基于HPLC-ELSD和偏最小二乘判別分析法的蜂蜜摻假鑒別

許艷超， 陳尚衛(wèi)， 朱 松， 季福標(biāo)， 戴 軍*

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；3.江蘇日高蜂產(chǎn)品有限公司，江蘇 淮安 211799）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)過在巢脾內(nèi)轉(zhuǎn)化、脫水、貯存至成熟的過程而釀成的天然甜物質(zhì)[1]。蜂蜜作為天然物質(zhì)，具有獨(dú)特的風(fēng)味、口感和營養(yǎng)價(jià)值，并要求蜂蜜中不得添加或混入任何淀粉類、糖類、代糖類物質(zhì)[2]。蜂蜜摻假不僅降低了蜂蜜的營養(yǎng)價(jià)值，還極大地?fù)p害了正規(guī)蜂農(nóng)及企業(yè)的利益，破壞了市場(chǎng)秩序。蜂蜜摻假多使用價(jià)格低廉且外觀特性與蜂蜜極為相似的果葡糖漿、蔗糖或者麥芽糖漿[3]，目前報(bào)道了多種摻假檢測(cè)技術(shù)。例如A.I.Ruiz-Matute等人用GC（氣相色譜）和GC-MS（氣相色譜質(zhì)譜法）檢測(cè)蜂蜜中是否含有二果糖酸酐（DFAs）來判定是否摻假[4-6]，Megherb等人首先將樣品進(jìn)行反相固相萃取，去除單糖和部分寡糖，同時(shí)對(duì)多糖進(jìn)行濃縮，通過使用HPAEC-PAD（高效陰離子交換色譜）檢測(cè)樣品中的聚合度為11-17的多糖構(gòu)成指紋圖譜來鑒別樣品中是否摻有玉米糖漿，最低可檢測(cè)到的摻假量為1%[7]，李水芳等利用拉曼光譜結(jié)合PLS-LDA（偏最小二乘-線性判別分析）對(duì)蜂蜜中果葡糖漿和麥芽糖漿摻假進(jìn)行研究，結(jié)果對(duì)果葡糖漿和麥芽糖漿混合物、果葡糖漿、麥芽糖漿的準(zhǔn)確識(shí)別率分別達(dá)到 75.6%、91.1%、97.8%[8]，Davide Bertelli等人利用1D和2DNMR（核磁共振）測(cè)定蜂蜜中物質(zhì)成分差異，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法鑒定樣品真假[9]，Murat Tosund等人通過13C/12C同位素比率分析法可檢測(cè)出摻有5%以上麥芽糖漿的摻假蜂蜜[10，15]。

作者利用HILIC（親水作用色譜）柱分離低聚糖異構(gòu)體的優(yōu)勢(shì)[11]，通過檢測(cè)靈敏度比示差折光高且與梯度洗脫兼容的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）[11-14]對(duì)蜂蜜中的糖類物質(zhì)進(jìn)行分離測(cè)定，并根據(jù)純真蜂蜜和摻假所用糖漿的組成及其色譜峰差異，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法[9，16-21]對(duì)真假樣品進(jìn)行分類來判定蜂蜜摻假，從而建立了一種較通用、易推廣的新的蜂蜜摻假檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料 分別采集了江蘇、河北、山東、遼寧等地的蜂蜜，主要為洋槐、棗花、油菜、荊條、椴樹等9種單植物源蜂蜜，共33個(gè)樣品。樣品采集后按GB/T 23194-2008（蜂蜜中植物花粉的測(cè)定方法）確定蜂蜜的蜜源以及真實(shí)性；果葡糖漿、麥芽糖漿，均購自于市場(chǎng)。

1.1.2 試劑 葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽二糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 Agilent 1100系列高效液相色譜儀，Agilent公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理與摻假蜂蜜樣品的制備 采集常見的33個(gè)純真的單一花種蜂蜜，分別為油菜蜜、洋槐蜜、荔枝蜜、龍眼蜜、枇杷蜜、棗花蜜、椴樹蜜、苕子蜜，用這些真蜂蜜按質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～30%（梯度10%）加入果葡糖漿模擬配置一個(gè)摻假蜂蜜樣品集，樣品數(shù)為 99個(gè)（33×3=99）；選擇 15個(gè)上述真蜂蜜按質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～10%（梯度5%）加入麥芽糖漿配置一個(gè)摻假蜂蜜樣品集，樣品數(shù)為30個(gè)，真蜂蜜樣品33個(gè)，樣品集總數(shù)為162個(gè)。

稱取1.00 g樣品于25 mL容量瓶?jī)?nèi)，蒸餾水定容至刻度，充分混勻后，取1 mL過0.45 μm濾膜，濾液于液相進(jìn)樣瓶中備用。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為XBridgeTMD；流動(dòng)相：A（體積分?jǐn)?shù)50%乙腈）-B（體積分?jǐn)?shù)75%乙腈）二元梯度洗脫。梯度程序：0～20 min，體積分?jǐn)?shù)0%～50%A；20～30 min，50%A；30～33 min，50%～0%A；33～35 min，0%A（100%B）。柱溫：35 ℃；流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。 檢測(cè)器（ELSD）參數(shù)：漂移管溫度，95℃；氮?dú)饬髁浚?.5 mL/min。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及模型建立 對(duì)色譜圖中除單糖外的其他色譜峰進(jìn)行積分，求得每個(gè)峰面積百分比，為增加樣品間的差異，以每個(gè)峰的峰面積百分比與共有峰的第6個(gè)峰的峰面積百分比的比值為新變量，采用偏最小二乘-判別分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，該分析過程使用的是SIMCA-P11軟件。為了驗(yàn)證分類的穩(wěn)定性，將樣品集分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集。驗(yàn)證集是隨機(jī)從各個(gè)梯度摻假量樣品中選取的16個(gè)，訓(xùn)練集為其余146個(gè)樣品。通過相關(guān)系數(shù)R2和交叉驗(yàn)證回歸系數(shù)Q2對(duì)PLS-DA模型有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 真蜂蜜與模擬摻假蜂蜜的色譜峰特征及差異

圖1為一個(gè)真洋槐蜜的色譜圖。根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖對(duì)比（如圖2）可知，洋槐蜜在保留時(shí)間為10.644 min的色譜峰與蔗糖出峰時(shí)間接近（偏后），而洋槐蜜最后一個(gè)峰的保留時(shí)間為16.195 min的色譜峰與麥芽三糖出峰時(shí)間相近（偏前），因此洋槐蜜在保留時(shí)間為10.644、11.209、11.869、12.382、12.878、13.464、14.169 min處的色譜峰可能均為二糖及其異構(gòu)體，而保留時(shí)間為16.195 min的色譜峰則可能是三糖。將真洋槐蜜與摻有不同比例的果葡糖漿及麥芽糖漿的洋槐蜜色譜圖分別進(jìn)行對(duì)比（圖3和圖4）可見，純真洋槐蜜與摻假洋槐蜜的差異主要集中在10～15 min之間。圖3顯示，隨著果葡糖漿摻入量的增加，10～13 min的色譜峰高逐漸減小，說明該時(shí)間段，以蜂蜜成分峰為主；而13～15 min的色譜峰高隨著果葡糖漿摻入量的增加而增加，這表明該時(shí)間段以果葡糖漿成分峰為主。同樣，由圖4可見，隨著麥芽糖漿摻入量的增加，模擬摻假樣的10～12 min和13～15 min的色譜峰的峰高逐漸減小，即這兩時(shí)間段內(nèi)，亦以蜂蜜成分峰為主；而12～13 min的色譜峰高則隨著麥芽糖漿摻入量的增加而增加，也說明這些色譜峰以麥芽糖漿及其異構(gòu)體為主。

圖3 真洋槐蜜與摻質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、20%、30%果葡糖漿洋槐蜜對(duì)比圖Fig.3 Graph of the sugar profile for 10%，20%and 30%of added fructose corn syrup compared to

圖4 真洋槐蜜與摻質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、10%麥芽糖漿洋槐蜜對(duì)比圖Fig.4 Graph of the sugar profile for 5%，10%of added malt syrup compared to pure honey

為了定量地表征上述純真蜂蜜和摻假蜂蜜的色譜峰特征及其差異，從而有效地鑒別摻假蜂蜜，以下應(yīng)用偏最小二乘法將樣品的所有色譜峰的面積與保留時(shí)間為14.169 min（圖1）的共有峰面積之比作為變量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.2 真蜂蜜與假蜂蜜的判別分析

偏最小二乘法集主成分分析、多元回歸分析和典型相關(guān)分析的基本功能為一體，是一種多元統(tǒng)計(jì)方法，分析過程中可以對(duì)自變量進(jìn)行信息整合，消除眾多信息中相互重疊的部分，使得分析數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確可靠[18]。通過對(duì)比，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)增加至2時(shí)，交叉有效性的值為0.0295小于臨界值0.097，對(duì)提示模型的預(yù)測(cè)精度的貢獻(xiàn)不顯著，但為了能夠繪制出二位成分圖，所以依然選擇2個(gè)主成分t1，t2，不同主成分?jǐn)?shù)建模的有關(guān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1，圖5為蜂蜜摻假分類的主成分得分3D圖，其中黑色的代表所有真蜂蜜，紅色的代表摻有果葡糖漿的蜂蜜。圖中黑色標(biāo)記和紅色標(biāo)記的樣品沒有交叉，因此，該模型能夠?qū)悠愤M(jìn)行很好的分類。

表1 PLS-DA模型的精度分析Table1 Precision analysis of PLS-DA model

圖5 所有蜂蜜摻假分類的主成分得分3D圖Fig.5 PLS-DA 3D score plot of honey classification model

2.3 PLS-DA模型的分析

對(duì)模型進(jìn)行20次的置換檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，圖6為PLS-DA模型置換檢驗(yàn)圖。在圖中，Q2為累積交叉有效性，Q2值與模型的預(yù)測(cè)能力成正比關(guān)系，R2累計(jì)方差值，表示用于建立新的PLS-DA判別模型原始數(shù)據(jù)量的多少，R2值越大則表示模型的解釋能力也越強(qiáng)[18]。通過檢驗(yàn)圖6可以看出，所有位于左邊的R2和Q2值（Y軸數(shù)據(jù)）均低于最右邊的R2和Q2值，且Q2回歸線的截距均為負(fù)值，說明PLS-DA判別模型沒有出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象，且有較好的預(yù)測(cè)能力。

圖6 PLS-DA模型置換驗(yàn)證圖Fig.6 Permutation Validation of the PLS-DA model

2.4 PLS-DA模型對(duì)樣品分類驗(yàn)證結(jié)果

通過分類列表來評(píng)估模型的分類能力。對(duì)每一個(gè)樣品的判定標(biāo)準(zhǔn)為：①若Y＞0.5，且偏差＜0.5時(shí)，判定樣本屬于該類，②若Y＜0.5，偏差＜0.5時(shí)，判定不屬于該類，③若Y≥0.5，判定不穩(wěn)定[19]，部分樣品判定結(jié)果如表2。訓(xùn)練集中的判別率為94.02%，驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)識(shí)別率為100%，因此，可得出PLS-DA模型對(duì)蜂蜜摻假鑒別效果較好。

表2 部分樣品分類結(jié)果列表Table2 Classification List Reprojected onto the PLS-DA Model Performed by Considering partical Training Set Samples

續(xù)表2

在建模過程中，可采用主成分分析得到的一個(gè)衡量樣本到主成分空間原點(diǎn)距離的 Hotelling T2統(tǒng)計(jì)量來評(píng)估被監(jiān)測(cè)樣品色譜的離散程度，可以判斷出變量對(duì)模型的影響[19]。從圖7中可以看出，驗(yàn)證集中的變量都在臨界值以內(nèi)（綠色線以下），說明所有的驗(yàn)證集變量符合訓(xùn)練集所構(gòu)建的空間模型。

3 結(jié) 語

提出了一種應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)并結(jié)合偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對(duì)蜂蜜摻假進(jìn)行鑒別的方法，通過測(cè)定不同地區(qū)采集的不同種蜂蜜及其模擬摻假樣品的液相色譜圖，提取色譜峰型穩(wěn)定的8個(gè)共有特征組分，以訓(xùn)練集樣品進(jìn)行建模，以PLS-DA模型對(duì)16個(gè)驗(yàn)證集樣品預(yù)測(cè)，正確識(shí)別率為100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPLC-ELSD與PLS-DA識(shí)別分析相結(jié)合，能成功的鑒別出果葡糖漿摻入量在質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%以上、麥芽糖漿摻入量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%以上的摻假蜂蜜樣品。該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，所需儀器較常見，對(duì)C3或C4植物源的果葡糖漿和麥芽糖漿的摻假鑒別均適用，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。