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    補(bǔ)腎中藥對(duì)老化間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境改變及其分化方向調(diào)控的影響

    2019-10-16 12:48:22劉幸明趙永杰蔡俊笙王翰宇梁志強(qiáng)程志安
    中成藥 2019年9期
    關(guān)鍵詞:成脂充質(zhì)成骨

    劉幸明, 趙永杰, 蔡俊笙, 王翰宇, 梁志強(qiáng), 程志安*

    (1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東廣州510405;2.河南省許昌市立醫(yī)院,河南許昌461000;3.廣東省中醫(yī)院,廣東 廣州510120)

    老化可使機(jī)體整體內(nèi)環(huán)境發(fā)生巨大改變,也使骨髓內(nèi)微環(huán)境與復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)、外信號(hào)調(diào)控發(fā)生改變。衰老大鼠的氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致年齡相關(guān)性骨丟失的重要致病機(jī)制[1],老化使間充質(zhì)干細(xì)胞更趨向于分化為脂肪細(xì)胞,而不是成骨細(xì)胞,骨量持續(xù)性減少和丟失,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生[2]。既往研究[3-4]表明,補(bǔ)腎中藥能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化、提高抗氧化能力抑制成脂分化,但它能否通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境起到同樣的作用尚不明確,故本實(shí)驗(yàn)為此進(jìn)行了研究。

    1 材料

    金匱腎氣丸、健骨二仙丸、六味地黃丸來(lái)源于廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部(金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、牡丹皮、桂枝、附子按8 ∶4 ∶4 ∶4 ∶3 ∶3 ∶1 ∶1 比例組成,健骨二仙丸由龜板、鹿角膠、黨參、枸杞子、續(xù)斷、山藥按1 ∶1 ∶3 ∶6 ∶6 ∶6 比例組成;六味地黃丸由熟地黃、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、牡丹皮按8 ∶4 ∶4 ∶4 ∶3 ∶3 比例組成)。清潔級(jí)健康SD 成年大鼠40 只,體質(zhì)量(200±50) g,63~70 d,雌雄各半,購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵) 2013-0002。胎牛血清(貨號(hào)SH30087.01)、DMEM-F12 培養(yǎng)基(貨 號(hào) SH30023.01B)、 DMEM-高 糖 培 養(yǎng) 基 (貨 號(hào)SH30022.01B)、青鏈霉素(貨號(hào)SH30010)、磷酸鉀緩沖液(貨號(hào)SH30256.01B) (美國(guó)Hyclone 公司);cellTiter 96 AQ 單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑(貨號(hào)G3582,美國(guó)Promega公司);成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(StemPro?Adipogenesis Differentiation Kit, 美 國(guó)Gibco 公 司, 貨 號(hào)A10070-01)。潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,型號(hào)SW-CJ-IFD);低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司,型號(hào)SC3614);倒置光學(xué)顯微鏡(型號(hào)CKX41、U-CTR30-2,日本Olympus 公司);細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific 公司,型號(hào)HERAcell150i);倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica 公司,型號(hào)DMI6000B)。

    2 方法

    2.1 含藥血清制備 金匱腎氣丸、健骨二仙丸、六味地黃丸濃煎后,分別按照89.1、75.9、85.8 g/kg 劑量灌胃給藥,每天2 次,連續(xù)7 d,最后1 d 灌胃給藥后2 h 再次給藥。第2 次給藥后1 h,大鼠腹主動(dòng)脈取血,離心,取上清,除菌,滅活,分裝,-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)前期實(shí)驗(yàn)篩選出的10%含藥血清[3],將其隨機(jī)分為空白組、模型組、健骨二仙丸組、六味地黃丸組、金匱腎氣丸組。

    2.2 模型建立[5]及鑒定 10 只大鼠沖出骨髓細(xì)胞培養(yǎng),每3 d 換液1 次,培養(yǎng)7 d,300 μmol/L H2O2處理24 h。然后,通過(guò)β-半乳糖苷酶染色鑒定,方法為固定15 min,洗滌,染色12 h,顯微鏡下觀察。

    2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用MTS 法。收集0、48 h 細(xì)胞,加入cellTiter 96 AQ 單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑4 h 后酶標(biāo)儀讀板,讀取490 nm 波長(zhǎng)處OD 值,計(jì)算增殖率,公式為增殖率= (48 h 平均OD 值/0 h 平均OD 值-1) ×100% (同一樣品)。

    2.4 成骨誘導(dǎo)、茜素紅染色及ALP 活性檢測(cè) 當(dāng)各組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到80%融合時(shí)成骨誘導(dǎo),培養(yǎng)3 d 后再維持7 d,觀察細(xì)胞形態(tài),檢測(cè)ALP 活性,具體檢測(cè)步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。繼續(xù)培養(yǎng)至14 d 后,茜素紅染色鑒定成骨細(xì)胞。

    2.5 成脂誘導(dǎo)及油紅O 染色 成脂誘導(dǎo)方法同“2.4” 項(xiàng)下成骨誘導(dǎo)。培養(yǎng)7 d 后,油紅O 染色鑒定脂肪細(xì)胞。

    2.6 相關(guān)因子檢測(cè) 經(jīng)典TRIzol 提取總RNA,檢測(cè)濃度、提純、逆轉(zhuǎn)錄,rRT-qPCR 采用一步法,按照說(shuō)明書進(jìn)行操作,2-△△Ct法分析各基因表達(dá)差異。然后,應(yīng)用Invitrogen在線引物設(shè)計(jì)軟件OligoPer-fectTM Designer 設(shè)計(jì), 采用BLAST 進(jìn)行比對(duì),探針序列由美國(guó)Invitrogen 公司合成,根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)序列設(shè)計(jì)(CollagenΙ ID 100199754,Runx2 ID 12393,DLX5 ID 13395,OSX ID 170574,OCN ID 632,PPARγ2 ID 19016,C/EBPβ ID 12608,TAZ ID 66826),引物序列見表1。

    表1 引物序列

    2.7 TAZ 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。裂解→收集→調(diào)整濃度→煮沸→冷卻→電泳→轉(zhuǎn)膜→TAZ 一抗→37 ℃孵育2 h→洗膜→二抗→洗膜→轉(zhuǎn)膜→顯影。

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以表示,組間比較采用方差分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 氧化模型及成骨、成脂效果鑒定 氧化后老化間充質(zhì)干細(xì)胞在β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率明顯增加,細(xì)胞核周圍有天藍(lán)色顆粒,補(bǔ)腎中藥處理后陽(yáng)性率明顯減少,H2O2處理后老化間充質(zhì)干細(xì)胞增殖減少,而藥物處理后增加。表2、圖1 顯示,與空白組比較,模型組扁平狀、分布稀疏的老年細(xì)胞數(shù)量明顯增加;與模型組比較,成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞均被油紅O 染為紅色,各補(bǔ)腎中藥組紅染減少,而成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞均被茜素紅染為棕褐色,各補(bǔ)腎中藥組染色增加;模型組ALP 活性顯著低于空白組(P<0.05),各補(bǔ)腎中藥組顯著高于模型組(P<0.05)。

    表2 各組對(duì)H2O2 誘導(dǎo)衰老細(xì)胞的影響

    表2 各組對(duì)H2O2 誘導(dǎo)衰老細(xì)胞的影響

    注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

    組別 細(xì)胞藥物敏感性增殖率/% ALP 活性空白組 10.38±0.82 1.98±0.02模型組 -42.22±0.84* 0.29±0.01*金匱腎氣丸組 22.54±0.85△ 0.69±0.14△健骨二仙丸組 23.75±0.36△ 0.87±0.22△六味地黃丸組 19.72±1.24△ 0.60±0.16△

    圖1 各組細(xì)胞顯微鏡圖(×100)

    3.2 成骨、成脂誘導(dǎo)因子mRNA 表達(dá) 表3 ~4 顯示,與空白 組 比 較, 模 型 組OCN、 Collagen Ⅰ、 DXL5、 OSX、RunX2、TAZ mRNA 表達(dá)顯著下調(diào) (P <0.05),PPARγ2、C/EBPβ mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,各補(bǔ)腎中藥組OCN、DXL5、OSX、RunX2、TAZ mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),PPARγ2、C/EBPβ mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。

    3.3 TAZ 蛋白表達(dá) 圖2 顯示,與空白組比較,模型組TAZ 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01);與模型組比較,各補(bǔ)腎中藥組其蛋白表達(dá)有所上調(diào),其中金匱腎氣丸組、六味地黃丸組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    表3 各組成骨誘導(dǎo)因子mRNA 表達(dá)比較

    表3 各組成骨誘導(dǎo)因子mRNA 表達(dá)比較

    注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

    組別 CollagenΙ Runx2 DLX5 OSX OCN空白組 1.00±0.21 1.00±0.08 1.00±0.10 1.00±0.06 1.00±0.17模型組 0.27±0.01* 0.13±0.01* 0.40±0.03* 0.22±0.02* 0.36±0.04*金匱腎氣丸組 0.30±0.04 0.32±0.03△ 0.90±0.02△ 0.79±0.11△ 0.53±0.05△健骨二仙丸組 0.45±0.05 0.43±0.01△ 0.52±0.11 0.55±0.01△ 0.76±0.09△六味地黃丸組 0.36±0.04 0.66±0.18△ 0.64±0.04△ 0.79±0.12△ 0.81±0.19△

    表4 各組成脂誘導(dǎo)因子mRNA 表達(dá)比較

    表4 各組成脂誘導(dǎo)因子mRNA 表達(dá)比較

    注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

    組別 PPARγ2 C/EBPβ TAZ空白組 1.00±0.06 1.00±0.09 1.00±0.30模型組 4.28±0.27* 6.39±0.56* 0.21±0.04*金匱腎氣丸組 2.60±0.32△ 4.12±0.08△ 0.68±0.08△健骨二仙丸組 3.48±0.78△ 3.96±0.91△ 0.68±0.04△六味地黃丸組 2.96±0.50△ 3.09±0.54△ 0.87±0.05△

    圖2 各組TAZ 蛋白表達(dá)

    4 討論

    機(jī)體衰老時(shí),內(nèi)環(huán)境氧化應(yīng)激水平增高,抗氧化能力降低,導(dǎo)致骨質(zhì)量下降,骨皮質(zhì)變薄,骨髓脂肪組織增多,具有多項(xiàng)分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞特性、增殖活性、端粒酶活性、端粒長(zhǎng)度、分化能力與方向隨之改變,一方面涉及老化所致的細(xì)胞自身內(nèi)在因素改變,另一方面涉及細(xì)胞外骨髓內(nèi)微環(huán)境的改變。從細(xì)胞自身來(lái)說(shuō),Runx2 為特異性成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,而OSX、Runx2 是多條信號(hào)通路的共同下游基因,可作為其下游基因啟動(dòng)成骨基因[6-8];TAZ 作為共同激活因子,可刺激Runx2 轉(zhuǎn)錄而抑制PPARγ2 轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,老化使其水平下調(diào),干細(xì)胞更趨向與脂肪分化;ALP 活性正向反映成骨細(xì)胞分化水平[9],Ⅰ型膠原是骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要有機(jī)成分,前者表達(dá)取決于后者產(chǎn)生量;OCN 在成骨晚期的表達(dá)隨著細(xì)胞分化和基質(zhì)礦化而增加,常作為礦化晚期的標(biāo)志物使用[10]。在骨鈣素、骨涎蛋白、Ⅰ型膠原的調(diào)控序列上,均存在Dlx5 的結(jié)合位點(diǎn),能促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化,增強(qiáng)Runx2 基因P1 啟動(dòng)子的活性,促進(jìn)成骨分化[11]。PPARγ2 正向調(diào)節(jié)脂肪生成,是脂肪細(xì)胞形成合成通路的中心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[6,12-13]。在分化早期,C/EBPβ 被活化后表達(dá)增加,隨后激活C/EBPα,協(xié)同PPARγ2 共同調(diào)控脂肪分化。本實(shí)驗(yàn)表明,缺少C/EBPβ的胚胎成纖維細(xì)胞脂肪生成能力明顯減低[14]。

    《素問(wèn)·陰陽(yáng)臟象大論》指出, “腎主骨生髓,精生髓、髓居其中,髓養(yǎng)骨,骨生髓,聚髓為腦”,故中醫(yī)治療骨病大多以補(bǔ)腎為主。有學(xué)者認(rèn)為,間充質(zhì)干細(xì)胞相當(dāng)于中醫(yī)的“精” “髓”[15],補(bǔ)腎中藥調(diào)節(jié)氧化衰老細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境,促進(jìn)精血津液化生,并使之轉(zhuǎn)化為能量,促進(jìn)生長(zhǎng),就骨骼生長(zhǎng)發(fā)育方面而言,主要體現(xiàn)在促進(jìn)成骨抑制成脂。課題組前期從補(bǔ)腎中藥中選擇補(bǔ)腎陰(六味地黃丸)、補(bǔ)腎陽(yáng)(金匱腎氣丸)、補(bǔ)腎填精(健骨二仙丸[16]),發(fā)現(xiàn)其含藥血清能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境來(lái)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖,增強(qiáng)細(xì)胞活性,抑制成脂促進(jìn)成骨。

    另外,補(bǔ)腎中藥可防止氧自由基過(guò)量產(chǎn)生,具有抗氧化作用[17]。氧化處理后,細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡,產(chǎn)生大量活性氧族,使p16、p21、p53 基因表達(dá)增加而引起早衰,當(dāng)有大量活性氧族在體內(nèi)聚集時(shí),可通過(guò)p53 作用使得下游靶點(diǎn)p21 抑制CDK/cyclin 復(fù)合體活性,并下調(diào)pRb/E2F軸,降低間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新及再生能力,促進(jìn)衰老,同時(shí)p53/p21 途徑還可通過(guò)與p16/pRb 途徑相互作用來(lái)共同誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)早熟性衰老[18]。本實(shí)驗(yàn)中β-半乳糖苷酶染色和ALP 活性檢測(cè)均顯示,氧化可使細(xì)胞衰老,下調(diào)OCN、DXL5、OSX、RunX2、TAZ 表達(dá),上調(diào)PPARγ2、C/EBPβ mRNA 表達(dá),促進(jìn)成脂分化抑制成骨分化;補(bǔ)腎中藥處理后,增強(qiáng)了衰老細(xì)胞活性,提升OCN、DXL5、OSX、RunX2、TAZ 表 達(dá),抑 制PPARγ2、C/EBPβ mRNA 表 達(dá),逆轉(zhuǎn)成脂分化的趨勢(shì),促進(jìn)成骨分化。

    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氧化誘導(dǎo)衰老模型,驗(yàn)證了補(bǔ)腎中藥能通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)成骨、成脂相關(guān)因子的表達(dá),同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞外微環(huán)境促進(jìn)精血津液化生,從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、成骨分化。但本實(shí)驗(yàn)僅停留在大分子階段,對(duì)于更小分子(如miRNA 等) 的影響還需進(jìn)一步探究。

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