UPLC-ESI-MS／MS 法同時(shí)測(cè)定胡黃連中4 種環(huán)烯醚萜

王知斌， 李 凱， 高 巖， 孫延平， 孟永海， 楊炳友， 匡海學(xué)

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江中藥天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150040）

胡黃連為玄參科植物胡黃連Picrorrhiza scrophularaeflora Pennell 的干燥根莖，發(fā)現(xiàn)于西藏東南部和云南西北部海拔4 400 m 以上的地區(qū)，味苦性寒，歸肝、胃、大腸經(jīng)，具有退虛熱、除疳熱、清濕熱等功效［1-2］。胡黃連中主要含有環(huán)烯醚萜類、酚苷類、苯乙醇苷類，環(huán)烯醚萜類為其主要活性和特征性成分［3］，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，胡黃連具有保肝、抗炎、抗哮喘、神經(jīng)保護(hù)、免疫活性、降血糖等活性，在臨床上應(yīng)用廣泛［4-9］。2015 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定了胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ的總含有量不得低于9%［10］，并未對(duì)其他成分做出要求。在使用HPLC 分析胡黃連中環(huán)烯醚萜類成分含有量的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅲ的出峰時(shí)間一致二者未分離。而液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力和MS 的高選擇性、高靈敏度能有效的將二者分離。目前有關(guān)胡黃連苷Ⅰ或胡黃連苷Ⅱ單一成分含有量測(cè)定的報(bào)道較多［11-12］，但關(guān)于胡黃連苷Ⅲ、獐牙菜苷的研究未見報(bào)道［13］。因此本研究建立UPLC-ESI-MS／MS 法以芍藥苷為內(nèi)標(biāo)物同時(shí)測(cè)定胡黃連中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ、獐牙菜苷的含有量，以期應(yīng)用到胡黃連的質(zhì)量控制。

1 材料

AcquityTMUPLC 型超高液相色譜儀 （美國(guó)Waters 公司）；4000 QTRAPTM質(zhì)譜儀 （美國(guó)AB Sciex 公司）；Milli-Q 超純水制備儀（美國(guó)Milipore公司）；NewClassic MF 電子分析天平（十萬(wàn)分之一，美國(guó)Mettler-toledo 公司）。

22 批胡黃連藥材采購(gòu)于西藏 （XZ）、 四川（SC）、云南（YN）、甘肅（GS）、北京（BJ）、安徽（AH） 等地，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室蘇連杰教授鑒定為正品。胡黃連苷I、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ、獐牙菜苷對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)芍藥苷（含有量≥99%） 購(gòu)于南京景竹生物科學(xué)有限公司。色譜級(jí)乙腈（美國(guó)Dikama 公司）；Milli-Q 超純水（自制）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ACTUITY UPLC? BEH Amide 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相0.1%甲酸-乙腈（8 ∶92）；體積流量0.4 mL／min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 （MRM）； 源噴射電壓-4 500 V； 離 子 源 溫 度 450 ℃； 霧 化 氣379.225 kPa；加熱氣379.225 kPa；全程通入氮?dú)狻? 個(gè)化合物及內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)離子對(duì)，去簇電壓（DP），碰撞能（CE），見表1。

表1 負(fù)離子模式下分析物和內(nèi)標(biāo)Tab.1 MRM conditions of analyte and internal standard in negative ion mode

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 精密稱定胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ、獐牙菜苷和內(nèi)標(biāo)（芍藥苷）對(duì)照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成1.528 mg／mL 胡黃連苷Ⅰ、1.154 mg／mL 胡黃連苷Ⅱ、1.120 mg／mL 胡黃連苷Ⅲ、1.006 mg／mL 獐牙菜苷和1.054 mg／mL 內(nèi)標(biāo)對(duì)照品貯備液。再精密吸取適量各對(duì)照品貯備液，加入同一量瓶中，用甲醇稀釋定容，配制為系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液含胡黃連苷Ⅰ（15.28、22.92、45.84、76.40、152.8、305.6 ng／mL）；胡黃連苷 Ⅱ （11.54、 17.31、 34.62、 57.70、 115.4、230.8 ng／mL）；胡黃連苷Ⅲ（11.20、16.80、33.60、56.00、112.0、224.0 ng／mL）；獐牙菜苷（10.06、15.09、30.18、 50.30、 100.6、 201.2 ng／mL）， 上述溶液均保存于4 ℃冰箱備用。

2.3.2 供試品溶液 胡黃連干燥根莖藥材粉碎（過(guò)40 目篩），精密稱取0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz） 30 min，待冷卻至室溫后再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾后取續(xù)濾液1 mL 于5 mL 量瓶中，加甲醇定容，取適量經(jīng)12 000 r／min 離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn) 圖1 表明，被測(cè)定成分間分離度良好，無(wú)雜質(zhì)干擾，供試品溶液中的胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ、獐牙菜苷和芍藥苷的 保 留 時(shí) 間 分 別 為1.54、 2.09、 2.03、 1.66、1.74 min，與對(duì)照品一致，比較供試品溶液和對(duì)照品的母離子、子離子質(zhì)譜圖，兩者一致，表明本法專屬性良好。

圖1 各成分UPLC-ESI-MS／MS 圖譜Fig.1 UPLC-ESI-MS／MS spectra of various constituents

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1” 項(xiàng)下的各系列混合對(duì)照品溶液適量，再分別加入一定量的內(nèi)標(biāo)溶液，制得系列濃度線性工作液，取2 μL，在“2.1” “2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣。以各分析物的色譜峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y）、以各分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一批次的供試品溶液，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法每天制備6 份供試品溶液，連續(xù)3 d，在“2.1” “2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得胡黃連苷I、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷含有 量 RSD 分 別 為 1.93%、 1.96%、 2.08%、2.02%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的胡黃連藥材樣品，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1” “2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得胡黃連苷I、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷含有量RSD 分別為3.90%、4.21%、3.09%、3.25%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次的胡黃連藥材樣品，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h，在“2.1” “2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷峰面積RSD 分別為2.92%、3.20%、3.81%、4.15%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的供試品粉末9 份，每份約0.05 g，按高、中、低分為3 組，分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液， 在“2.1” “2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

2.10 樣品含有量測(cè)定 取22 個(gè)不同批次樣品，分別按 “2.3.2” 下方法制備供試品溶液。 在“2.1” “2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，采用內(nèi)標(biāo)法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算22 批樣品中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷的含有量， 結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷作為含有量測(cè)定指標(biāo)，對(duì)不同產(chǎn)地的胡黃連含有量測(cè)定方法進(jìn)行研究，包括供試品溶液制備方法、液相色譜條件選擇、含有量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證等，確定了胡黃連的含有量測(cè)定方法［12］。結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便可行，且有較好的準(zhǔn)確性和精密度。

本實(shí)驗(yàn)首次建立了UPLC-ESI-MS／MS 法同時(shí)測(cè)定不同批次的胡黃連中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷的含有量。 解決了HPLC 法中胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅲ的分離度較差的問(wèn)題。不同批次的胡黃連藥材中4 種環(huán)烯醚萜類的含有量差異較大，部分從甘肅、四川、云南、西藏等地網(wǎng)購(gòu)的批次質(zhì)量不達(dá)標(biāo)，市場(chǎng)上的胡黃連良莠不齊。