117份小麥種質(zhì)中5個矮稈基因的分子檢測

陳向東，吳曉軍，胡喜貴，李 淦，姜小苓 ，李笑慧，李小利，胡鐵柱，茹振鋼

(河南科技學(xué)院小麥中心/河南省雜交小麥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

0 引 言

【研究意義】自20世紀(jì)60年代以來，以矮稈品種推廣和配套栽培方式提高了主要農(nóng)作物的產(chǎn)量[1]。小麥矮稈種質(zhì)資源是育成小麥矮稈品種的材料基礎(chǔ)，分析小麥種質(zhì)中矮稈基因分布情況，發(fā)掘和鑒定新的優(yōu)良矮稈基因，創(chuàng)制新種質(zhì)，對提高小麥育種水平具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已命名并統(tǒng)一編號的普通小麥Rht矮稈基因有24個。這些矮稈基因中9個來源于自然變異，13個來源于物理化學(xué)誘變[2-5]。其中，在我國小麥育種中應(yīng)用最廣泛的有來源于日本農(nóng)林10號的Rht-B1b(Rht1)、Rht-D1b(Rht2)和日本赤小麥的Rht8、Rht9。另外，來自中國西藏地方品種大拇指矮的Rht-B1c(Rht3)和西安市農(nóng)科所從“矮稈早”中選出的天然突變系矮變1號的Rht-D1c(Rht10)也有一定的育種應(yīng)用。Rht基因一般是多效基因，不僅能夠降低小麥植株高度，而且有些還能影響產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀。Rht-B1b、Rht-D1b基因能夠顯著降低植株高度，當(dāng)兩者同時存在時，降稈效應(yīng)還能夠累加[6-7]。另外，兩者對提高小麥產(chǎn)量具有促進(jìn)作用[8-9]。一方面表現(xiàn)為直接效應(yīng)：Rht-B1b能夠提高單株的分蘗成穗率、單株粒數(shù)、單株粒重等，Rht-D1b能夠提高分蘗成穗率、穗粒數(shù)、經(jīng)濟(jì)系數(shù)等；一方面表現(xiàn)為間接效應(yīng)：Rht-B1b能夠增加旗葉和倒二葉面積，增強(qiáng)莖稈強(qiáng)度，Rht-D1b抗倒能力突出，補(bǔ)償了生物產(chǎn)量降低對產(chǎn)量的負(fù)面影響。Rht-B1c和Rht-D1c對產(chǎn)量具有負(fù)效作用，如生物產(chǎn)量降低、生長發(fā)育緩慢、易受干熱風(fēng)影響和易早衰等[10-11]。Rht4、Rht5、Rht6 和Rht7 在降低植株高度的同時會大大降低糧食產(chǎn)量。Rht8對結(jié)實(shí)率、籽粒產(chǎn)量和地上部生物產(chǎn)量均有顯著的正向作用，能夠明顯縮短生育期，對不良環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，但品質(zhì)性狀表現(xiàn)較差[12]。Rht9在降低植株高度的同時會增加分蘗數(shù)，穗變短，但最終增加糧食產(chǎn)量[13]。Rht13是對 GA3敏感的矮稈基因，可以降低株高而不影響胚芽鞘長度和幼苗生長勢，同時可以增加穗粒數(shù)，在小麥遺傳改良中頗具應(yīng)用潛力[14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，小麥矮稈基因的分子標(biāo)記研究取得了很大進(jìn)展。1999年P(guān)eng等克隆出Rht-B1b和Rht-D1b的同源基因。2002年Ellis等設(shè)計(jì)出能夠?qū)ht-B1b和Rht-B1a及Rht-D1b和Rht-D1a等位基因精確檢測的STS引物。2005年Ellis等對Rht4、Rht5、Rht8、Rht9、Rht12和Rht13等矮稈基因進(jìn)行精細(xì)定位，開發(fā)了緊密連鎖的分子標(biāo)記。Korzun等和Worland等1998年發(fā)現(xiàn)利用SSR引物Xgwm261擴(kuò)增得到的特異片段可以檢測Rht8基因的有無。這些緊密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)對小麥育種中矮稈基因的利用起到了促進(jìn)作用。近年來一些學(xué)者對部分國外、國內(nèi)品種及種質(zhì)資源進(jìn)行了矮稈基因分子檢測，但選擇的分子標(biāo)記多集中于Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8，對其它矮稈基因發(fā)掘和利用較少[15-19]。研究我國小麥主產(chǎn)區(qū)部分小麥品種中矮稈基因的分布。【擬解決的關(guān)鍵問題】以我國小麥主產(chǎn)區(qū)117份小麥品種及種質(zhì)為材料，利用矮稈基因分子標(biāo)記進(jìn)行檢測，分析矮稈基因的分布特點(diǎn)和發(fā)掘攜帶特定矮稈基因的新種質(zhì)，為小麥育種提供技術(shù)支撐和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

117份供試材料均由河南科技學(xué)院小麥中心提供，包含國內(nèi)推廣品種及中間品系等。其中，小偃22攜帶Rht-B1b和Rht8基因，鄭9023攜帶Rht-D1b基因，揚(yáng)麥18含Rht8基因，中國春不含任何矮稈基因。

檢測Rht-B1a基因(野生型)所用的引物對為BF-WR1，可以擴(kuò)增出一條長237 bp的條帶，檢測Rht-B1b基因(突變型，具有致矮作用)所用的引物對為BF-MR1，也同樣可以擴(kuò)增出一條長237 bp的條帶。使用兩個引物對檢測同一個材料，擴(kuò)增條帶的有無，是互補(bǔ)出現(xiàn)的。試驗(yàn)以昝凱等報(bào)道的小偃22攜帶Rht-B1b和Rht8基因[19]作為對照。試驗(yàn)中檢測Rht-D1a和Rht-D1b基因所用引物對分別是DF2-WR2和DF-MR2，兩者分別可以擴(kuò)增出264 bp和254 bp的條帶，兩個引物對擴(kuò)增條帶的有無也是互補(bǔ)出現(xiàn)的。試驗(yàn)以王玉葉報(bào)道的鄭9023攜帶Rht-D1b基因[20]為對照。

試驗(yàn)中檢測Rht8基因所用引物為Xgwm261，擴(kuò)增片段長度為192 bp。試驗(yàn)以王玉葉[20]報(bào)道的揚(yáng)麥18攜帶Rht-D1b基因?yàn)閷φ铡?/p>

1.2 方 法

1.2.1 田間株高調(diào)查

117份小麥材料連續(xù)多年種植于河南科技學(xué)院輝縣試驗(yàn)田，每個材料種植2行，行距20 cm，株距10 cm，采用常規(guī)大田管理。在小麥成熟期測量株高，每個材料隨機(jī)測5株。

1.2.2 DNA提取

將每個材料5株小麥苗期葉片混合，采用CTAB法提取小麥基因組DNA，利用微量分光光度計(jì)測量DNA質(zhì)量和濃度，并將DNA原液稀釋成50 ng/μL工作液，放至4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增

所用矮稈基因檢測引物均由上海Invitrogen英俊生物技術(shù)有限公司合成，引物序列、退火溫度、擴(kuò)增片段長度等。表1

PCR反應(yīng)體系：20 μL體系，包含2×TaqMaster Mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)10 μL，10 μmol/L正反向引物各0.8 μL，50 ng/μL的模板DNA 1 μL，ddH2O 7.4 μL。使用ABI Gene Amp PCR System 9700型PCR儀，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性 5 min；94℃變性30s，55～63℃退火30s，72℃延伸50s，35循環(huán)；72℃延伸5 min。Rht-B1a、Rht-B1b、Rht-D1a和Rht-D1b用1.2%的瓊脂糖(含goldview染料)進(jìn)行電泳檢測，Rht8、Rht9、Rht13用2%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，再用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照保存。

表1 所用的矮稈基因分子標(biāo)記
Table 1 Molecular markers of dwarf genes used in this study

基因位點(diǎn)Gene loci標(biāo)記Markers引物序列(5′-3′)Primer Sequence退火溫度Tm片段長度Production lengthRht-B1aBFGGTAGGGAGGCGAGAGGCGAGWR1CATCCCCATGGCCATCTCGAGCTG63℃237 bpRht-B1bBFGGTAGGGAGGCGAGAGGCGAGMR1CATCCCCATGGCCATCTCGAGCTA63℃237 bpRht-D1aDF2GGCAAGCAAAAGCTTCGCGWR2GGCCATCTCGAGCTGCAC63℃264 bpRht-D1bDFCGCGCAATTATTGGCCAGAGATAGMR2CCCCATGGCCATCTCGAGCTGCTA63℃254 bpRht8Xgwm261-FCTCCCTGTACGCCTAAGGCXgwm261-RCTCGCGCTACTAGCCATTG55℃192 bpRht9BARC151-FTGAGGAAAATGTCTCTATAGCATCCBARC151-RCGCATAAACACCTTCGCTCTTCCACTC55℃220 bpRht13WMS577-FATGGCATAATTTGGTGAAATTGWMS577-RTGTTTCAAGCCCAACTTCTATT55℃130 bp

2 結(jié)果與分析

2.1 矮稈基因Rht-B1b檢測

研究表明，117份材料中，56份材料攜帶Rht-B1b基因，占47.9%，平均株高為87.3 cm，變異范圍為52～110 cm。只考慮在我國育種應(yīng)用最廣的Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8三種矮稈基因，在117份材料中，有Rht-B1b基因而無Rht-D1b和Rht8基因的材料有21份，平均株高88.1 cm，變異范圍63～105 cm。表2,圖1

圖1 部分材料Rht-B1b基因檢測結(jié)果
Fig.1 Detection results ofRht-B1bgene

表2Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8三種矮稈基因及其組合株高
Table 2 Plant height traits ofRht-B1b,Rht-D1bandRht-8 dwarf genes

基因組成Genes材料(份)Cutivars(lines)平均株高(cm)Plant height變異范圍(cm)Variation rangeRht-B1b2188.163～105Rht-D1b882.565～100Rht81889.275～117Rht-B1b、Rht-D1b485.576～100Rht-B1b、Rht81690.774～110Rht-D1b、Rht81984.174～115Rht-B1b、Rht-D1b、Rht81583.274～98

2.2 矮稈基因Rht-D1b檢測

研究表明，117份材料中，46份材料攜帶Rht-D1b基因，占39.3%，平均株高為83.7 cm，變異范圍為52～115 cm。如只考慮Rht-D1b、Rht-D1b和Rht8三種矮稈基因，在117份材料中，有Rht-D1b基因而無Rht-B1b和Rht8基因的材料有8份，平均株高82.5 cm，變異范圍65～100 cm。表2，圖2

圖2 部分材料Rht-D1b基因檢測
Fig.2 Detection results ofRht-D1bgene

2.3 矮稈基因Rht8的檢測結(jié)果

研究表明，117份材料中，68份材料攜帶Rht8基因，占58.1%，平均株高為86.8 cm，變異范圍為52～115 cm。只考慮Rht-D1b、Rht-D1b和Rht8三種矮稈基因，在117份材料中，有Rht8基因而無Rht-B1b和Rht-D1b基因的材料有18份，平均株高89.2 cm，變異范圍75～117 cm。表2,圖3

圖3 部分材料Rht8基因檢測
Fig.3 Detection results ofRht8 gene

2.4 矮稈基因Rht-D1b、Rht-D1b和Rht8的多組合檢測

一些小麥品種中Rht-D1b、Rht-D1b和Rht8三種矮稈基因組合出現(xiàn)，117份材料中，同時攜帶Rht-B1b、Rht-D1b基因的材料有4份，占3.4%，平均株高為85.5 cm，變異范圍為76～100 cm；同時攜帶Rht-B1b、Rht8基因的材料有16份，占13.7%，平均株高為90.7 cm，變異范圍為74～110 cm；同時攜帶Rht-D1b、Rht8基因的材料有19份，占16.2%，平均株高為84.1 cm，變異范圍為74～115 cm；同時攜帶Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因的材料有15份，占12.8%，平均株高為83.2 cm，變異范圍為74～98 cm。表2

2.5 矮稈基因Rht9和Rht13的檢測

試驗(yàn)中檢測Rht9基因所用引物對為BARC151-F和BARC151-R，擴(kuò)增片段長度為220 bp。研究表明,117份材料中，18份材料攜帶Rht9基因，占15.4%，平均株高為92.6 cm，變異范圍為65～117 cm。檢測Rht13基因所用引物對為WMS577-F和WMS577-R，擴(kuò)增片段長度為130 bp。117份材料中，14份材料攜帶Rht13基因，占12.0%，平均株高為93.4 cm，變異范圍為82～117 cm。圖4～5,表3

圖4 部分材料Rht9基因檢測
Fig.4 Detection results ofRht9 gene

圖5 部分材料Rht13基因檢測
Fig.5 Detection results ofRht13 gene

2.6 117份小麥種質(zhì)的矮稈基因分布頻率分析

研究表明，Rht-B1b、Rht-D1b、Rht8、Rht9和Rht13矮稈基因在不同小麥種質(zhì)中的分布頻率不同，基因組合方式也不一樣。只含單個矮稈基因的分布頻率高低依次為：Rht-B1b(12，10.3%)>Rht8(13，11.1%)>Rht-D1b(5，4.3%)>Rht13(1，0.9%)>Rht9(0，0.0%)。117份種質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)Rht9基因單獨(dú)攜帶的情況，而以基因組合形式出現(xiàn)的有18份種質(zhì)；單獨(dú)攜帶Rht13基因的情況也較少，只有1份種質(zhì)，以基因組合形式出現(xiàn)的有14份種質(zhì)。5個矮稈基因以同時攜帶2個基因的組合形式出現(xiàn)，占到37.8%，分布頻率高低依次為：Rht-D1b、Rht8(15，12.8%)>Rht-B1b、Rht8(12，10.3%)>Rht-B1b、Rht9(5，4.3%)>Rht-B1b、Rht-D1b(3，2.6%)=Rht8、Rht13(3，2.6%)>Rht-B1b、Rht13(2，1.7%)=Rht-D1b、Rht9(2，1.7%)>Rht-D1b、Rht13(1，0.9%)=Rht8、Rht9(1，0.9%)>Rht9、Rht13(0，0)。5個矮稈基因以同時攜帶3個基因及以上的組合形式出現(xiàn)，分布頻率為21.4%；其中以同時攜帶Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因種質(zhì)最多，占到12.8%。另外，5種矮稈基因均不攜帶的種質(zhì)有15份，占到12.8%。表3

表3 我國小麥主產(chǎn)區(qū)117份種質(zhì)的矮稈基因類型及株高
Table 3 Dwarf gene types and plant height of 117 germplasms from main wheat production areas in China

材料名稱Cutivars(lines)來源SourceRht-B1bRht- D1bRht8Rht9Rht13株高Plant height材料名稱Cutivars(lines)來源SourceRht-B1bRht- D1bRht8Rht9Rht13株高Plant height渦9703安徽--+-+95中育1401河南-++--77皖麥19安徽-+++-92中育1439河南+++--80農(nóng)大189選北京----+110抗白781河南--+--86普冰201北京+--+-77豫展10號河南--+--75夏河銀白甘肅+----105花培1號河南-----82中植1號甘肅--+++11702中46河南-----79定8654甘肅+-++-10604中35河南-----80華糯1號廣東++---100溫8春河南-----90豐優(yōu)7號貴州+----100濰麥9號河南-----82黔0205貴州+----75鶴034河南--++-105藁2018河北-+--+83百農(nóng)金優(yōu)32河南--+--90藁優(yōu)9618河北+----72周麥26河南--+--84師灤02-1河北++--+87鄭麥379河南--+--81冀糯200河北+-+--91BNS-T1河南+++--52高碑店-1河北+-+--89襄麥29湖北+---+83藁優(yōu)503河北+-+--95襄麥55湖北+----100高區(qū)乙6號河北+++--90漢北麥湖北-+++-87邯7050河北-----93小冰麥33吉林-----105河農(nóng)604河北-----95生選4號江蘇+-+-+97邢1387河北-----98生選5號江蘇--+--82冀2003河北+--+-93南農(nóng)04Y10江蘇+-+++103內(nèi)麥9號河南++---79揚(yáng)麥6號江蘇-----85鄭9023河南-+---86揚(yáng)糯麥1號江蘇+--++90鄭農(nóng)7號河南-++--87揚(yáng)麥18江蘇--+--84鄭95515河南+----76徐麥31 江蘇+-++-82花培5號河南--+-+85白麥2577內(nèi)蒙古+----98豫農(nóng)6072河南+-+--74蒙阿石-1內(nèi)蒙古-+-+-100周麥11河南+-+--85寧春38寧夏+--+-92周麥16河南-++--80山農(nóng)優(yōu)麥3號山東+----99豐德存1號河南+++--80煙農(nóng)19山東+++--8304中36河南+-+--83濟(jì)麥26山東+++-+92中育885河南+++--85濟(jì)麥27山東+++--87中育1107河南-++--75濰麥7號山東+++--87中育9302河南+++--79優(yōu)麥2號山東-++--115

續(xù)表3 我國小麥主產(chǎn)區(qū)117份種質(zhì)的矮稈基因類型及株高
Table 3 Dwarf gene types and plant height of 117 germplasms from main wheat production areas in China

材料名稱Cutivars(lines)來源SourceRht-B1bRht- D1bRht8Rht9Rht13株高Plant height材料名稱Cutivars(lines)來源SourceRht-B1bRht- D1bRht8Rht9Rht13株高Plant height中育9307河南+----76優(yōu)麥3號山東+++--9605中27河南-+---90泰山149山東--+--100溫麥6號河南-++--79濰麥8號山東-----85矮早781河南+-+--85太原新冬山西--+--103偃師4110河南-++--88臨汾138山西+--++85天民矮早八A系河南-+++-74陜農(nóng)981陜西+++--98蘭考198河南-++--75武功122-1-1陜西+----87漯麥16河南-----82小偃22-10純系陜西+-+--95內(nèi)鄉(xiāng)188河南+++--81抗赤6號陜西+---+98洛麥23河南-++--79矮稈962早陜西+++--84洛麥29河南--+--92陜麥94-1-44陜西-++--75泛麥803河南+++--74B91043陜西+--+-89駐麥6號A河南-----81陜808陜西-+---86濟(jì)創(chuàng)28號河南++---76川育55871四川-----100內(nèi)鄉(xiāng)201河南-+-+-65川麥107四川-++--100科育818河南-+---95川農(nóng)19四川--+--80洑麥053河南-++--75川育40755四川--+--83中原008河南-++--75綿陽2000-13四川+-+--84新麥208河南-++--80川農(nóng)21四川+----86新麥18河南-++--80川農(nóng)23四川--+-+82平原50河南+-+--110新春9號新疆+--+-105百農(nóng)矮抗58河南+-+--74云麥53云南+-+--98百農(nóng)160河南+----63云南麥云南-+++-105荔矮4330-1河南-+---55中國春四川-----121中育1311河南--+--82

3 討 論

矮稈基因的利用有利于提高小麥的抗倒性和進(jìn)一步挖掘其產(chǎn)量潛力。由于矮稈基因隱性類型的較多，在小麥育種中早代并不宜選擇，而結(jié)合分子標(biāo)記檢測，可以明確矮稈基因的有無及類型，最終加快育種進(jìn)程。

各矮稈基因的降稈能力各不相同，研究表明,攜帶Rht-B1b植株的降稈幅度達(dá)到24%，與分別攜帶Rht-D1b、Rht9、Rht13植株的降稈能力差異不大，而Rht-B1b與Rht-D1b組合會產(chǎn)生累加作用，降稈幅度能達(dá)到60%；攜帶Rht8的植株相對于它的高稈品種降稈11%左右，屬于弱降稈基因[21]。研究對國內(nèi)小麥主產(chǎn)區(qū)的117份種質(zhì)進(jìn)行了矮稈基因分子檢測，結(jié)果表明，5個矮稈基因的降稈效應(yīng)依次為：Rht-D1b>Rht-B1b>Rht8>Rht9>Rht13；就3種矮稈基因Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8的組合而言，其降稈效應(yīng)依次為：Rht-B1b+Rht-D1b+Rht8>Rht-D1b+Rht8>Rht-B1b+Rht-D1b>Rht-B1b+Rht8；與之前其他學(xué)者的研究結(jié)果基本一致[22-23]。而在試驗(yàn)中Rht-D1b+Rht8的降稈效應(yīng)稍大于Rht-B1b+Rht-D1b，分析原因可能是受環(huán)境條件影響和小麥種質(zhì)數(shù)量有限造成的。另外，對矮稈基因與株高進(jìn)行t測驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rht-D1b與株高呈極顯著正相關(guān)，Rht9和Rht13與株高呈極顯著負(fù)相關(guān)，而在研究中Rht9與Rht13基本上都是與其他矮稈基因以組合的形式出現(xiàn)，由此原因可能是Rht9與Rht13與其他矮稈基因的組合產(chǎn)生了負(fù)向累加作用。

大多數(shù)矮稈基因具有一定的降稈作用，能夠提高抗倒伏和具有較高的肥水反應(yīng)，但是存在一些缺陷，如矮稈基因與不利基因連鎖，影響小麥的抗病性、抗逆性、產(chǎn)量，熟期等；部分矮稈基因在農(nóng)藝性狀上表現(xiàn)較差，利用價值有限。目前，生產(chǎn)上利用的品種，其攜帶矮稈基因多集中于Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因等少數(shù)類型，遺傳基礎(chǔ)狹窄，因此,尋找新的有應(yīng)用潛力的矮稈基因十分必要。矮稈基因Rht13是一個部分隱性基因，對赤霉素GA3敏感，其主要通過縮短小麥莖節(jié)長度而降低株高，增加小麥產(chǎn)量；與Rht-D1b相比，不影響胚芽鞘的長度和幼苗生長活力，具有較大育種應(yīng)用價值[24]。

4 結(jié) 論

研究對國內(nèi)小麥主產(chǎn)區(qū)的部分品種進(jìn)行了5個矮稈基因分子標(biāo)記檢測，明確了這些品種所攜帶的矮稈基因。117份種質(zhì)材料中，矮稈基因分布頻率依次為Rht8(68份，58.1%)>Rht-B1b(56份，47.9%)>Rht-D1b(46份，39.3%)>Rht9(18份，15.4%)>Rht13(14份，12.0%)。部分種質(zhì)中同時攜帶2個矮稈基因的組合占到37.8%；同時攜帶3個及以上基因的組合占到21.4%，其中以同時攜帶Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因種質(zhì)最多，占到12.8%。5種矮稈基因均不攜帶的種質(zhì)有15份，占到12.8%。鑒定出14份攜帶Rht13矮稈基因的新種質(zhì)。