大胡蜂蜂毒中多肽和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的多樣性

周思彤 ，車逸豪，倪連麗，李龍星，袁仕夢，楊自忠,3，楊志斌,3*，張成桂,3*

1大理大學(xué) 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室；2大理大學(xué) 藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心；3大理大學(xué) 中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心；4大理大學(xué)分析測試中心，大理 671000

大胡蜂Vespamagnifica(Smith)在云南地方習(xí)稱土蜂、黃土甲等，是景頗族民間傳統(tǒng)運用的蜂類昆蟲藥之一。主要分布在我國的西北地區(qū)，包括云南、四川、西藏等地，在越南、緬甸、印度等也有所分布。早在《本草綱目》中對于土蜂及其蜂房、幼蟲便有所記載，主治蜘蛛咬瘡、癰腫、利大小便等，《中國藥典》(2015版)第一部中收載了胡蜂酒，用于風(fēng)濕閉阻所致的痹病，如關(guān)節(jié)疼痛、肢體沉重等，對于急性風(fēng)濕病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等有治療效果[1]。

蜂毒中含有多種生物活性成分，包括小分子化合物、高豐度的肽、蛋白和過敏原等，其作為一種藥用資源引起了人們的廣泛關(guān)注，現(xiàn)已逐漸成為生物毒素研究的新熱點[2,3]。目前，對于大胡蜂蜂毒的研究主要集中在活性物質(zhì)的分離與鑒定方面，已成功分離出具有抗菌、抗凝血及磷脂酶活性的肽和蛋白類物質(zhì)[4-7]。

大胡蜂蜂毒中的多肽和蛋白質(zhì)成分復(fù)雜且具有多種藥理活性，目前對其的研究報道尚不全面。在本實驗中，利用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析了大胡蜂粗毒中多肽和蛋白質(zhì)的組成，首次對該蜂毒所富含的多肽與蛋白質(zhì)的多樣性進行了探索，同時對蜂毒的抑菌活性進行初步研究。已有研究表明，蜂毒肽(Melittin)可抑制黑色素瘤及肝癌細胞，故本實驗通過使用MTT法檢測大胡蜂蜂毒對HepG2人肝癌細胞及B16黑色素瘤細胞的細胞毒活性，為后續(xù)對該毒素的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及藥用開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

質(zhì)譜儀(Compact QTOF，Bruker)，超高效液相色譜儀(UltiMate 3000，戴安)，電子天平(BSA124S，賽多利斯)，垂直電泳儀(Mini-Protein，Bio-Rad)，低溫高速離心機(5430R，Eppendorf)，冷凍干燥機(FD8-4a，GOLD-SIM)，CO2培養(yǎng)箱(3111，Thermo)，酶標儀(SN255939，BIO-TEK)。

SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒(20171120，Solarbio)，SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(101218181015，碧云天)，甘氨酸(418Q066，Solarbio)，Tris(527K073，Solarbio)，SDS(323A033，Sigma)，Marker(20160425，Solarbio 180 kDa-11 kDa)，考馬斯亮藍 G-250(No.C8430，Solarbio)，乙腈 ACN(178497，TEDIA)，三氟乙酸 TFA(17040277，TEDIA)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(20160618，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，沙氏瓊脂培養(yǎng)(20170426，Solarbio)，克霉唑溶液(B1036，廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司)，青霉素鈉(017171048，中諾藥業(yè)有限公司)， RPMI-1640培養(yǎng)基(1915379，Gibco)，胎牛血清(FBS)(1828728，Gibco)，胰蛋白酶(2046777，密理博)，噻唑藍(MTT)(ST316，Sigma)，二甲基亞砜(DMSO)(RNBF1095，Sigma)其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為超純水。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，25923)，白色念珠菌(Canidiaalbicans，10231)，大腸埃希氏菌(Escherichiacoli，25922)，由大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。HepG2人肝癌細胞株由昆明中國科學(xué)院細胞庫提供，B16黑色素瘤細胞株由上海細胞庫提供。

1.2 昆蟲

蜂毒取自大胡蜂成蟲。蟲種收集自云南德宏等地，由中國科學(xué)院云南動物研究所董大志鑒定，現(xiàn)存于大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院。供試個體的養(yǎng)殖與取毒均由大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院養(yǎng)殖基地完成。

1.3 粗毒收集

于蜂群處采用電刺激法進行多次取毒。取毒器自制，輸出電壓為12 V，每次采集毒液30 min。收集足夠量的毒液后經(jīng)真空冷凍干燥得白色或略帶黃色的粉末，即為粗毒粉末，于-20 ℃保存。

1.4 樣品處理

取一定量的粗毒粉末用超純水溶解至濃度為16 mg/mL，于4 ℃以10 000 rpm離心5 min，使用0.22 μm濾膜濾過，即得。

1.5 SDS-PAGE檢測

對供試品溶液采用 SDS-PAGE的方法進行蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定，使用5%的濃縮膠和12%的分離膠，具體操作參考凝膠制備試劑盒說明書。電泳完成后使用考馬斯亮藍 G-250 進行染色。蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的計算方法如下：以標準蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)(lgMw)為縱坐標，標準蛋白質(zhì)的相對遷移率(Rf)為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程及回歸系數(shù)。將樣品的Rf值代入回歸方程計算出其lgMw，從而得到樣品的相對分子質(zhì)量。Rf值的計算公式為：

其中，L1為加樣孔至條帶中心的距離；L2為加樣孔至溴酚藍區(qū)帶的距離。

1.6 UPLC-ESI-Q-TOF-MS檢測

色譜條件：使用超高效液相色譜儀，色譜柱為 Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0× 150 mm，2.7 μm)，流動相為 0.1% 甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)，梯度洗脫(0～35 min，5%→54% B；35～49 min，54%→79% B；49～58 min，79%→95% B)，流速：0.2 mL/min，進樣量：5 μL，檢測波長為 214 nm，柱溫：25 ℃。

質(zhì)譜條件：使用高分辨質(zhì)譜儀，離子源采用電噴霧離子源(ESI)，正負離子檢測模式，毛細管電壓為3 500 V，掃描范圍300～3 000m/z，霧化器氣體壓力2.0 Bar，干燥氣體流速8.0 L/min，干燥加熱溫度200 ℃。

1.7 蜂毒的抑菌活性研究

將供試菌制成108cfu/L 均勻的菌懸液，取0.1 mL 用無菌涂布環(huán)將菌懸液均勻涂布在凝固的無菌培養(yǎng)基中，放入牛津杯，每個牛津杯加入200 μL的10 mg/mL的蜂毒水溶液，以無菌水為空白對照，細菌平板置37 ℃培養(yǎng)24 h， 真菌平板置27 ℃培養(yǎng)48 h，測定蜂毒對各共試菌的抑菌效果，游標卡尺測定各抑菌圈的的大小，重復(fù)3次。同時，取1 mg/mL 的青霉素鈉溶液及0.15 mg/mL的克霉唑溶液為陽性對照。

1.8 細胞毒活性研究

取對數(shù)生長期的HepG2及B16細胞，胰蛋白酶消化后以5 000個/孔接種于96孔板，設(shè)置實驗組、細胞陰性對照組和空白培養(yǎng)基對照組，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，實驗組加160、80、40、20、10 μg/mL的蜂毒溶液，陰性對照組加入等體積PBS，每組5個復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中孵育48 h。棄去上清液，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO溶解甲瓚(Formazan)晶體，于酶標儀上490 nm 波長測定各孔的光密度值(OD值)，并計算IC50。

生長抑制率(%)=(OD值陰性對照組mean-OD

值實驗組mean)/ (OD值陰性對照組mean-OD值空白組mean)

×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE檢測

結(jié)果如圖1所示，樣品的SDS-PAGE最佳上樣量為5 μL，凝膠背景清晰，蛋白條帶分辨率較高。電泳圖譜中，除相對分子質(zhì)量在 11 kDa 以下多肽外，其他蛋白質(zhì)主要分布在17～45 kDa的區(qū)域內(nèi)，共有4條分離度較佳的清晰條帶。

根據(jù)標準蛋白質(zhì)條帶繪制成標準曲線(圖 2)，得回歸方程Y=-1.216 8X+2.299，r為0.990 1，其中X代表遷移率(Rf)，Y代表相對分子質(zhì)量的對數(shù)值(lgMw)。將樣品中4條電泳條帶的Rf值帶入公式計算，它們的相對分子質(zhì)量從大到小依次為41、34、29、23 kDa。

圖1 大胡蜂蜂毒的SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 The SDS-PAGE results in the wasp venom of Vespa magnifica(Smith)注：a ～ f.上樣量分別為 1，2，3，4，5，6 μL。Note:a ～ f.The amount of loading is 1,2,3,4,5 and 6 μL,respectively.

圖2 SDS-PAGE 標準蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準曲線Fig.2 The standard curve of molecular weight of SDS-PAGE protein marker

2.2 UPLC-ESI-Q-TOF-MS檢測

大胡蜂蜂毒的反相超高效液相色譜圖和質(zhì)譜基峰圖(圖 3)顯示，大胡蜂蜂毒的成分復(fù)雜，在214 nm波長下可以檢測到62個色譜峰(大部分色譜峰峰面積較小)，于40 min內(nèi)被洗脫(圖3A)。經(jīng) ESI-Q-TOF-MS 鑒定(圖 3B,C)，10 min 內(nèi)的質(zhì)譜峰較少，該時間段的洗脫峰主要是小分子化合物，大部分質(zhì)譜峰主要集中在保留時間為10～40 min內(nèi)，為多肽類物質(zhì)，在大胡蜂蜂毒中含量豐富。經(jīng)對質(zhì)譜正負離子模式下的離子峰進行信號歸屬，去除冗余，大多數(shù)質(zhì)譜峰中均出現(xiàn)了2個以上的信號且多為多電荷離子。這說明很多疏水性相近，但相對分子質(zhì)量有差異的多肽分子存在于同一洗脫峰中。本試驗共鑒定得到4個單一成分(表 1)。

表1 大胡蜂蜂毒中單一成分的相對分子質(zhì)量

本實驗從大胡蜂蜂毒中檢測出160個物質(zhì)成分，充分展現(xiàn)了大胡蜂蜂毒的分子多樣性情況(圖4A)。大胡蜂蜂毒中多肽的相對分子質(zhì)量呈“單峰”分布，61%的分子分布在500～3 000 Da區(qū)域，其中有43%分子分布在500～1 500 Da內(nèi)，含量最為豐富，證明此區(qū)域的分子可作為大胡蜂蜂毒肽結(jié)構(gòu)與功能研究的重點目標(圖4B)。有14%低于400 Da的小分子化合物在其中分布。為了直觀的展示大胡蜂蜂毒中所含成分的保留時間、相對分子質(zhì)量以及質(zhì)譜峰的強度，分別以流分(fraction number)、質(zhì)荷比(m/z)和質(zhì)譜峰強度(peak intensity)為X軸、Y軸和Z軸繪制大胡蜂蜂毒中各成分的三維分布圖(圖4C)，由圖可知，主要的多肽分子群于15～35 min的保留時間內(nèi)被洗脫，相對分子質(zhì)量在500～2 000 Da之間；在保留時間30 min處附近，洗脫出較多的成分，但含量相對較少。

圖3 大胡蜂蜂毒的UPLC色譜圖和基峰圖(+/-)Fig.3 The UPLC chromatogram and base peak chromatogram (+/-)of mass spectrometry in the wasp venom of Vespa magnifica(Smith)注：A.色譜模式；B.正離子模式；C.負離子模式。Note:A.The chromatographic mode;B.The positive ion mode;C.The negative ion mode.

圖4 大胡蜂蜂毒的分子多樣性Fig.4 Molecular diversity of the wasp venom of Vespa magnifica(Smith)注：A.結(jié)合液相和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的大胡蜂蜂毒分子質(zhì)量分布； B.直方圖顯示了蜂毒中分子質(zhì)量的分布頻率，曲線顯示了蜂毒中液質(zhì)鑒定成分的累計總數(shù)； C.大胡蜂蜂毒中分子的三維分布圖。Note:A.Molecular mass distribution of the wasp venom of Vespa magnifica(Smith) by RP-UPLC and ESI-Q-TOF-MS analysis;B.The histogram shows the frequency of molecular mass in the wasp venom.The overlaid curve shows the cumulative total of component masses indentified from UPLC-ESI-Q-TOF-MS analyses;C.3D distribution of the wasp venom of Vespa magnifica(Smith).

2.3 抑菌效果分析

以抑菌圈的有無及直徑大小作蜂毒水溶液抑菌效果的測定指標，蜂毒水溶液對細菌的抑菌效果見表 2。 結(jié)果顯示蜂毒溶液對3種菌的抑菌效果不同，對白色念珠菌抑菌效果最明顯，其次是金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌在三種菌中最次，抑菌圈直徑僅為10.90 mm。

2.4 蜂毒溶液與青霉素鈉和克霉唑溶液抑菌效果比較

如表3所示，青霉素鈉對大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用。將10 mg/mL的蜂毒水溶液與1 mg/mL青霉素鈉溶液與0.15 mg/mL的克霉唑溶液的抑菌效果進行比較，發(fā)現(xiàn)蜂毒溶液對大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌的抑菌為青霉素鈉溶液的51%，對于白色念珠菌的抑菌效果比0.15 mg/mL的克霉唑溶液較好。

表2 大胡蜂蜂毒水溶液對細菌及真菌的抑菌直徑

表3 青霉素鈉及克霉唑?qū)毦罢婢囊志睆?/p>

2.5 細胞毒活性研究

經(jīng)檢測，蜂毒樣品的抑制率及IC50如表4所示，結(jié)果顯示，隨著蜂毒溶液的濃度逐漸升高，對HepG2人肝癌細胞株、B16黑色素瘤細胞株的抑制率逐漸升高。

細胞Cell lines樣品Sample(μg/mL)抑制率Inhibition rate(%)IC50(μg/mL)HepG21014.07±0.0232.15±4.332044.47±0.074058.58±0.108076.60±0.0616081.02±0.04B161018.28±0.0729.99±5.512028.67±0.094073.68±0.038080.82±0.0416084.18±0.06

3 討論

動物毒素均含有較為豐富的多肽及蛋白質(zhì)類活性成分，已知蛇毒中大約含有100種不同的多肽組分，蛛毒中含有高達1 018個多肽，芋螺毒液中肽的成分也高達上千種，且不同種內(nèi)肽的數(shù)量及組成具有一定的差異，均可作為新型的藥用資源[8-11]。有文獻報道，胡蜂毒液中含有大量的分子量在1 400～7 000 Da范圍內(nèi)的肽，可占干燥毒液的70%[12]。在本實驗結(jié)果中，大胡蜂蜂毒多肽成分主要分布在500～3 000 Da區(qū)域內(nèi)，蛋白質(zhì)主要分布在17～45 kDa范圍內(nèi)，其結(jié)果與胡蜂Polybiapaulista的蜂毒相似，P.paulista的蜂毒在400～3 000 Da范圍內(nèi)檢測到78～108種不同的肽，占蜂毒干重的70%[13]。同樣，小黃蜂Vespulavulgaris的蜂毒所含蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量主要分布在25～100 kDa范圍內(nèi)[14]。這些結(jié)果表明大胡蜂與其它蜂在物種進化過程中存在一定的同源性，因此，進一步研究大胡蜂蜂毒與其他胡蜂毒的蛋白和多肽分子差異性，將有助于了解其進化及其毒液的生物活性機制。同時，實驗結(jié)果顯示，大多數(shù)的物質(zhì)含量較低，難以檢測和鑒定，其生物活性與結(jié)構(gòu)功能還需進一步研究。

抑菌實驗結(jié)果顯示，蜂毒水溶液對金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌的抑菌效果可達到青霉素鈉的1/2，對于白色念珠菌的作用效果與克霉唑相似，證明其具有抑菌功能?，F(xiàn)有研究表明，在胡蜂蜂毒中存在著由12～14個氨基酸組成的具有抗菌作用的黃蜂毒素(mastoparans)，Xu等[4]在大胡蜂蜂毒分離鑒定出類似黃蜂毒素的兩種抗菌肽，由13～14個氨基酸組成。在P.paulista胡蜂中鑒定出的Polybia-MP I黃蜂毒素的分子量為1 654.09 Da，是一種潛在的高效、高選擇性的抗生素；由9～18個氨基酸組成的激肽相關(guān)肽也是胡蜂蜂毒中主要的肽類物質(zhì)，具有很強的生理效應(yīng)[11]。本實驗證明，大胡蜂蜂毒具有良好的細胞毒活性，可抑制B16黑色素瘤細胞及HepG2人肝癌細胞的生長繁殖，其抑制作用具有明顯的濃度依賴關(guān)系，與蜜蜂蜂毒相似[15]。在大胡蜂蜂毒中，由337個氨基酸組成的磷脂酶類似物(magnifin)具有抑制血管生長活性[16]，癌細胞的遷移和生長依賴新生血管的生成，此蛋白可能是抑制細胞增殖的原因，同時，已有大量文獻證明由26個氨基酸組成的蜂毒肽(melittin)可使腫瘤細胞凋亡，其可能是產(chǎn)生細胞毒性作用的關(guān)鍵因素，需進一步研究。大胡蜂蜂毒中含有豐富的多肽和蛋白，是大自然賦予我們的天然寶庫，對蜂毒及其各種有效成分進行藥理學(xué)研究及抗腫瘤作用機制的研究是蜂毒醫(yī)藥應(yīng)用研究的努力方向。