• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    微生物發(fā)酵床不同深度墊料的細(xì)菌群落多樣性

    2019-10-23 06:01:10陳倩倩朱育菁劉國紅車建美王階平鄭雪芳張海峰
    關(guān)鍵詞:墊料中層菌門

    陳倩倩,劉 波,朱育菁,劉國紅,車建美,王階平,鄭雪芳,張海峰

    (福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所,福州 350003)

    微生物發(fā)酵床具有降解糞污的功效,其中的微生物起物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化的作用,是發(fā)酵床良性運(yùn)作的核心[1-2]。發(fā)酵床中的微生物種群豐富,肖榮鳳等[3]自發(fā)酵床中分離了18種真菌,包含總狀毛霉、尖孢枝孢菌、橘青霉和構(gòu)巢曲霉等。劉國紅等[4]研究表明發(fā)酵床中的芽孢桿菌含量多達(dá)4.41×108個(gè)·g-1,其中芽胞桿菌屬、賴氨酸芽胞桿菌屬和類芽胞桿菌屬是優(yōu)勢菌?;潞A值萚5]采用高通量測序的方法探尋了發(fā)酵床中的微生物組成,揭示發(fā)酵床的優(yōu)勢菌為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和放線菌門,包含節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬等。筆者前期采用高通量測序發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床中的主要細(xì)菌與宦海林等[5]的研究結(jié)果一致,同時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床中含有多種糞污降解菌,包括棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、枝芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、放線菌屬、乳桿菌屬等[6]。

    微生物發(fā)酵床墊料深度一般為60~100 cm,不同深度墊料的微環(huán)境有所差異,因此導(dǎo)致其中微生物種群和數(shù)量的差異。張學(xué)峰等[7]分離純化了不同深度墊料的細(xì)菌,發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵床30 cm處的墊料活菌數(shù)量大于表層墊料,推測微生物發(fā)酵床的核心發(fā)酵層是30 cm處的墊料層,此處的主要發(fā)酵菌株為地衣芽孢桿菌。而鄭雪芳等[8]采用脂肪酸標(biāo)記了不同深度墊料中的微生物,發(fā)現(xiàn)表層墊料(0~25 cm)中的微生物含量最高。由于培養(yǎng)條件限制,傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法通常無法獲得全部的環(huán)境微生物,因此可能會造成研究結(jié)果的差異。16S rDNA的高通量測序技術(shù),無分離培養(yǎng)的過程,直接提取和克隆環(huán)境樣品中所有微生物的DNA,獲得環(huán)境中所有微生物的遺傳信息,能夠較為全面地揭示環(huán)境微生物的多樣性。然而,基于宏基因分析養(yǎng)豬發(fā)酵床不同深度微生物組的研究未見報(bào)道,因此本研究采用高通量測序研究不同深度墊料的微生物群落,明確發(fā)酵床糞污降解的優(yōu)勢層,發(fā)掘潛在的降解菌,促進(jìn)養(yǎng)殖廢棄物的資源化利用。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    微生物發(fā)酵床位于福建省福清漁溪現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)樣本工程示范基地,自2013年8月開始運(yùn)行。發(fā)酵床墊料由70%椰糠和30%谷殼粉構(gòu)成,墊料每年更換一次。采用五點(diǎn)取樣法(以發(fā)酵床對角線的中點(diǎn)作為中心取樣點(diǎn),再在對角線上選擇4個(gè)與中心取樣點(diǎn)距離相等的點(diǎn)作為取樣點(diǎn),共計(jì)5處取樣點(diǎn)),取10、11月和12月的不同深度墊料(表層10 cm、中層30 cm、深層50 cm),分別命名為OCT10cm、OCT30cm、OCT50cm、NOV10cm、NOV30cm、NOV50cm、DEC10 cm、DEC30cm、DEC50cm。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 微生物發(fā)酵床墊料總DNA的提取[9]

    每個(gè)樣本稱取500 mg墊料,按土壤DNA提取試劑盒FastDNA SPIN Kit for Soil的操作指南,分別進(jìn)行總DNA的提取。調(diào)整終濃度至1 ng·μL-1開展后續(xù)試驗(yàn)。

    1.2.2 微生物組16S rDNA V3~V4區(qū)測序

    采用原核生物16S rDNA基因V3~V4區(qū)通用引物338F(5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和806R(5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′,對各墊料樣本總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(重復(fù)3次)。從3次重復(fù)中取相同體積混合后進(jìn)行目的片段回收,所用膠回收試劑盒為AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)。采用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)對回收產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測。然后構(gòu)建插入片段為350 bp的paired-end(PE)文庫(TruSeqTMDNA Sample Prep Kit建庫試劑盒,Illumina公司),經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測,HiSeq上機(jī)測序。

    1.2.3 微生物組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析

    對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾,得到有效數(shù)據(jù)。采用Mothur軟件(version 1.36.1)基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行 OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析[10]。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析[11]。從各個(gè)OTU中挑選出一條代表序列與已知物種的16S數(shù)據(jù)庫(Silva,http://www.arb-silva.de)進(jìn)行比對,完成物種注釋;根據(jù)每個(gè)OTU中序列的條數(shù),得到各個(gè)OTU的豐度值[12-13]。同時(shí)進(jìn)行樣品之間的共有及特有OTU數(shù)目分析、物種組成及物種差異性分析[14]、16S功能預(yù)測[15]。

    相應(yīng)的數(shù)據(jù)釋放與SRA(Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫,序列號分別為SRR5611224(OCT10cm)、SRR5611227(NOV10cm)、SRR5611230(DEC10cm)、SRR5611225(OCT30cm)、SRR5611228(NOV30cm)、SRR5611231(DEC30cm)、SRR5611226(OCT50cm)、SRR5611229(NOV50cm)和SRR5611232(DEC50cm)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同深度墊料細(xì)菌多樣性測序分析

    經(jīng)454焦磷酸測序,9個(gè)樣本共獲得1 045 225個(gè)有效序列,有效堿基數(shù)458 650 508 bp,序列平均長度438.8 bp,各樣本分析結(jié)果見表1。不同樣品宏基因組分析結(jié)果存在差異:序列數(shù)量最大值為DEC10cm(140 350條),最小值為NOV50cm(101 537條)。表層、中層和深層墊料的短序列數(shù)分別為125 687、119 364和103 357。試驗(yàn)共檢測到1834種OUT類型,包含32門、76綱、156目、303科、609屬和939種細(xì)菌。其中,表層墊料包含31門、71綱、144目、283科、576屬和891種細(xì)菌,中層墊料包含31門、72綱、146目、283科、580屬和904種細(xì)菌,深層墊料包含30門、69綱、140目、268科、546屬和853種細(xì)菌。

    表1 發(fā)酵床墊料微生物細(xì)菌群落宏基因組測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Similarity-based OTUs and species richness estimates of the bacterial phylotypes of the litters

    2.2 微生物發(fā)酵床不同深度墊料的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

    表層、中層和深層墊料OTUs種類分別為1701、1731種和1587種(圖1)。中層墊料OTUs種類最多,物種最為豐富,深層墊料細(xì)菌種類少。3組樣本共有的OTU有1482種,表層10 cm樣本與中層30 cm樣本共有OTUs 1676種,10 cm與50 cm共有1513種OTUs,30 cm與50 cm樣本共有155種OTUs。表層和中層樣本共有OTUs種類最多,而表層和深層共有OTUs種類最少,表明相鄰深度墊料趨向含有更多的共有OTUs。表層10 cm的樣本,特有OTUs為26種,占表層總OTU的1.5%。中層30 cm樣本特有OTUs為16種(0.9%),深層50 cm樣本特有OTUs為14種(0.9%)。綜上分析,微生物發(fā)酵床表層墊料具有更多的細(xì)菌和特有細(xì)菌種類,隨著墊料深度增加,細(xì)菌種類減少;微生物發(fā)酵床相鄰深度墊料具有更多的共有細(xì)菌種類。

    圖1 樣品韋恩圖Figure 1 Venn diagram denoting the unique and shared OTUs in the different samples

    2.2.1 各發(fā)酵等級細(xì)菌門群落結(jié)構(gòu)分析

    微生物發(fā)酵床墊料共檢測到32個(gè)細(xì)菌門(圖2)。在表層墊料中,占主要比例的細(xì)菌為擬桿菌門(25.3%)和變形菌門(25.9%);擬桿菌含量低于深層墊料同月份采集樣本;放線菌門(10.2%)高于中層(7.6%)和深層墊料(5.4%)。在中層墊料中,含量高的細(xì)菌為擬桿菌門(27.8%)、變形菌門(25.1%)和厚壁菌門(17.0%)。在深層墊料中,主要的細(xì)菌門為擬桿菌門(33.3%)、變形菌門(13.0%)、厚壁菌門(15.2%)和糖桿菌門(14.7%),其中擬桿菌門含量高于表層和中層墊料。

    圖2 微生物發(fā)酵床墊料在門水平的微生物組成Figure 2 Relative abundances of predominant bacterial compositions on phylum levels

    2.2.2各發(fā)酵等級細(xì)菌科結(jié)構(gòu)分析

    微生物發(fā)酵床不同深度樣本共獲得303個(gè)細(xì)菌科(圖3)。在表層墊料中,黃桿菌科含量最高(7.4%)。在中層墊料中,黃單胞桿菌科(9.9%)、糖桿菌科(8.4%)和黃桿菌科(6.3%)是含量較高的細(xì)菌科。在深層墊料中,糖桿菌科(14.7%)含量最高,其次為螺旋體科(9.0%)、紫單胞菌科(7.6%)和海洋滑動菌科(7.1%)。微生物發(fā)酵床深層墊料不同月份樣本具有相似的細(xì)菌群落構(gòu)成,而表層和中層墊料不同月份樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異很大。尤其是采集于10月份的微生物發(fā)酵床墊料,與相同深度不同月份的樣本具有明顯差異。10月份的表層和中層墊料中的主要細(xì)菌為糖桿菌門(17.7%)和變形菌門的黃單胞菌科(30.0%);11月份的表層和中層墊料中則是擬桿菌門的Cryomorphaceae(7.9%)和綠彎菌門的厭氧蠅菌科(8.7%)含量最高;12月份的表層和中層墊料中糖桿菌門(10.3%)和擬桿菌門的紫單胞桿菌科(9.6%)含量較高。

    2.3 墊料微生物與深度的關(guān)聯(lián)性分析

    RDA結(jié)果顯示(圖4),深度對墊料微生物多樣性的影響大于月份對微生物群落的影響。厚壁菌門和綠彎菌門隨著墊料深度的增加而增加,放線菌門、擬桿菌門和棲熱菌門與墊料深度負(fù)相關(guān)。放線菌門在10月份的淺層墊料中含量最高,棲熱菌門在12月份的表層墊料中含量最高。厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和綠彎菌門與月份呈正相關(guān),在11月份和12月份墊料中的含量高于10月份墊料。而放線菌門與月份呈負(fù)相關(guān),在10月份墊料中含量最高。

    綜合分析,深層墊料有穩(wěn)定的微生物群落,10、11月和12月采集的樣本中,其主要優(yōu)勢菌都為糖桿菌門、螺旋體門和擬桿菌門。淺層墊料微生物群落變化較大,微生物分布與月份相關(guān),如DEC30cm和DEC10cm(擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門),NOV30 cm和NOV10cm(擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和綠彎菌門),OCT30cm和OCT10cm(擬桿菌門和變形菌門)有相似的微生物群落結(jié)構(gòu)。發(fā)酵床養(yǎng)殖過程中,生物活動干擾表層和中層的墊料,因而導(dǎo)致發(fā)酵床表層墊料微生物群落的動態(tài)變化。

    圖3 微生物發(fā)酵床墊料在科水平的微生物組成Figure 3 Relative abundances of predominant bacterial compositions on family levels

    圖4 墊料微生物與發(fā)酵床深度的RDA分析Figure 4 Redundancy analysis(RDA)of the relationship between bacteria and depth

    2.4 微生物發(fā)酵床不同深度墊料物種差異分析

    在門水平上,螺旋菌門在不同深度墊料間具有顯著差異性(圖5),該門在深層墊料(9.2%)中含量遠(yuǎn)高于中層(2.7%)和淺層墊料(0.9%)。擬桿菌門隨著墊料深度的增大而增多,在深層、中層和淺層墊料中的含量分別為33.3%、27.8%和25.3%。變形菌門則主要活躍在表層(25.9%)和中層墊料(25.1%)。放線菌門和異常球菌-棲熱菌門在表層墊料中的含量大于中層和深層墊料,其中放線菌門在表層、中層和深層墊料中的含量分別為10.2%、7.6%和54%,異常球菌-棲熱菌門在表層墊料中的含量為3.7%,是中層和深層墊料的1.8倍和3.0倍。隨著深度的增加,底層墊料中的溶氧量降低,為厭氧菌提供了生長環(huán)境,因此在深層墊料中厭氧菌含量高。

    在科水平上,螺旋菌門的螺旋體科在深層墊料中的含量高于其他層墊料(圖6)。該菌是厭氧的腐生菌,可降解深層墊料中的有機(jī)質(zhì)。擬桿菌門的海洋滑動菌科和擬桿菌目在深層墊料中的含量也高于淺層墊料,分別是表層墊料的4.0倍和19.3倍。而特呂珀菌科主要分布于表層(3.7%)和中層墊料(1.4%)中,在深層墊料(1.2%)中含量低。擬桿菌門的霜狀菌在中層(3.7%)和表層(3.8%)墊料中含量高于深層墊料(0.5%)。

    2.5 發(fā)酵床微生物代謝相關(guān)基因的等級差異分析

    圖5 不同深度墊料細(xì)菌在門水平上差異顯著性分析Figure 5 Significance difference of bacteria in litters of different depth on the phylunm level

    PICRUSt預(yù)測不同深度墊料中細(xì)菌的主要有機(jī)物降解途徑的基因數(shù)目見圖7。表層墊料細(xì)菌群落中與氨基酸、碳水化合物和脂類代謝相關(guān)的基因拷貝數(shù)最多,深層最少,表明表層墊料中的細(xì)菌代謝最為旺盛,而深層墊料細(xì)菌的代謝較為緩慢。結(jié)合前文高通量測序的結(jié)果,表層墊料中細(xì)菌數(shù)量最多,提供了更多的代謝相關(guān)基因,因此代謝旺盛。如表層墊料中與氮素降解相關(guān)的硝酸還原酶在表層、中層和深層墊料的拷貝數(shù)分別為2928、1848和909,表層墊料中的含量高于深層墊料。因此,發(fā)酵床表層墊料中的細(xì)菌群落在養(yǎng)殖廢棄物的降解中起主要作用。

    圖6 不同深度墊料細(xì)菌在科水平上差異顯著性分析Figure 6 Significance difference of bacteria in litters of different depth on the family level

    圖7 不同發(fā)酵程度墊料中細(xì)菌群落氨基酸、碳水化合物和脂類代謝相關(guān)基因的分布Figure 7 Functional prediction of bacterial community in amino acid,carbohydrate and lipid metabolism in litters of different fermentation grades

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門是微生物發(fā)酵床的主要細(xì)菌。深層墊料與淺層墊料有著不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。發(fā)酵床墊料表層和中層中的細(xì)菌主要為異常球菌-棲熱菌門的特呂珀菌科、變形菌門的黃單胞菌科和擬桿菌門的黃桿菌科細(xì)菌。特呂珀菌科細(xì)菌的最佳生長溫度為50℃,可以抵御堆肥的高溫,利用多種糖類、有機(jī)酸和氨基酸等有機(jī)質(zhì)[16-17]。黃單胞菌科細(xì)菌在蚯蚓堆肥系統(tǒng)中起降解作用[18-19],還能夠降解碳水化合物,是木質(zhì)材料堆肥過程中的優(yōu)勢菌群[20-21],可能參與降解微生物發(fā)酵床墊料中的椰糠、谷殼以及豬糞中的碳水化合物。黃桿菌科細(xì)菌能夠抵御抗生素脅迫,并能降解有機(jī)物,是堆肥中的常見菌[22];黃桿菌能夠降解多糖,如纖維素、木聚糖、幾丁質(zhì)和葡聚糖[23-24];黃桿菌屬的F.banpakuense可還原硝酸鹽,參與堆肥中的氮循環(huán)[25]。

    深層墊料中厭氧菌含量高,如螺旋體門的螺旋體科、擬桿菌門的腐螺旋菌科,微生物發(fā)酵床深層墊料缺氧環(huán)境適合其生長。螺旋體門的螺旋體科、擬桿菌門的紫單胞桿菌科和腐螺旋菌科、糖桿菌門、厚壁菌門的梭菌目是深層墊料中的主要有機(jī)質(zhì)降解菌。紫單胞桿菌科在動物糞便降解中發(fā)揮作用[26-27];腐螺旋菌科在污泥處理中起重要作用[28-29]。糖桿菌目的細(xì)菌分布于土壤、沉積物、廢水以及動物中,許多細(xì)菌能夠厭氧發(fā)酵,分泌多種酶,參與有機(jī)物降解[30-31]。

    在12月份的表層和中層墊料中,硫假單胞菌和寡源桿菌屬含量較高,硫假單胞菌是厭氧菌,用硝酸鹽氧化硫化物和乙酸鹽,產(chǎn)生可利用的硫[32-33]。在11月份的表層和中層墊料中,厭氧蠅菌科含量較高,厭氧蠅菌科在降解碳水化合物的過程中有重要作用,Liang等[34]在長期發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)厭氧蠅菌科在長鏈正烷烴生物降解的初始活化中起關(guān)鍵作用。在10月份表層和中層樣本中,藤黃桿菌屬含量最高,此屬的某些細(xì)菌可分泌脂肪酶[35];某些細(xì)菌可降解甲胺磷,參與環(huán)境修復(fù)[36]。這些細(xì)菌可能參與了發(fā)酵床豬糞的降解過程。

    此外,本研究首次在陸地生境中發(fā)現(xiàn)海洋細(xì)菌——霜狀菌,霜狀菌屬于黃桿菌目,分離自海水、藻類等海洋生境[37-38]。本實(shí)驗(yàn)場所是一座圍海造田后的農(nóng)場,地處海邊,推測霜狀菌經(jīng)由海水滲透和空氣傳播至豬場,這是首次在微生物發(fā)酵床中發(fā)現(xiàn)該類細(xì)菌,其功能及對發(fā)酵床的影響有待進(jìn)一步研究。

    4 結(jié)論

    (1)本研究采用高通量測序技術(shù),分析了3種不同深度墊料中的細(xì)菌群落,結(jié)果發(fā)現(xiàn)表層墊料中微生物含量最高,表明發(fā)酵床表層是豬糞降解的主要功能層。

    (2)發(fā)酵床表層和中層的優(yōu)勢菌為異常球菌-棲熱菌門的特呂珀菌科、變形菌門的黃單胞菌科和擬桿菌門的黃桿菌科細(xì)菌;深層墊料中含有豐富的厭氧細(xì)菌,包括螺旋體科、腐螺旋菌科,參與發(fā)酵床中有機(jī)質(zhì)的降解。

    (3)微生物發(fā)酵床細(xì)菌資源豐富,蘊(yùn)藏著許多木質(zhì)素、多糖、蛋白質(zhì)降解菌及未知功能的細(xì)菌,本研究為發(fā)酵床有機(jī)物降解及其微生物資源的利用提供了基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    墊料中層菌門
    野生樹鼩與人工飼養(yǎng)樹鼩消化道不同部位微生物組成的比較研究
    雙麥克斯韋分布下極區(qū)中層塵埃粒子帶電研究
    饑餓與重?cái)z食對河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響
    昆蟲體內(nèi)微生物多樣性的影響因素研究進(jìn)展
    妊娠期糖尿病腸道菌群變化及臨床價(jià)值分析
    雞舍墊料管理技術(shù)
    企業(yè)中層管理團(tuán)隊(duì)在運(yùn)營中的困境與作用
    肉雞養(yǎng)殖中的墊料管理
    雞場墊料的選擇及使用管理
    從組織支持談中層管理者激勵*
    亚洲国产成人一精品久久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 老鸭窝网址在线观看| 国产一区二区三区av在线| 一边亲一边摸免费视频| 我要看黄色一级片免费的| 飞空精品影院首页| 国产在线视频一区二区| 中文欧美无线码| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 91aial.com中文字幕在线观看| 日韩av免费高清视频| 咕卡用的链子| 超碰97精品在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 视频区图区小说| 久久久精品94久久精品| 曰老女人黄片| 国产日韩欧美在线精品| 国产免费福利视频在线观看| 人人妻人人澡人人看| 国产成人av激情在线播放| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 少妇被粗大猛烈的视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久精品久久久久久久性| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久久精品免费免费高清| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日韩三级伦理在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美最新免费一区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 青春草国产在线视频| 在线观看免费视频网站a站| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成年动漫av网址| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 成人国产av品久久久| 99热网站在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 久久精品国产自在天天线| 成人国产麻豆网| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲综合色惰| 青春草亚洲视频在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 一二三四在线观看免费中文在| 性色av一级| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 天堂中文最新版在线下载| 成人国产av品久久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 18+在线观看网站| 国产精品一区二区在线观看99| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久久久人妻| 国产一区二区激情短视频 | 国产淫语在线视频| 国产黄色免费在线视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 自线自在国产av| 波野结衣二区三区在线| 午夜激情久久久久久久| 女性被躁到高潮视频| 欧美在线黄色| 最新的欧美精品一区二区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 1024香蕉在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 99久久综合免费| 韩国精品一区二区三区| 永久网站在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产黄频视频在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 美女中出高潮动态图| 亚洲三级黄色毛片| 精品亚洲成a人片在线观看| 最新中文字幕久久久久| 日日撸夜夜添| 黑人猛操日本美女一级片| 国产免费视频播放在线视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 日韩一区二区视频免费看| 色94色欧美一区二区| 国产成人精品久久二区二区91 | 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 久久影院123| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲av电影在线进入| 国产淫语在线视频| av视频免费观看在线观看| 大陆偷拍与自拍| 欧美日韩一级在线毛片| 一级毛片 在线播放| av网站在线播放免费| 国产av国产精品国产| av国产精品久久久久影院| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 人妻人人澡人人爽人人| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 美女中出高潮动态图| 91精品三级在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 9191精品国产免费久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲精品视频女| 激情五月婷婷亚洲| 激情视频va一区二区三区| 高清视频免费观看一区二区| 看非洲黑人一级黄片| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲精品一区蜜桃| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产爽快片一区二区三区| 黄色配什么色好看| 高清av免费在线| 亚洲五月色婷婷综合| 久久亚洲国产成人精品v| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 两个人免费观看高清视频| 最新的欧美精品一区二区| 精品少妇久久久久久888优播| 18禁观看日本| 黑丝袜美女国产一区| 一本色道久久久久久精品综合| 超碰成人久久| 午夜福利,免费看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日本欧美国产在线视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲国产日韩一区二区| 下体分泌物呈黄色| 国精品久久久久久国模美| 一级毛片我不卡| 性色avwww在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 国产精品蜜桃在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美av亚洲av综合av国产av | 亚洲成色77777| 国产成人精品久久二区二区91 | 在线看a的网站| 亚洲国产av影院在线观看| 免费av中文字幕在线| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品一二三区在线看| 国产xxxxx性猛交| 欧美日本中文国产一区发布| 中文天堂在线官网| av网站在线播放免费| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 1024香蕉在线观看| 亚洲综合色惰| 婷婷色av中文字幕| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 午夜老司机福利剧场| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产精品偷伦视频观看了| 男男h啪啪无遮挡| 日韩视频在线欧美| 国产精品国产三级专区第一集| 啦啦啦在线免费观看视频4| av在线app专区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 黄色怎么调成土黄色| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日本爱情动作片www.在线观看| 老熟女久久久| 一级片免费观看大全| 青春草亚洲视频在线观看| 自线自在国产av| 亚洲精品aⅴ在线观看| av天堂久久9| 18禁观看日本| 超色免费av| 午夜福利视频精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 色吧在线观看| 亚洲精品第二区| 岛国毛片在线播放| 国产精品欧美亚洲77777| 成人二区视频| 欧美xxⅹ黑人| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产一区二区在线观看av| a 毛片基地| 国产在线视频一区二区| 亚洲内射少妇av| 国产精品久久久久久精品古装| 90打野战视频偷拍视频| 欧美精品av麻豆av| 精品亚洲成a人片在线观看| 1024视频免费在线观看| 美国免费a级毛片| 国产不卡av网站在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 国产在线视频一区二区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 免费观看av网站的网址| 我的亚洲天堂| 一区二区日韩欧美中文字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产成人一区二区在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 青草久久国产| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 交换朋友夫妻互换小说| 大片免费播放器 马上看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 满18在线观看网站| 久久精品国产综合久久久| 另类亚洲欧美激情| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美 日韩 精品 国产| 交换朋友夫妻互换小说| 春色校园在线视频观看| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲欧洲日产国产| 精品国产一区二区三区四区第35| 少妇人妻 视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美最新免费一区二区三区| 精品少妇久久久久久888优播| 美女午夜性视频免费| 观看av在线不卡| 成年人午夜在线观看视频| 国产在线免费精品| 中国国产av一级| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 99久久精品国产国产毛片| 欧美+日韩+精品| 女人精品久久久久毛片| 男人舔女人的私密视频| 日本av免费视频播放| 99久国产av精品国产电影| 99re6热这里在线精品视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品福利永久在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 蜜桃在线观看..| 久久久久视频综合| 国产在线一区二区三区精| 欧美日韩视频精品一区| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲人成77777在线视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 在线观看一区二区三区激情| av免费观看日本| 亚洲av免费高清在线观看| 女人久久www免费人成看片| 欧美国产精品一级二级三级| 久久婷婷青草| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 成人二区视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲国产色片| 黄频高清免费视频| 美国免费a级毛片| 亚洲在久久综合| 777米奇影视久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产精品一区二区在线不卡| 在线观看免费视频网站a站| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 亚洲精品一二三| 爱豆传媒免费全集在线观看| 丁香六月天网| 亚洲美女视频黄频| 亚洲图色成人| 免费在线观看黄色视频的| 水蜜桃什么品种好| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产高清国产精品国产三级| 成年女人在线观看亚洲视频| 久久久久视频综合| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产极品天堂在线| av女优亚洲男人天堂| 国产精品一区二区在线观看99| 国产一区二区 视频在线| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲天堂av无毛| 最近2019中文字幕mv第一页| 永久免费av网站大全| 午夜福利视频精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日韩av免费高清视频| 日本91视频免费播放| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 香蕉精品网在线| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美国产精品va在线观看不卡| 免费高清在线观看日韩| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲中文av在线| 国产精品女同一区二区软件| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久热在线av| 亚洲视频免费观看视频| 有码 亚洲区| tube8黄色片| 亚洲av男天堂| 丝瓜视频免费看黄片| 超色免费av| 亚洲五月色婷婷综合| 精品福利永久在线观看| a级毛片黄视频| 国产熟女欧美一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 在线天堂中文资源库| 国产精品女同一区二区软件| 高清视频免费观看一区二区| 成人漫画全彩无遮挡| 国产免费又黄又爽又色| 中文字幕色久视频| 少妇精品久久久久久久| 精品午夜福利在线看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成人影院久久| 久久av网站| 精品一区在线观看国产| 久久毛片免费看一区二区三区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 91成人精品电影| 少妇人妻 视频| 亚洲图色成人| av免费在线看不卡| 国产乱人偷精品视频| 一区二区av电影网| 亚洲少妇的诱惑av| 精品久久久久久电影网| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲伊人久久精品综合| 97在线人人人人妻| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲国产成人一精品久久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 免费看av在线观看网站| 五月伊人婷婷丁香| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 夫妻性生交免费视频一级片| 一本久久精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 午夜福利影视在线免费观看| 中文字幕人妻丝袜制服| av女优亚洲男人天堂| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 一级毛片电影观看| 成年动漫av网址| 国产激情久久老熟女| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产人伦9x9x在线观看 | 日韩中字成人| 性色avwww在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 精品一区二区三卡| 欧美日韩成人在线一区二区| 丝袜美足系列| 色94色欧美一区二区| 亚洲国产欧美网| 波野结衣二区三区在线| 一级毛片我不卡| 人体艺术视频欧美日本| 99久久精品国产国产毛片| 欧美激情高清一区二区三区 | 秋霞在线观看毛片| 大香蕉久久成人网| 国产一级毛片在线| 婷婷色综合大香蕉| 韩国精品一区二区三区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 考比视频在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美激情 高清一区二区三区| 中国国产av一级| 亚洲,欧美精品.| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久久久国产网址| 国产成人a∨麻豆精品| 九草在线视频观看| 91精品国产国语对白视频| 女性生殖器流出的白浆| 久久精品国产综合久久久| 久久久久久久久久人人人人人人| 婷婷色综合www| 精品国产露脸久久av麻豆| 最近手机中文字幕大全| 国产成人精品无人区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 高清不卡的av网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 我要看黄色一级片免费的| 免费观看在线日韩| av电影中文网址| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美成人午夜精品| 最新中文字幕久久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 在线观看三级黄色| 亚洲精华国产精华液的使用体验| xxxhd国产人妻xxx| 在线天堂最新版资源| 亚洲精品国产av成人精品| 成年美女黄网站色视频大全免费| a级毛片黄视频| 久久免费观看电影| 在线观看www视频免费| 免费在线观看黄色视频的| 午夜福利视频在线观看免费| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 咕卡用的链子| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美日韩精品网址| 亚洲精品,欧美精品| 黄色 视频免费看| 视频区图区小说| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产男女内射视频| 欧美+日韩+精品| 久久精品国产综合久久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一级a爱视频在线免费观看| 最新的欧美精品一区二区| 如何舔出高潮| 成人国语在线视频| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲,一卡二卡三卡| 最近中文字幕2019免费版| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品成人在线| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精品人妻久久久影院| 久久久欧美国产精品| 久久 成人 亚洲| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产黄色视频一区二区在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 性少妇av在线| 午夜福利一区二区在线看| 久久久久久久精品精品| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 免费黄色在线免费观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久国产欧美日韩av| www.熟女人妻精品国产| 久久鲁丝午夜福利片| 最近手机中文字幕大全| 只有这里有精品99| 日日啪夜夜爽| 国产精品一区二区在线不卡| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日本av免费视频播放| 午夜福利视频在线观看免费| 国产精品一区二区在线不卡| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美日韩精品网址| 看非洲黑人一级黄片| 欧美97在线视频| 久久影院123| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产黄色视频一区二区在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 一区二区三区四区激情视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 九色亚洲精品在线播放| 久久久久精品久久久久真实原创| 青春草视频在线免费观看| 看免费av毛片| 国产成人精品久久久久久| 激情视频va一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 国产午夜精品一二区理论片| 精品国产国语对白av| 久久免费观看电影| 国产爽快片一区二区三区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲男人天堂网一区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产精品 国内视频| 亚洲精品国产av蜜桃| av网站在线播放免费| 看免费成人av毛片| 亚洲四区av| 18在线观看网站| 国产乱人偷精品视频| 激情五月婷婷亚洲| 波野结衣二区三区在线| 少妇 在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| h视频一区二区三区| 美女福利国产在线| 天天操日日干夜夜撸| 久久久久久人人人人人| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美激情极品国产一区二区三区| 男人爽女人下面视频在线观看| 18在线观看网站| 97在线人人人人妻| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费观看在线日韩| 成人二区视频| 国产男人的电影天堂91| 五月开心婷婷网| 欧美精品亚洲一区二区| 日本vs欧美在线观看视频| 蜜桃在线观看..| 午夜91福利影院| 久久99蜜桃精品久久| 波多野结衣av一区二区av| 国产精品女同一区二区软件| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一区二区三区激情视频| 少妇的丰满在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产精品久久久久成人av| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久久久人妻精品一区果冻| 老司机影院毛片| 国产精品国产三级国产专区5o| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品久久久久久av不卡| 久久免费观看电影| 伊人久久国产一区二区| 精品第一国产精品| 欧美激情高清一区二区三区 | 捣出白浆h1v1| 国产精品久久久久成人av| 国产一区二区三区av在线| 男人添女人高潮全过程视频| 99久久综合免费| 亚洲av国产av综合av卡| 伊人久久国产一区二区| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精品aⅴ在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品免费大片| 夫妻性生交免费视频一级片| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲成国产人片在线观看| 免费在线观看完整版高清| 一本久久精品| 亚洲天堂av无毛| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 国产毛片在线视频| 老司机影院成人| 久久精品国产自在天天线| 少妇被粗大的猛进出69影院| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 777久久人妻少妇嫩草av网站| 又大又黄又爽视频免费| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 91精品伊人久久大香线蕉| 日韩一本色道免费dvd| 精品亚洲成国产av| 91在线精品国自产拍蜜月| 成人毛片a级毛片在线播放|