tag標記的重組蛋白表達系統(tǒng)可通過Ni2+離子親和柱將重組蛋白進行專一性的分離，如圖4（Lane 5）所示，在 45×103處得到目的蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量大小與預測符合，表明MIase基因得到正確表達。

2.3 最佳酶轉化反應的條件

2.3.1 MIase的最適溫度及溫度穩(wěn)定性 隨著溫度升高，酶蛋白的活性下降；但溫度的升高又會提高反應速度，因此酶反應的最適溫度就是這兩種影響的綜合結果[14]。本研究在10～60℃范圍內(nèi)分別測定轉化反應過程中的酶活力，得到MIase酶活與溫度變化曲線，如圖5所示，酶活隨著溫度上升，到40℃時酶活達到最大，高于40℃時酶活開始降低，因此，重組的MIase最適溫度為40℃。

圖4MIase的SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant D-mannose isomerase expressed in E.coli at different stages of purification procedure

圖5 重組MIase的最適溫度Fig.5 Optimum temperature of recombinant MIase

MIase的熱穩(wěn)定性如圖6所示，隨著酶熱處理時間加長，酶活力隨著溫度的增加而降低，尤其當酶處理溫度高于50℃時，殘余酶活急劇下降，且酶活大于60℃時，溫育30 min以上，酶活幾乎完全喪失。表明MIase在溫度大于50℃時熱穩(wěn)定性很差，酶幾乎失去生物活性。

2.3.2 pH對MIase酶活及穩(wěn)定性的影響 由于酶的活性和酶的穩(wěn)定性與反應體系中pH關系密切，直接影響酶與底物的結合，因此酶的最適pH是酶最重要的生物特性之一[15-16]。本實驗考察了重組MIase在pH 4.0～9.0范圍下酶活變化并得到其穩(wěn)定性曲線，如圖7和圖8所示，pH 4.0～5.5范圍內(nèi)重組酶完全喪失轉化能力。而中性及堿性條件下，酶轉化能力相對較高。當pH為7.0～7.5時，MIase酶活穩(wěn)定性最好。

圖6 重組MIase的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of recombinant MIase

圖7 pH對MIase酶活性的影響Fig.7 Effect of pH on D-mannose isomerase activity

圖8 pH對MIase酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on D-mannose isomerase stability

2.3.3 不同金屬離子對MIase酶活的影響 見圖9，與空白對照相比，Ca2+、Mn2+的加入可以稍微提高MIase的酶活。Zn2+、Cu2+則能夠完全抑制酶轉化反應，因此，MIase是非金屬依賴型的酶。

圖9 金屬離子對重組MIase酶活性的影響Fig.9 Effect of cations on activity of recombinant MIase

2.3.5 MIase的反應動力學參數(shù) 酶促反應動力學性質(zhì)的研究是建立酶催化反應過程動力學模型的基礎，有助于認識整個酶促反應過程的動力學機制[17]。測定酶促反應動力學常數(shù)時，選擇適合的底物濃度、酶濃度和反應溫度非常重要[18]。在濃度為1～2000 mmol/L范圍內(nèi)，配制一系列非線性濃度的D-果糖和D-甘露糖溶液的底物溶液，加入定量酶液后，在 40℃分別反應 10 min和 5 min，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，以底物濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標，反應初速度的倒數(shù)1/V為縱坐標作圖，求得該酶分別以MIase和D-果糖為底物的酶促反應動力學常數(shù)Km和催化常數(shù)kcat，見表 1。

kcat/Km是酶與底物反應形成產(chǎn)物的表觀二級速率常數(shù)，又名催化效率或?qū)Ｒ恍猿?shù)[19]。由表1的結果可以看出，當以D-甘露糖為底物時，kcat/Km值更大，說明該MIase對底物D-甘露糖的整體催化效率較高。

表1 MIase的動力學常數(shù)Table1 Relative activities and kinetic parameters of D-mannose isomerase for different substrates

2.3.4 D-甘露糖的酶法制備 在D-果糖質(zhì)量濃度為50、100、200、400 g/L下測定轉化反應， 其他條件不變。從圖10中可以看出，在60 min之內(nèi)，隨著底物質(zhì)量濃度的逐漸增加，D-甘露糖的生成量逐漸增加，60 min之后，底物質(zhì)量濃度為400 g/L的產(chǎn)物生成率與低底物質(zhì)量濃度條件下產(chǎn)物生成率相當，因此，未來大規(guī)模酶轉化生產(chǎn)D-甘露糖時可以考慮400 g/L以上的D-果糖濃度為反應的底物質(zhì)量濃度。

圖10 不同底物質(zhì)量濃度對MIase催化反應的影響Fig.10 Production of D-psicose from D-fructose by E.coli MIase

3 結語

本研究采用E.coliBL21提取的DNA為模板，通過PCR方法擴增出MIase基因yihS，克隆入表達載體 pET-28a（+）中，將其轉入宿主菌 BL21（DE3）中后，目的蛋白獲得較高表達量。采用鎳柱純化后的MIase，以D-果糖為底物重點研究了反應溫度、反應pH、底物濃度及不同金屬陽離子對酶活性的影響。研究表明：此重組MIase是非金屬依賴型的酶，以果糖為底物生產(chǎn)D-甘露糖的最佳轉化溫度為40℃，最佳pH為7.5。