高效液相色譜-熒光檢測法測定發(fā)酵紅肉制品中Neu5Gc

晏印雪， 朱秋勁*，2， 梁美蓮， 周櫻子， 常 瑞，李洪英， 徐阿奇， 劉春麗， 曾雪峰，2

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽550025）

紅肉一般指紅色肌肉纖維比白色肌肉纖維多的動物肉。2015年10月26日，國際癌癥研究機構(gòu)將紅肉列為 “可能對人類致癌”（2A類）致癌物質(zhì)[1-3]。

紅肉中非人類唾液酸Neu5Gc被報道為特有的致癌物質(zhì)，外源性的Neu5Gc主要通過攝食紅肉制品而在人體富集，繼而機體產(chǎn)生抗Neu5Gc抗體，從而促發(fā)炎癥和增加致癌風險[4]。Neu5Gc是唾液酸（Sialic acid，Sia）的一種，唾液酸又叫?；窠?jīng)氨酸，是一類具有9碳骨架的酸性糖類。大多數(shù)哺乳動物包括與人類相近的類人猿都可以自身合成Neu5Gc，但人類由于缺失可將CMP-Neu5Ac轉(zhuǎn)化為CMP-Neu5Gc的CMAH羥化酶，所以健康的人體不能合成[4-6]。Neu5Gc通過代謝進入人體組織，含Neu5Gc的糖基復合物能夠被Hanganutziu-Deicher（H-D）抗體特異性識別[7]。因此，Neu5Gc已成為食品安全檢測與腫瘤診斷的新靶標，同時紅肉及紅肉加工制品中的Neu5Gc日益?zhèn)涫荜P注[8-13]。目前發(fā)酵紅肉及制品主要研究微生物發(fā)酵降解膽固醇、雜環(huán)胺、亞硝酸鹽以及其抗氧化性的特性[14-17]，而對于紅肉中特異性風險物質(zhì)Neu5Gc研究鮮見報道。

迄今，對于唾液酸的檢測方法常用的有：基于比色法的間苯二酚法、硫代己比妥酸 （2-Thiobarbituric acid，TBA）法；基于色譜法的高效液相色譜法 （RP-HPLC）、熒光高效液相色譜法（HPLC-FLD）等，傳統(tǒng)的分光光度法只能檢測總的唾液酸含量，有效檢測Neu5Gc含量的方法有高效液相色譜法、HPLC-FLD和液相色譜-質(zhì)譜法 （LCMS/MS）等，但主要針對在生鮮紅肉[2，18-19]、動物內(nèi)臟[18，20]、乳及乳制品[12，21-23]中 Neu5Gc 的含量，目前關于紅肉在發(fā)酵環(huán)節(jié)和發(fā)酵制品中Neu5Gc含量測定未見報道。搭建發(fā)酵紅肉及制品中Neu5Gc的檢測方法對考察紅肉發(fā)酵過程與Neu5Gc的消長規(guī)律具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷鮮豬肉、宣威火腿、廣式香腸、川味香腸、美式火腿：購于貴陽市花溪區(qū)合力超市；傳統(tǒng)土家特色酸鲊肉、接種發(fā)酵酸鲊肉：均為實驗室自制。

Neu5Gc 標準品 （GC，≥99%）、DMB （GC，≥99%）、β-巰基乙醇（色譜純）：Sigma公司產(chǎn)品；甲醇（色譜純）：德國applichem公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀 （配有熒光檢測器和自動進樣器）：美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；LiChrosorb RP-18 色譜柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）：默克集團產(chǎn)品；ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）、ZORBAX 300Extend-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）：美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；CTFD-12S冷凍干燥機：青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司產(chǎn)品；S825-12DT超聲清洗器：上海冠特超聲儀器有限公司產(chǎn)品；DY89-II電動玻璃勻漿機：上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；AR224CN電子分析天平：奧豪斯儀器（貴州）有限公司產(chǎn)品；TG16-WS高速冷凍離心機：上海盧湘儀儀器有限公司產(chǎn)品；XMTD203數(shù)顯恒溫油浴鍋：江蘇科析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 Neu5Gc標準溶液配制 精確稱量0.0825 g Neu5Gc標準品，用超純水溶解于燒杯中，隨后轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，定容至刻度，即為1 mmol/L Neu5Gc標準品溶液。吸取1 mmol/L Neu5Gc標準品溶液配制成 10、25、50、100、200、300、400 μmol/L 等一系列濃度梯度的Neu5Gc標準溶液，待衍生。

1.3.2 樣品溶液制備 取發(fā)酵紅肉制品（我國傳統(tǒng)酸鲊肉、發(fā)酵香腸、火腿等），根據(jù)發(fā)酵紅肉制品的原料形狀不同，分為塊狀及肉糜狀發(fā)酵紅肉制品。

1）肉糜狀發(fā)酵紅肉制品：剝?nèi)ツc衣，精確稱取1 g肉糜，用10 mL質(zhì)量分數(shù)30%的飽和硫酸銨溶液勻漿以沉淀蛋白，并冷凍干燥去除硫酸銨。為使Neu5Gc游離出來，將凍干后的樣品加入10 mL質(zhì)量分數(shù)2 mol/L冰乙酸于80℃水浴鍋中水解3 h，以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min取上清液，用0.45 μm膜過濾后進行二次凍干除去冰乙酸。凍干粉溶解于1 mL 0.1 mol/L的NaOH中，37℃水浴30 min，用 0.45 μm 膜過濾制得樣品溶液，待衍生[24]。

2）塊狀發(fā)酵紅肉制品：選取塊狀發(fā)酵紅肉制品的精瘦肉部分，取1 cm以下的中間肉樣1 g，制備方法同上。

1.3.3 DMB衍生劑溶液的配制及衍生反應 參考Martín 等[25]介紹的方法配制 8 mmol/L DMB、1.5 mol/L冰乙酸、0.25 mol/L硫代硫酸鈉、0.25 mol/L亞硫酸鈉、0.8 mmol/L β-巰基乙醇。

準確吸取900 μL的樣品溶液或Neu5Gc標準溶液，加入100 μL DMB衍生試劑，于水浴鍋中50℃避光衍生2.5 h后放入冰水混合液中快速冷卻，用0.22 μm膜過濾后待測。

1.3.4 高效液相色譜條件的選擇優(yōu)化 采用默克LiChrosorb RP-18 色譜柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）、安捷倫ZORBAX 300Extend-C18色譜柱 （150 mm×4.6 mm×5 μm）和安捷倫 ZORBAX Eclipse XDBC18 色譜柱（150 mm×4.6 mm×5 μm），熒光檢測器激發(fā)波長373 nm、發(fā)射波長448 nm，柱溫30℃，流量為0.9 mL/min，進樣體積10 μL。以甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水為流動相，優(yōu)化流動相配比。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱及流動相的確定

根據(jù)已報道的色譜條件[19，24]進行預實驗，試驗結(jié)果表明：現(xiàn)有的Neu5Gc檢測方法只適用于鮮肉、牛奶、雞蛋等未經(jīng)發(fā)酵的食品中的Neu5Gc濃度檢測，而不適用于發(fā)酵紅肉制品中Neu5Gc濃度檢測。如圖1所示，經(jīng)微生物發(fā)酵后的肉制品，因微生物發(fā)酵分解有機物，并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，在流動相為V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（水）=8∶7∶85 條件下，發(fā)酵紅肉樣品的目標峰的峰形不對稱并向左偏移，加標后目標峰的峰形向Neu5Gc標準品保留時間方向偏移，由此可知在Neu5Gc目標峰出峰時間內(nèi)有雜質(zhì)干擾，無法對發(fā)酵紅肉制品中Neu5Gc的濃度進行測定。

圖 1 流動相為 V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（水）=8∶7∶85 的 HPCL色譜圖Fig.1 HPCL chromatogram of methanol-acetonitrilewater（8：7：85，V/V）

隨后分別選擇默克LiChrosorb RP-18色譜柱（150 mm ×4.6 mm ×5 μm）、 安 捷 倫 ZORBAX 300Extend-C18 色譜柱 （150 mm×4.6 mm×5 μm）和安捷倫 ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm×5 μm），以甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等流動相體系的不同體積配比，對樣品的液相色譜檢測條件進行優(yōu)化。

通過不同色譜柱分離效果對比，發(fā)現(xiàn)使用安捷倫 ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）分離效果最佳。通過初步流動相體系篩選，選用甲醇-水作為流動相體系，并對不同流動相體積分數(shù)配比進行優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。實驗表明：當流動相A為超純水，B為甲醇溶液，體積比為80∶20洗脫，能使Neu5Gc雜質(zhì)的峰與主成分峰分離有效分離（分離度R＞1.5），如圖3所示；且峰形良好，Neu5Gc的保留時間為14.484 min，如圖4所示。并且采用梯度洗脫能顯著降低檢測時間，提高檢測效率，梯度洗脫程序如表1所示。

圖2 不同流動相比例HPLC色譜圖Fig.2 HPCL chromatogram of different mobile phase ratio

圖3 傳統(tǒng)發(fā)酵30 d酸鲊肉樣品中Neu5Gc的HPLC色譜圖Fig.3 HPCL chromatogram of Neu5Gc in traditional fermented 30-day Suanzharou

圖4 Neu5Gc標準樣品HPCL色譜圖Fig.4 HPCL chromatogram of Neu5GC standard

表1 流動相梯度洗脫條件Table1 Conditions for mobile phase by gradient elution

2.2 標準曲線的繪制

取 10、25、50、100、200、300、400 μmol/L 等一系列濃度梯度的Neu5Gc標準溶液，衍生后進樣檢測，不同濃度標準品溶液平行測定3次。以標準品濃度為橫坐標，對應的色譜峰面積的平均值為縱坐標，繪制線性標準曲線，如圖5所示。結(jié)果表明，在10～400 μmol/L線性范圍內(nèi)，Neu5Gc峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關系，符合測定要求。

圖5 Neu5Gc標準曲線Fig.5 Neu5Gc standard curve

2.3 檢出限、定量限

取1 mmol/L Neu5Gc標準品溶液倍數(shù)稀釋后衍生測定。實驗結(jié)果表明：RSN=3時，最低檢出限（LOD）為 0.001 μmol/L，高于 LC-MS/MS 測定 Neu5Gc的最低檢測限 0.3 μmol/L[13]；RSN=10 時，定量限（LOQ）為 0.003 μmol/L。

2.4 重復性、精密度

取同一發(fā)酵肉樣，按照1.3.2樣品溶液制備方法制備平行樣品溶液5份，衍生后，依次進樣檢測。5份樣品Neu5Gc濃度的RSD值為1.5%；取同一待測樣品溶液連續(xù)進樣6次，測得Neu5Gc峰面積的RSD為1.2%。結(jié)果顯示，本實驗方法具有良好的精密度和重現(xiàn)性。

2.5 Neu5Gc加標回收率測定

取3份已知Neu5Gc濃度樣品，分別加入1、5、10 μmol/mL 3個濃度的Neu5Gc標準溶液進行加標回收實驗，結(jié)果如表2所示，平均回收率在96.4%～99.07%之間。

表2 Neu5Gc加標回收率的測定Table2 Recovery of Neu5Gc in samples

2.6 樣品檢測結(jié)果

Varki等[25]檢測得到生鮮豬肉中Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)為25.25 μg/g，而Chen等[20]測得生鮮豬肉中的Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)僅有5.6 μg/g。實驗檢測結(jié)果由圖6可知，鮮肉原料 （S1）的Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)為（25.61±1.31）μg/g， 傳統(tǒng)發(fā)酵 30 d 酸鲊肉 （S2）的Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)為 （17.14±0.92）μg/g， 接種發(fā)酵30天酸鲊肉 （S3） 的Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)為 （9.59±0.47） μg/g；Suna、Annie 等[18，26]分別測定了生長 3、38、180 d豬的新鮮豬肉、豬脾、豬腰、豬肺、豬心和豬肝和經(jīng)過不同的加工方式加工的紅肉制品中Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)，發(fā)現(xiàn)與豬肉相比，各個器官中Neu5Gc的質(zhì)量分數(shù)較高，而不同的物理加工方式均顯著改變了Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)以及Neu5Gc結(jié)合態(tài)與游離態(tài)的比例，其中有增加也有降低。對比鮮肉原料、傳統(tǒng)發(fā)酵30 d酸鲊肉與接種發(fā)酵30 d酸鲊肉中的Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)可知，在發(fā)酵酸鲊肉與鮮肉原料之間Neu5Gc的質(zhì)量分數(shù)存在顯著性差異（p＜0.05），發(fā)酵可顯著降低紅肉中Neu5Gc的質(zhì)量分數(shù)，且接種微生物發(fā)酵酸鲊肉中Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)最低；目前還沒有微生物發(fā)酵降解Neu5Gc的研究，推測可能的原因：1）微生物發(fā)酵產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，對Neu5Gc有降解作用，如乳酸等。蔣蕓等[27]研究表明豬肉在添加乳酸的情況下，60.0%以上唾液酸被解離；2）Neu5Gc是一類具有9碳骨架的酸性糖類，通常附著于細胞表面和分泌的糖蛋白和糖脂的糖鏈的外端[4]，可能作為碳源被微生物利用進入代謝途徑發(fā)生分解從而導致Neu5Gc在紅肉中的質(zhì)量分數(shù)降低。

圖6 不同方式發(fā)酵的紅肉制品中Neu5Gc的質(zhì)量分數(shù)（n＝3）Fig.6 ContentofNeu5Gcinfermentedredmeat products by different ways（n＝3）

由圖7和圖8可知，肉糜狀發(fā)酵肉制品中的Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)普遍低于塊狀發(fā)酵紅肉制品中Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)，對兩組樣品（包括3個平行樣）進行t檢驗分析得在置信區(qū)間95%內(nèi)p值為0.03（＜0.05），即不同形態(tài)的紅肉發(fā)酵制品中的Neu5Gc存在顯著性差異。其中臘肉的Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)最高，薩拉米香腸質(zhì)量分數(shù)最低。如果微生物發(fā)酵降解Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)的推測成立，據(jù)此推斷肉糜狀的紅肉更有利于增大紅肉與微生物的接觸面積，從而使發(fā)酵更充分，提高Neu5Gc的降解效率。

圖7 塊狀發(fā)酵紅肉制品中Neu5G質(zhì)量分數(shù)（n＝3）Fig.7 Content of Neu5Gc in block fermented red meat products（n＝3）

圖8 肉糜狀發(fā)酵肉制品中Neu5G質(zhì)量分數(shù)（n＝3）Fig.8 Content of Neu5Gc in minced fermented red meat products（n＝3）

3 結(jié)語

采用酸水解，4，5-亞甲基二氧基-1，2-鄰苯二胺鹽（DMB）衍生的熒光高效液相色譜（HPLC-FLD）檢測發(fā)酵紅肉制品中Neu5Gc質(zhì)量分數(shù)。該方法分離度良好（R＞1.5），平均回收率在 96.4%～99.07%之間，最低檢出限為0.001 μmol/L，Neu5Gc保留時間為14.484 min，且峰形對稱無漂移無拖尾。此方法分辨率、靈敏度，精密度和回收率較高，能夠滿足發(fā)酵紅肉制品中Neu5Gc的測定，彌補了對發(fā)酵紅肉制品中Neu5Gc的研究手段的缺失。

采用該方法測得的不同種類的發(fā)酵紅肉制品Neu5Gc的質(zhì)量分數(shù)在9.59～20.08 μg/g之間，不同的發(fā)酵紅肉制品Neu5Gc的含量之間均存在顯著性差異（p＜0.05），且低于未發(fā)酵紅肉樣 Neu5Gc的含量26.87 μg/g。目前，尚未有微生物發(fā)酵對紅肉中Neu5Gc影響的研究，進一步研究旨在闡釋微生物發(fā)酵對Neu5Gc的降解機制。