miR-367-3p靶向SMURF1抑制BCG介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡和自噬

姬文蘭 王啟源 虞秀鋒 胡 萍 王亞梅

(陜西省結(jié)核病防治院內(nèi)四科，西安710100)

結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由致病菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染所引起的人畜共患的慢性傳染疾病。MTB為胞內(nèi)寄生菌，主要寄生的宿主細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，其進(jìn)入肺部后，由宿主的第一道防線巨噬細(xì)胞所識(shí)別、結(jié)合、吞噬，使MTB激活宿主細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)，引起多種通路的活化，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡，吞噬小體酸化，形成吞噬溶酶體，細(xì)胞吞噬作用增強(qiáng)，同時(shí)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子共同發(fā)揮抗結(jié)核作用來清除感染[1]。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類長(zhǎng)度約為20～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可通過抑制靶mRNA翻譯或誘導(dǎo)靶mRNA降解從而影響多種生物學(xué)進(jìn)程[2-4]。miRNAs在MTB與宿主細(xì)胞相互作用過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)感染后細(xì)胞免疫反應(yīng)和細(xì)胞命運(yùn)，甚至限制細(xì)菌增殖，參與機(jī)體抗結(jié)核感染的過程[5-7]。近年來，多項(xiàng)研究表明多種miRNAs在MTB侵入巨噬細(xì)胞后表達(dá)量發(fā)生改變，可通過靶向關(guān)鍵基因，調(diào)控凋亡及自噬過程，進(jìn)而干擾宿主細(xì)胞對(duì)MTB的清除[8-13]。因此，研究miRNAs與TB之間的關(guān)系不僅有助于闡明MTB致病和宿主應(yīng)對(duì)結(jié)核菌的免疫反應(yīng)機(jī)理，還能為TB生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的研究提供依據(jù)。

本研究以RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象，探究miR-367-3p在巨噬細(xì)胞抗卡介苗菌株(Bacillus calmette-guerin，BCG)感染機(jī)制中的關(guān)鍵作用，以期了解在BCG感染巨噬細(xì)胞過程中miR-367-3p對(duì)凋亡和自噬及介導(dǎo)的免疫效應(yīng)的影響及其機(jī)制，為探討TB發(fā)病機(jī)制、研發(fā)新的診斷與治療方法提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7(中科院上海細(xì)胞所)；Middlebrook 7H9培養(yǎng)基(BD公司，美國(guó))；Trizol試劑盒和LipofectamineTM2000脂質(zhì)體(Invitro-gen公司，美國(guó))；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega公司，美國(guó))；SYBR Premix Ex TaqⅡ(Qiagen公司，德國(guó))；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司，美國(guó))；PVDF膜(Millipore公司，美國(guó))；Bax、Bcl-2、p62、SMURF1和β-actin抗體(Abcam公司，美國(guó))；LC3抗體(Cell Signaling Technology公司，美國(guó))；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo公司，美國(guó))；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Cell Death Detection ELISA kit(Roche公司，德國(guó))；miR-367-3p抑制劑及陰性對(duì)照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；BCG購自上海生物制品研究所有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7巨噬細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，胰酶消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖狀態(tài)良好，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2BCG處理RAW264.7巨噬細(xì)胞 RAW264.7細(xì)胞懸液加入六孔板的各孔中，加入DMEM培養(yǎng)基，24 h后棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌2～3次。在每孔滴加MOI=10的菌懸液(BCG與細(xì)胞的比例為10∶1)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2孵育。感染4 h后棄上清，目的是去除未感染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，更換新鮮培養(yǎng)液，此時(shí)作為細(xì)胞感染的0 h。BCG感染巨噬細(xì)胞0、6、12、24及48 h時(shí)檢測(cè)各組miR-367-3p的表達(dá)水平。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用LipofectamineTM2000試劑將miR-367-3p抑制劑(inhibitors)及陰性對(duì)照(Negative control，NC)轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平 細(xì)胞總RNA提取按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行操作，分光光度法測(cè)定總RNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用SYBR試劑盒在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上測(cè)定目的基因相對(duì)表達(dá)水平。采用Quantity one凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定各相應(yīng)條帶的灰度值，以U6和β-actin作為內(nèi)參照，目的基因的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 按照全蛋白提取試劑盒說明提取細(xì)胞的總蛋白，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入特異性一抗于4℃過夜孵育。TBST漂洗3×10 min后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗3×10 min后用ECL發(fā)光顯影并拍照；Western blot檢測(cè)條帶用凝膠成像儀分析系統(tǒng)Quantity One軟件掃描灰度值。計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值的比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6CFU計(jì)數(shù)檢測(cè)BCG存活率 巨噬細(xì)胞RAW264.7轉(zhuǎn)染miR-367-3p inhibitors和NC 24 h，被BCG感染4 h后，用PBS洗滌以清除細(xì)胞外細(xì)菌。此后，被感染的細(xì)胞在指定的時(shí)間內(nèi)孵育，去除12孔板中的培養(yǎng)液后每孔加入500 μl 0.5% Triton X-100裂解細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞的裂解情況，待巨噬細(xì)胞全部裂解后每孔加入500 μl完全培養(yǎng)液終止裂解。振蕩混勻5 min，將稀釋后裂解物一式3份并接種至含有OADC的Middlebrook 7H10瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3周后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.7ELISA檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將RAW264.7細(xì)胞以5×105個(gè)/ml接種于六孔板培養(yǎng)皿中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理后24 h，用細(xì)胞凋亡ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，參照說明書進(jìn)行操作。

1.2.8生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析 利用生物信息學(xué)軟件TargetScan、miRanda及PicTar等預(yù)測(cè)miR-367-3p的靶基因。

1.2.9熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 分別將含有野生型[Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smad ubiquitin regulatory factor-1, SMURF1)3′-UTR-WT]及突變型(SMURF1 3′-UTR-Mut)的報(bào)告基因載體和miR-367-3p inhibit-ors、NC共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，48 h后，按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒使用說明進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以海腎熒光素酶作為內(nèi)參，計(jì)算螢火蟲熒光強(qiáng)度與海腎熒光強(qiáng)度比值。

2 結(jié)果

2.1miR-367-3p在MTB感染的RAW264.7細(xì)胞中高表達(dá) 為探討miR-367-3p在BCG感染的免疫應(yīng)答中的作用，首先檢測(cè)BCG感染6、12、24和48 h后小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中miR-367-3p的表達(dá)量，結(jié)果顯示，與0 h相比，BCG處理不同時(shí)間后，RAW264.7中miR-367-3p的表達(dá)水平均明顯升高，且24 h時(shí)miR-367-3p表達(dá)量最高(圖1A)，由此表明BCG誘導(dǎo)的miR-367-3p在BCG感染的RAW264.7細(xì)胞中具有重要調(diào)節(jié)作用。隨后為進(jìn)一步探討miR-367-3p在BCG感染巨噬細(xì)胞中的作用機(jī)制，RAW264.7轉(zhuǎn)染miR-367-3p inhibitors下調(diào)其表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染效率如圖1B所示，BCG誘導(dǎo)的miR-367-3p的表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示轉(zhuǎn)染成功。

2.2miR-367-3p抑制MTB誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡 CFU檢測(cè)胞內(nèi)BCG存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-367-3p后胞內(nèi)BCG存活率明顯降低(圖2A)，提示miR-367-3p可促進(jìn)BCG在巨噬細(xì)胞中的存活。進(jìn)而檢測(cè)miR-367-3p是否對(duì)BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有影響，ELISA結(jié)果顯示miR-367-3p下調(diào)明顯增加細(xì)胞凋亡率(圖2B)，說明miR-367-3p能夠抑制BCG介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。同時(shí)，Western blot檢測(cè)促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，結(jié)果顯示抑制miR-367-3p表達(dá)明顯上調(diào)Bax的表達(dá)并下調(diào)Bcl-2表達(dá)水平(圖2C～E)。上述結(jié)果揭示抑制miR-367-3p通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡進(jìn)而加強(qiáng)宿主巨噬細(xì)胞對(duì)BCG的清除。

圖1 BCG感染誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中miR-367-3p的表達(dá)Fig.1 miR-367-3p expression in BCG-stimulated RAW 264.7Note: A.Relative expression level of miR-367-3p at indicated time was determined by RT-PCR analysis.*.P<0.05 vs 0 h；B.RT-PCR was carried out to evaluate the transfection efficiency of miR-367-3p inhibitors.*.P<0.05 vs NC(no BCG)；#.P<0.05 vs NC；&.P<0.05 vs BCG+NC.

2.3miR-367-3p抑制BCG介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬進(jìn)程 為了探討miR-367-3p對(duì)巨噬細(xì)胞自噬過程的調(diào)控作用，Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ和p62表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示，下調(diào)miR-367-3p表達(dá)后，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)升高且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ數(shù)值增大，同時(shí)p62的表達(dá)水平降低(圖3)，提示miR-367-3p可抑制BCG介導(dǎo)的細(xì)胞自噬過程，從而調(diào)控胞內(nèi)BCG的存活。

圖2 miR-367-3p對(duì)BCG介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-367-3p on BCG-mediated apoptosisNote: A.BCG survival was determined using CFU assay；B.Cell apoptosis was examined by ELISA assay；C-E.Western blot was performed to determine the protein expression of Bax and Bcl-2 in different groups.*.P<0.05 vs NC(no BCG)；#.P<0.05 vs NC.

圖3 miR-367-3p對(duì)BCG感染的巨噬細(xì)胞的自噬進(jìn)程的影響Fig.3 Effect of miR-367-3p on autophagy process in BCG-infected macrophagesNote: Representative Western blot and quantitative analysis showed the levels of autophagy relative protein LC3-Ⅱ and p62.*.P<0.05 vs NC(no BCG)；#.P<0.05 vs NC.

圖4 miR-367-3p可直接靶向結(jié)合SMURF1的3′-UTRFig.4 miR-367-3p directly targeted 3′-UTR of the SM-URF1Note: A.Interaction sites of miR-367-3p with predicted target gene SMURF1 3′-UTR；B.The interaction between the miR-367-3p and SMURF1 detected by Dual-Luciferase Reporter Assay.*.P<0.05 vs NC.

圖5 miR-367-3p負(fù)調(diào)控SMURF1的表達(dá)水平Fig.5 miR-367-3p negative regulated SMURF1 expressionNote: A.The SMURF1 mRNA levels were determined using RT-PCR assay.B，C.The protein expression of SMURF1 was evaluated using Western blot analysis.*.P<0.05 vs NC(no BCG)；#.P<0.05 vs NC；&.P<0.05 vs BCG+NC.

2.4生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-367-3p靶基因 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示SMURF1為miR-367-3p的直接靶基因(4A)。熒光素酶報(bào)告活性實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示miR-367-3p inhibitors可顯著增加SMURF1-WT的熒光素酶活性，而SMURF1-Mut熒光素酶活性無明顯變化(圖4B)，說明miR-367-3p可靶向作用SMURF1的3′-UTR。

2.5miR-367-3p靶向調(diào)控SMURF1的表達(dá) 進(jìn)一步采用RT-PCR和Western blot驗(yàn)證miR-367-3p和SMURF1的靶向調(diào)控關(guān)系，RT-PCR結(jié)果顯示抑制miR-367-3p后SMURF1的mRNA表達(dá)量顯著升高(圖5A)。與RT-PCR結(jié)果一致，miR-367-3p下調(diào)明顯增加SMURF1的蛋白水平(圖5B、C)，該結(jié)果提示miR-367-3p能夠負(fù)調(diào)控SMURF1的表達(dá)。

3 討論

TB是一種難以根治的慢性傳染性疾病，目前研究證實(shí)多種miRNAs參與了TB的發(fā)病過程。研究發(fā)現(xiàn)MTB侵入巨噬細(xì)胞后，miRNAs可通過影響巨噬細(xì)胞免疫殺傷功能在一定程度上參與機(jī)體抗MTB感染過程，因此探討miRNAs在MTB逃逸巨噬細(xì)胞殺傷過程中的作用對(duì)于揭示TB發(fā)病機(jī)制以及尋找抗結(jié)核藥物靶標(biāo)就顯得尤為重要。本研究旨在探討miR-367-3p在巨噬細(xì)胞抗BCG感染機(jī)制中的關(guān)鍵作用，為TB的診斷與治療提供新途徑。研究首次發(fā)現(xiàn)miR-367-3p在BCG感染的巨噬細(xì)胞RAW264.7中上調(diào)，并呈時(shí)間依賴性，表明miR-367-3p可能參與BCG感染巨噬細(xì)胞的調(diào)控過程。

大量研究證實(shí)miRNAs通過多種免疫機(jī)制逃逸參與巨噬細(xì)胞對(duì)MTB的殺傷，如抑制巨噬細(xì)胞凋亡、抑制溶酶體水解酶降解酸化、抑制吞噬體成熟、干擾抗原呈遞、避免反應(yīng)氧和反應(yīng)氮產(chǎn)物的毒性反應(yīng)、抑制自噬等，使MTB在體內(nèi)復(fù)制[1,14]。MTB進(jìn)入機(jī)體之后，巨噬細(xì)胞可以通過自身凋亡以殺死巨噬細(xì)胞內(nèi)的MTB，阻止MTB在體內(nèi)播散，并可激活鄰近未被感染的巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)MTB的殺傷能力；這一過程既可抑制細(xì)胞內(nèi)MTB的釋放，又可抑制菌體在宿主內(nèi)進(jìn)一步的生長(zhǎng)和繁殖[15,16]。對(duì)MTB的識(shí)別及抗凋亡機(jī)制的研究，將為TB的防治提供新的靶目標(biāo)和新思路。本研究結(jié)果顯示抑制miR-367-3p可降低BCG的胞內(nèi)存活量，即下調(diào)miR-367-3p有利于BCG的清除。巨噬細(xì)胞凋亡可有效控制MTB的散播及生長(zhǎng)，對(duì)MTB的清除具有重要作用。進(jìn)一步探討miR-367-3p對(duì)BCG感染巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，檢測(cè)miR-367-3p對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡率及相關(guān)靶基因表達(dá)水平的影響，研究結(jié)果揭示下調(diào)miR-367-3p通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡進(jìn)程。以上結(jié)果提示抑制miR-367-3p通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而影響胞內(nèi)BCG清除，是機(jī)體對(duì)結(jié)核感染防御的主要免疫機(jī)制。

MTB作為胞內(nèi)寄生菌，以巨噬細(xì)胞為宿主。近年研究表明自噬是巨噬細(xì)胞中固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要組成部分，可以參與調(diào)控MTB在胞內(nèi)的存活及巨噬細(xì)胞對(duì)于MTB的清除作用[17]。自噬與凋亡作為程序性死亡的兩種方式，既相互獨(dú)立又緊密相關(guān)，清除機(jī)體受到外界刺激時(shí)產(chǎn)生的病變細(xì)胞及正常生命周期內(nèi)衰老細(xì)胞，進(jìn)而維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡與穩(wěn)定。在機(jī)體演變中自噬可以對(duì)凋亡產(chǎn)生一定的影響，反過來凋亡也可以通過各種信號(hào)通路介導(dǎo)進(jìn)而調(diào)控自噬的程度。自噬可以做為胞內(nèi)病原體感應(yīng)機(jī)制，如果自噬受到抑制，那么將容易發(fā)生感染。自噬有利于宿主細(xì)胞清除感染的病原菌以減輕自身損傷，是機(jī)體免疫防御的重要組成部分[18]。目前已發(fā)現(xiàn)有多種途徑參與自噬的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)。在感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生能促進(jìn)吞噬體和溶酶體的融合，抑制胞內(nèi)MTB的存活。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在肺結(jié)核患者體內(nèi)顯著升高或降低，其通過靶向巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因表達(dá)從而抑制自噬，增強(qiáng)MTB的抗自噬能力和生存力。LC3Ⅱ是自噬小體標(biāo)志蛋白，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ可以反映細(xì)胞發(fā)生自噬的水平。p62為自噬活化過程中的一個(gè)調(diào)節(jié)分子，與自噬程度呈負(fù)相關(guān)[19]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討miR-367-3p對(duì)BCG感染巨噬細(xì)胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-367-3p表達(dá)后自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)水平升高，而p62表達(dá)水平降低，表明miR-367-3p可抑制BCG介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬過程。上述結(jié)果提示miR-367-3p的下調(diào)可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)宿主細(xì)胞對(duì)于BCG的清除作用，從而參與TB的免疫病理反應(yīng)。

繼而尋找miR-367-3p對(duì)巨噬細(xì)胞免疫殺傷功能影響的關(guān)鍵靶標(biāo)，為結(jié)核病的機(jī)制的完善奠定基礎(chǔ)。SMURF1是一種與E6相關(guān)蛋白C端同源型泛素連接酶，在免疫系統(tǒng)中具有重要作用。有研究報(bào)道SMURF1缺失抑制MTB感染介導(dǎo)的自噬過程，且胞內(nèi)MTB存活率升高[20]。利用TargetScan、miRDB、PicTar等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到miR-367-3p靶基因?yàn)镾MUR-F1。熒光素酶報(bào)告基因活性分析顯示miR-367-3p能特異結(jié)合到SMURF1 3′-UTR，明顯抑制熒光素酶活性。進(jìn)一步通過RT-PCR和Western blot方法驗(yàn)證miR-367-3p對(duì)SMURF1的靶向調(diào)控作用，結(jié)果顯示miR-367-3p能夠負(fù)向調(diào)控SMURF1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。上述結(jié)果揭示miR-367-3p能直接結(jié)合SMURF1 3′-UTR并靶向負(fù)調(diào)控其表達(dá)。

綜上所述，下調(diào)miR-367-3p可通過靶向SMUR-F1負(fù)向調(diào)控其表達(dá)，從而促進(jìn)BCG介導(dǎo)的凋亡和自噬過程，揭示miR-367-3p在BCG感染的巨噬細(xì)胞凋亡和自噬途徑中發(fā)揮重要作用，同時(shí)，抑制miR-367-3p也會(huì)在BCG感染細(xì)胞后，起到促進(jìn)宿主細(xì)胞對(duì)BCG的清除作用，阻止BCG的胞內(nèi)生存，為MTB的胞內(nèi)存活機(jī)制及TB的靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ)和新的思路。