硫氧還蛋白促進人胰島素樣生長因子-1在大腸桿菌中高效可溶表達

萬愛妮，徐棟生，蔡燕飛，陳 蘊，金 堅，李華鐘*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是含有70個氨基酸的堿性多肽，也被稱為生長激素介質(zhì)/促生長因子（somatomedins C），是一種結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的活性多肽[1]，主要由肝臟產(chǎn)生和分泌[2]。IGF-1參與多種細(xì)胞生物效應(yīng)，是細(xì)胞的重要增殖調(diào)控因子，對生長和分化有重要作用，并影響蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)代謝[3]。IGF-1還具有胰島素代謝效應(yīng)[4]，能增加組織對胰島素敏感性[5]，可作為胰島素抵抗糖尿病治療的有效替代藥物。對治療1型、2型糖尿病有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1在生長遲緩、神經(jīng)損傷、糖尿病等疾病的治療中有廣闊的應(yīng)用前景[6]。

血液中IGF-1主要以無活性的復(fù)合物形式存在（＞95%），有活性的游離IGF-1含量很低，所以無法從血清中大量提取天然IGF-1，從而限制了其研究和治療的應(yīng)用[7]。應(yīng)用基因工程技術(shù)，可以獲得大量的有生物活性的外源蛋白，為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供新途徑。國內(nèi)外已有很多通過哺乳動物細(xì)胞[8-9]、畢赤酵母[10]及大腸桿菌[11-13]等表達系統(tǒng)獲得IGF-1的研究，哺乳動物細(xì)胞和酵母表達系統(tǒng)，具有較強的翻譯后修飾功能，適合真核生物基因表達，但存在發(fā)酵成本高、表達量低、分離純化困難等問題。

IGF-1相對分子質(zhì)量較小、不穩(wěn)定，在大腸桿菌中表達時，易被蛋白酶降解，且表達產(chǎn)物大多以包涵體形式存在，生物活性嚴(yán)重受損。研究表明，載體標(biāo)簽蛋白部分對IGF-1的原核表達起主要作用[14-15]，選擇合適的載體對表達外源基因并獲得有生物活性的目的蛋白具有重要意義。我們探究了多種原核表達載體對IGF-1在大腸桿菌中表達的影響，構(gòu)建9 種重組載體，分別轉(zhuǎn)入 BL21（DE3）、Rosetta（DE3）和C43（DE3）等3種表達菌株中。IPTG誘導(dǎo)表達結(jié)果表明，IGF-1在攜帶標(biāo)簽蛋白Trx的pET32a載體上高效可溶表達（C43），在其他載體中一部分不表達（如pET20b-IGF-1），一部分則以包涵體形式表達（如 pET30a-IGF-1）。

為探究標(biāo)簽蛋白Trx對外源蛋白IGF-1在大腸桿菌中表達的影響，我們應(yīng)用融合PCR技術(shù)獲得Trx-IGF-1融合基因，構(gòu)建重組載體pET30-Trx-IGF-1并轉(zhuǎn)化大腸桿菌C43（DE3），以期實現(xiàn)具有生物活性的IGF-1的高效可溶表達，進而探究標(biāo)簽蛋白Trx對IGF-1生物活性的影響，為其他外源蛋白的可溶表達策略提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及細(xì)胞 IGF-1基因，購自O(shè)rigene；大腸桿菌菌株 DH5α、BL21（DE3），購自天根生化科技有限公司；載體及大腸桿菌菌株Rosetta（DE3）、C43（DE3）以及NIH3T3 細(xì)胞由本實驗室保存。

1.1.2 試劑 引物由上海生物工程有限公司合成；PrimeSTAR mix，購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶（KpnⅠ、SalⅠ等）、T4DNA 連接酶、DNA marker、蛋白marker，購自Fermentas公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、卡那霉素、IPTG，購自上海生物工程有限公司；山羊抗人IGF-1多抗，購自Abcam公司；HRP標(biāo)記驢抗山羊IgG，購自碧云天生物技術(shù)研究所；Ni離子金屬親和層析填料，購自美國GE公司；IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品，購自R&D公司；DMEM和FBS，購自Gibco 公司；CellTiter-Blue Cell Viability Assay，購自Promega 公司；Propidium Iodide/碘化丙啶（PI），購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 重組表達載體的構(gòu)建 以IGF-1基因，設(shè)計引物，引入雙酶切位點，分別與9種帶不同標(biāo)簽的載體連接，構(gòu)建重組載體。

1.2.2 IGF-1在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達 挑取陽性克隆，接種于含100 μg/mL抗生素的LB液體培養(yǎng)基里，37℃，200 r/min培養(yǎng)過夜，后以1%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到新鮮含100 μg/mL抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至 OD600值為 0.4～0.6時加入IGTG（終濃度 1 mmol/L），低溫、低轉(zhuǎn)速（30 ℃，100 r/min）誘導(dǎo)6 h。SDS-PAGE檢測誘導(dǎo)前后菌液表達情況。

1.2.3 重組表達載體pET30a-Trx-IGF-1的構(gòu)建以人igf-1基因為模板，采用PCR方法擴增igf-1基因。以pET32a為模板，用PCR方法擴增trx基因。膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物trx-igf-1融合基因，用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切，并將酶切產(chǎn)物割膠回收，與同樣酶切并回收純化的pET30a載體用T4DNA酶連接，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，卡那霉素抗性篩選，提取質(zhì)粒，進行菌液PCR、KpnⅠ和SalⅠ雙酶切及測序鑒定，篩選陽性克隆，將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌C43（DE3）菌株中。

1.2.4 融合蛋白誘導(dǎo)表達 挑取陽性克隆，接種于含卡那霉素100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基里，37℃，200 r/min培養(yǎng)過夜，然后以1%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮含卡那霉素100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600值為0.6時加入IGTG，探索不同誘導(dǎo)溫度（20、25、30、37 ℃）、誘導(dǎo)時間（2、3、4、5、6、7 h）及 IPTG 濃度（0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5 mmol/L）對表達的影響，確定可溶表達的最優(yōu)條件。誘導(dǎo)表達結(jié)束后，離心收集菌體，按1/5加入PBS重懸菌體，經(jīng)超聲破碎后離心，收集上清和沉淀，SDSPAGE檢測可溶性。

1.2.5 融合蛋白純化 發(fā)酵表達600 mL，離心收集菌體，按1/5加入平衡緩沖液20 mmol/L PB、100 mmol/L NaCl、25 mmol/L 咪唑（pH 7.2）重懸，超聲破碎，離心取上清備用。Ni離子親和層析柱先用平衡緩沖液平衡，上樣結(jié)束，分別用20 mmol/L PB、100 mmol/L NaCl、257.5 mmol/L 咪唑（pH 7.2）和20 mmol/L PB、100 mmol/L NaCl、800 mmol/L 咪 唑（pH 7.2）洗脫雜蛋白質(zhì)和目的蛋白質(zhì)，收集洗脫峰，進行SDS-PAGE檢測。

1.2.6 純化產(chǎn)物的Western blot檢測 純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，經(jīng)5 g/dL脫脂奶粉封閉2 h，以山羊抗人IGF-1多抗為一抗，室溫孵育3 h，TBST洗滌3次后，以HRP標(biāo)記的驢抗山羊為二抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗滌3次，ECL顯色分析結(jié)果。

1.2.7 融合蛋白Trx-IGF-1促NIH3T3增殖活性NIH3T3細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%FSB）配成5×104mL細(xì)胞懸液，接種于96孔板，100 μL/孔，培養(yǎng)24 h。0.4%血清饑餓處理12 h后，向96孔板中分別添加不同濃度的IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品和Trx-IGF-1（100、75、50、25、12.5、6.5、3.25、0 nmol/L），每組6個復(fù)孔。作用24h后，每孔加CellTiter-Blue試劑10 μL，37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測樣品在560Ex/590Em波長處的熒光值。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測對NIH3T3細(xì)胞周期的影響取對數(shù)生長期的NIH3T3細(xì)胞，2×106孔接種于6孔板，分為IGF-1陽性組、Trx-IGF-1實驗組和對照組，3孔/組。培養(yǎng)24 h后，更換0.4%FBS/DMEM饑餓處理 12 h，IGF-1 陽性組加入 IGF-1（30 nmol/L），Trx-IGF-1實驗組加入 Trx-IGF-1（30 nmol/L），加藥處理24 h后，以1000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，離心去PBS，加入 4℃預(yù)冷的70%的乙醇 -30℃固定過夜，離心棄去固定液，用 4℃預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，加入 500 μL RNase（50 μg/mL）37 ℃孵育 30 min，離心棄上清液，加入 200 μL PI（50 μg/mL），4 ℃避光30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2 結(jié)果與討論

2.1 IGF-1在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達

將igl-1基因分別與質(zhì)粒 pET28a、pET20b、pET356、pET32a、pET30b、pEZZ18a、pGEX4T-1、pColdⅡ、pMAL2X連接，構(gòu)建9種重組表達載體，分別轉(zhuǎn)入 BL21（DE3）、Rosetta（DE3）和 C43（DE3）等 3種表達菌株中，誘導(dǎo)結(jié)果顯示，pET28a-IGF-1、pET35b-IGF-1、pET32a-IGF-1、pET30a-IGF-1、pColdII-IGF-1、pMAL-2X-IGF-1重組載體在大腸桿菌中有不同程度的表達，但只有pET32a-IGF-1可溶表達，且在C43（DE3）菌株中表達量最高（圖1），而pET30a-IGF-1雖然大量表達，但表達產(chǎn)物以包涵體形式存在（圖2）。

2.2 重組表達載體pET30a-Trx-IGF-1在C43（DE3）中的表達

將PCR獲得的trx-igf-1融合基因插入pET30a表達載體，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并進行測序鑒定。重組表達載體pET30a-Trx-IGF-1轉(zhuǎn)化C43（DE3）細(xì)胞，挑取陽性克隆，過夜活化后，按1/100轉(zhuǎn)接至10 mL LB/Amp+培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期OD600值為0.4～0.6時，加入IGTG誘導(dǎo)表達4 h。離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎，離心分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE（圖3），結(jié)果顯示在相對分子質(zhì)量約25×103處可見目的條帶，與理論值一致，而未誘導(dǎo)組未見此帶。目的蛋白主要存在于上清中，表明重組融合蛋白主要以可溶形式表達。

圖1 pET32a-MIGF-1在大腸桿菌中表達產(chǎn)物的SDSPAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of pET32a-IGF-1 expression in E.coli

圖2 pET30a-MIGF-1在C43（DE3）中表達產(chǎn)物的 SDSPAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of pET30a-IGF-1 expression in C43（DE3）

2.3 融合蛋白誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化

為確定最優(yōu)表達條件，提高可溶目的蛋白表達量，我們比較了不同誘導(dǎo)溫度（20、25、30、37 ℃）、誘導(dǎo)時間（2、3、4、5、6、7 h） 及 IPTG 濃度（0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5 mmol/L）對表達的影響，確定可溶表達的最優(yōu)條件。結(jié)果表明，30℃條件下，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h，可溶性目的蛋白表達量最高（圖4），用Image J軟件分析結(jié)果顯示，融合蛋白表達量約占菌體總蛋白的50%。

圖3 pET30a-Trx-IGF1重組載體在C43（DE3）中表達的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of pET30a-Trx-IGF-1 expression in C43（DE3）

圖4 pET30a-Trx-IGF-1在C43（DE3）中優(yōu)化表達的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of optimizing pET30a-Trx-IGF-1 expression in C43（DE3）

2.4 融合蛋白的純化及Western blot分析

超聲破碎上清經(jīng)過Ni柱吸附后，以20 mmol/L PB、100 mmol/L NaCl、257.5 mmol/L 咪唑洗脫雜蛋白，20 mmol/L PB、100 mmol/L NaCl、800 mmol/L 咪唑洗脫目的融合蛋白（圖5（a）），經(jīng)Ni離子親和層析柱純化后，目的蛋白Trx-IGF-1的純度達90%以上。純化獲得的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，用anti-IGF-1 抗體進行 Western blot鑒定（圖5（b）），結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量約25×103處可見蛋白雜交帶，說明獲得的重組融合蛋白具有IGF-1抗原活性。

2.5 融合蛋白Trx-IGF-1促NIH3T3增殖活性

Cell-Titer Blue試劑盒檢測Trx-IGf-1對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果（圖 6）顯示，在 5、10、20、40、80 nmol/L 的濃度范圍內(nèi)， 與對照組（0 nmol/L）相比，Trx-IGF-1融合蛋白具有明顯的促NIH3T3細(xì)胞增殖活性，且呈劑量依賴關(guān)系，IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品最高增殖率達到（218.59±11.22）%，Trx-IGF-1融合蛋白最高增值率為（192.79±11.39）%。

圖5 Trx-IGF-1蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE與Western Blot分析Fig.5 SDS-PAGE and Western Blot analysis of purified Trx-IGF-1

圖6 Trx-IGF-1融合蛋白對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effect of Trx-IGF-1 on NIH3T3 cells proliferation

2.6 流式細(xì)胞儀檢測對NIH3T3細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期分析結(jié)果（圖7）表明，對照組NIH3T3細(xì)胞大多處于G0/G1期，細(xì)胞增殖指數(shù)PI為12.88%。IGF-1陽性組和Trx-IGF-1實驗組處理NIH3T3細(xì)胞后，與對照組相比，G0/G1期的細(xì)胞百分率明顯降低，S期和G2/M期細(xì)胞百分比明顯增高，增殖指數(shù)（分別為32.89%、29.51%，表1），表明融合蛋白能明顯促進NIH3T3細(xì)胞周期進展。

圖7 IGF-1或Trx-IGF-1對NIH3T3細(xì)胞周期進展的影響Fig.7 Effect of IGF-1 or Trx-IGF-1 on NIH3T3 cell cycle progression

表1 IGF-1和Trx-IGF-1對NIH3T3細(xì)胞周期的影響Table1 Effects of IGF-1 and Trx-IGF-1 on cell cycle progression of NIH3T3 cells %

3 結(jié) 語

IGF-1是人體內(nèi)一種重要的生長因子，與胰島素結(jié)構(gòu)相似，通過內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌形式調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和增殖，參與合成代謝，在神經(jīng)細(xì)胞生長和分化[16]、軟骨發(fā)育[17]及骨質(zhì)疏松重建過程中[18]有重要的作用。然而，從血液中獲得IGF-1難度大，得率低，限制了早期人們對IGF-1純品深入研究和臨床應(yīng)用推廣。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用基因重組技術(shù)在細(xì)菌、酵母和動物細(xì)胞中表達IGF-1。

大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前獲得重組蛋白最簡單經(jīng)濟的方法，現(xiàn)階段關(guān)于大腸桿菌表達IGF-1重組蛋白的研究，國內(nèi)外都有許多報道。但該系統(tǒng)缺乏真核生物蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)，不能有效表達過長或過短的外源蛋白，二硫鍵形成能力有限，易錯誤折疊形成包涵體[19]，嚴(yán)重影響了外源蛋白的高表達和高活性。

選擇適宜的表達菌株，是外源蛋白高效表達的重要步驟。菌體內(nèi)含有大量內(nèi)源蛋白酶，易造成外源表達產(chǎn)物的降解。而大腸桿菌C43（DE3）是蛋白酶缺陷型菌株，可以有效避免外源蛋白被蛋白酶降解，保持其穩(wěn)定性[20]。同時，C43（DE3）基因組含有參與毒性蛋白表達時細(xì)胞死亡途徑的突變，可以高效表達毒性蛋白或疏水性蛋白[21]。一些在BL21（DE3）中低表達的蛋白，甚至對宿主細(xì)胞有毒性的蛋白，如球蛋白和膜蛋白，均能在C43（DE3）中高效且低毒性表達[22-24]。C43（DE3）是優(yōu)于 BL21（DE3）的高效表達外源蛋白的理想宿主[25]。

蛋白正確的空間折疊和二硫鍵配對，是保證其生物活性的基本要求。表達載體是外源基因在大腸桿菌中可溶表達的一個重要影響因素。IGF-1相對分子質(zhì)量較小，且含有二硫鍵，為獲得正確立體結(jié)構(gòu)的活性蛋白，需與可溶高表達的蛋白標(biāo)簽融合，進行可溶表達[26-29]。原核表達載體主要包括pET系列載體、pGEX載體和pMAL載體等，載體上含有各種融合標(biāo)簽，與外源基因形成融合蛋白[30]。pGEX-4T-1載體含有GST標(biāo)簽，具有對宿主菌無選擇性，純化條件溫和簡便等優(yōu)點，但對目的蛋白分子量、電性及氨基酸種類要求嚴(yán)格，蛋白易形成包涵體[31]。pMAL-2x載體含有BMP標(biāo)簽，由于胞質(zhì)中蛋白水解酶對融合蛋白的降解作用，表達的融合蛋白通常低于理論分子量，且融合蛋白易錯誤折疊形成包涵體，不能正常分泌[32]。

pET系列載體是目前應(yīng)用最廣泛的原核表達載體，本實驗結(jié)果表明，各種融合載體蛋白系統(tǒng)中，pET32a的硫氧還蛋白標(biāo)簽，能幫助外源基因高效可溶表達。硫氧還蛋白Trx是一種常見的氧化還原小分子蛋白（相對分子質(zhì)量為12×103），其保守的活性位點結(jié)構(gòu)為-Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-，具備氧化還原活性，可編碼硫氧還蛋白，催化蛋白質(zhì)二硫鍵還原，幫助蛋白質(zhì)正確折疊[33]。同時，Trx作為大腸桿菌自身蛋白，在菌體中易折疊，應(yīng)用Trx融合表達，可在大腸桿菌中獲得高產(chǎn)量的可溶性融合蛋白[34-36]。HARTWIGA等[37]應(yīng)用Trx融合及真核序列密碼子優(yōu)化，實現(xiàn)廣藿香醇合成酶在大腸桿菌中的可溶表達，表達量提高42%，且融合蛋白仍保持酶活。

pET30a-IGF-1在大腸桿菌中主要以包涵體形式表達，我們通過構(gòu)建融合表達載體pET30a-Trx-IGF1，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 C43（DE3）中，經(jīng) 30℃誘導(dǎo)表達，實現(xiàn)融合蛋白的高效可溶表達，目的蛋白約占菌體總蛋白的50%。利用融合蛋白N端His-tag標(biāo)簽，經(jīng)Ni離子親和色譜柱純化，獲得純度較高且具有IGF-1免疫源性的融合蛋白。在IGF-1的N端融合Trx有助于IGF-1的正確折疊，獲得大量可溶的Trx-IGF-1融合蛋白。生物學(xué)活性測定實驗證明，融合蛋白具有明顯的促NIH3T3細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進展的生物活性。與陽性對照相比，Trx-IGF-1融合蛋白促NIH3T3相比增殖活性有些許降低（約12%），可能是由于融合蛋白分子量變大，Trx通過空間位阻影響IGF-1與其受體結(jié)合，但未影響IGF-1信號傳導(dǎo)。本實驗表明，硫氧還蛋白促進IGF-1在大腸桿菌中的高效可溶表達，為IGF-1生產(chǎn)工藝及藥學(xué)研究等奠定基礎(chǔ)，同時為包涵體蛋白在大腸桿菌中的可溶表達提供一定的借鑒。