Lg-Flo1蛋白N端的誘導(dǎo)表達(dá)及活性研究

謝瑩，李曉敏，蔡國(guó)林1,,4*，陸健1,,4*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林，132022) 3(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 4(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

酵母絮凝是指酵母細(xì)胞間相互作用，從懸浮的培養(yǎng)基中快速沉降的現(xiàn)象[1]。這也是細(xì)胞抵御外界惡劣環(huán)境的一種表現(xiàn)形式[2-4]。絮凝表型分為Flo型和New Flo型[5]。Flo型絮凝表現(xiàn)在發(fā)酵的各個(gè)時(shí)期，會(huì)造成發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，而New Flo型絮凝只有糖質(zhì)量濃度<3 g/L時(shí)才能開始表達(dá)[6]。在啤酒發(fā)酵過(guò)程中，通常希望在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中分散的酵母細(xì)胞能相互聚集而沉淀，New Flo型酵母正是發(fā)酵工業(yè)所需要的，這對(duì)酵母細(xì)胞分離、回收再利用具有重要的作用[7-9]。

New Flo型基因表達(dá)的Lg-Flo1絮凝蛋白和Flo1絮凝蛋白相似，都是由N端、C端和中間重復(fù)序列3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的細(xì)胞壁蛋白，這些蛋白的C端以共價(jià)鍵連接到細(xì)胞壁上，利用暴露的N端與相鄰酵母細(xì)胞壁的甘露糖殘基特異性結(jié)合導(dǎo)致絮凝[10-11]。除了甘露糖可以可逆地抑制這種表型外，Lg-Flo1蛋白還受多種糖的抑制，如葡糖糖、麥芽糖、麥芽三糖等[12]。GOOSSENS等[13]將Flo1絮凝蛋白的N端在畢赤酵母中的表達(dá)、純化，產(chǎn)量是在釀酒酵母中表達(dá)的4倍，并且具有與甘露糖結(jié)合的活性。GROES等[14]將純化出的Lg-Flo1蛋白結(jié)晶，進(jìn)一步通過(guò)X-ray衍射分析確定了其糖結(jié)合區(qū)域。然而，國(guó)內(nèi)尚未有關(guān)絮凝蛋白Lg-Flo1的克隆、表達(dá)及純化的相關(guān)報(bào)道。

本研究將巴氏酵母的New Flo型基因Lg-FLO1的N端序列克隆到pET-28a(+)載體上，選擇不同的誘導(dǎo)條件在大腸桿菌BL21(DE3)中異源表達(dá)，經(jīng)純化、復(fù)性后的Lg-Flo1蛋白表現(xiàn)出類似的甘露糖結(jié)合活性。為大規(guī)模制備絮凝蛋白并進(jìn)一步探索其與不同低聚糖或糖蛋白的結(jié)合位點(diǎn)及空間結(jié)構(gòu)，從而以此蛋白為配基制備功能性糖的特異性親和吸附劑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌BL21(DE3)，本實(shí)驗(yàn)室保存；pETLF1重組表達(dá)質(zhì)粒，由金唯智生物科技有限公司合成，連接pET-28a(+)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中保存。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ：TaKaRa公司；Ni-NTA Agarose：QIAGEN公司；過(guò)硫酸銨：阿拉??；蛋白質(zhì)Marker：BBI生命科學(xué)有限公司；丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺30%溶液、尿素、乳糖、IPTG、卡那霉素、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)和咪唑：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

質(zhì)粒的提取參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，重組表達(dá)質(zhì)粒用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后，核酸電泳檢測(cè)目的條帶。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選

將重組表達(dá)質(zhì)粒pETLF1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布含有Amp的LB平板，培養(yǎng)12 h，挑取單菌落。從目的基因上任意位置選擇長(zhǎng)度為252 bp的序列，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，菌落PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化方法參考《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》執(zhí)行[15]。

1.5 N-Lg-Flo1蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及SDS-PAGE分析

將BL21(DE3)(pETLF1)菌液在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于3 mL含有相同濃度卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，以1%的接種量接種于30 mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中， 37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600值0.6)，在培養(yǎng)基中添加乳糖(終質(zhì)量濃度為0.2 g/L)，37 ℃、200 r/min 誘導(dǎo)8 h，取5 mL菌液，離心收集菌體，用3 mL、50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)重懸菌體，超聲波破碎菌體(350 W工作20 min，2 s/2 s)。將菌體破碎液進(jìn)行SDS-PAGE分析，方法參照《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》執(zhí)行[16]。

1.6 誘導(dǎo)條件對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響

1.6.1 誘導(dǎo)劑對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響

將菌液以相同的接種量接種于30 mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，分別采用終質(zhì)量濃度為0.2 g/L的乳糖和0.2 mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑，37 ℃、200 r/min誘導(dǎo)8 h，以下方法均按照1.5所述方法獲得菌體破碎液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。以乳糖誘導(dǎo)的BL21(DE3) (pET-28a(+))破碎液作為對(duì)照。

1.6.2 培養(yǎng)基對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響

將菌液以相同的接種量分別接種于30 mL含有卡那霉素的LB和TB培養(yǎng)基中，乳糖為誘導(dǎo)劑，37 ℃、200 r/min誘導(dǎo)8 h，菌體超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響

將菌液以相同的接種量接種于30 mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，乳糖為誘導(dǎo)劑，分別在25、28和37 ℃、200 r/min誘導(dǎo)8 h，菌體超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響

將菌液以相同的接種量接種于30 mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，乳糖為誘導(dǎo)劑，37 ℃、200 r/min分別誘導(dǎo)2、4、6、8、10 h，菌體超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6.5 誘導(dǎo)劑用量對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響

將菌液以相同的接種量接種于30 mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，加入乳糖誘導(dǎo)，使乳糖終質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1 g/L，37 ℃、200 r/min誘導(dǎo)8 h，菌體超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7 包涵體N-Lg-Flo1蛋白的變性溶解、純化及復(fù)性

將BL21(DE3)(pETLF1)在優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)洗滌菌體后重懸，超聲波破碎，離心收集沉淀，得到重組蛋白包涵體。用洗滌緩沖液洗滌沉淀2次，再加入變性緩沖液，4 ℃攪拌5 h后，離心去除沉淀，上清為N-Lg-Flo1包涵體變性液。使用Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和層析帶有His-tag的N-Lg-Flo1蛋白，用咪唑濃度梯度洗脫目的蛋白，純化步驟及溶液配制參照Ni-NTA瓊脂糖凝膠產(chǎn)品說(shuō)明書中包涵體蛋白的純化。純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。蛋白的復(fù)性參照文獻(xiàn)的方法執(zhí)行[17-18]。

1.8 蛋白含量的測(cè)定

采用Q5000超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定蛋白的紫外吸收值及質(zhì)量濃度。

1.9 熒光光譜分析

通過(guò)熒光光譜測(cè)定N-Lg-Flo1蛋白與D-(+)-甘露糖的結(jié)合作用。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為277 nm，在300～420 nm掃描發(fā)射波長(zhǎng)，掃描速度為100 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm[1]，確定最大發(fā)射波長(zhǎng)。初始樣品為500 μL絮凝緩沖液(50 mmol/L醋酸鈉，pH 6，100 mmol/L NaCl，7 mmol/L CaCl2)中含有2 μmol/L的N-Lg-Flo1蛋白，測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)度。之后加入D-(+)-甘露糖，使終濃度為100 mmol/L，再次測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度變化如公式(1)：

熒光強(qiáng)度變化%=

(1)

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0分析，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值，在圖中以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并進(jìn)行單因素方差分析數(shù)據(jù)差異的顯著性(P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體pETFL1的鑒定

將N-Lg-FLO1基因克隆到pET-28a(+)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pETFL1，N-Lg-FLO1基因長(zhǎng)度為642 bp，位于BamH Ⅰ (198) /Hind Ⅲ (173) 位點(diǎn)，pETFL1載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。從菌株JM109(pETFL1) 提取質(zhì)粒pETFL1，經(jīng)BamH Ⅰ /Hind Ⅲ酶切鑒定，證實(shí)了重組質(zhì)粒含有N-Lg-FLO1基因片段(圖2)。

圖1 pETLF1表達(dá)載體結(jié)構(gòu)Fig.1 The expression vector structure of pETLF1

圖2 pETLF1表達(dá)載體酶切鑒定Fig.2 The identification of the expression vector pETLF1 by restriction endonucleases digestion注：M-DNA marker；1-BamH Ⅰ/Hind Ⅲ酶切。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子檢測(cè)

重組表達(dá)質(zhì)粒pETLF1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布Amp平板，挑取單菌落，進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。PCR檢測(cè)結(jié)果見圖3，從電泳圖中可以看到，從Amp平板上挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出設(shè)計(jì)的含有252 bp的目的條帶，均為陽(yáng)性克隆。將其接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，甘油保藏，用于目的蛋白的表達(dá)。

圖3 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子檢測(cè)電泳圖Fig.3 Electrophoresis of validation of positive transformant注：M-DNA marker；1-陽(yáng)性對(duì)照；2～9-轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè)條帶。

2.3 誘導(dǎo)劑和培養(yǎng)基對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響

分別使用IPTG和乳糖做誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達(dá)目的蛋白(圖4-A)，用Bio-Rad凝膠成像儀的Image Lab軟件MW分析工具對(duì)目的蛋白分子質(zhì)量分析，約為2.8 kDa，比實(shí)際預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量高出約0.4 kDa，因?yàn)楸磉_(dá)了載體上的一些標(biāo)簽。通過(guò)Image Lab軟件檢測(cè)泳道和條帶，在定量工具中選擇每個(gè)泳道的目的蛋白條帶為參考條帶，分析得到目的蛋白條帶百分比含量。結(jié)果表明，表達(dá)目的蛋白分別占總蛋白的30.7%和29.5%，表明使用IPTG和乳糖為誘導(dǎo)劑時(shí)表達(dá)的目的蛋白相對(duì)含量接近。IPTG不能被菌體利用，也不會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的代謝過(guò)程，被用作常規(guī)誘導(dǎo)劑廣泛使用，但價(jià)格較高，且對(duì)菌體有毒害作用，因此限制了在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。而乳糖作為誘導(dǎo)劑參與代謝，需要乳糖透過(guò)酶的協(xié)助進(jìn)入菌體內(nèi)部，乳糖被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)后還需要經(jīng)過(guò)β-半乳糖苷酶作用轉(zhuǎn)化為異乳糖才能誘導(dǎo)Lac啟動(dòng)子，所以與IPTG相比，乳糖誘導(dǎo)過(guò)程更為復(fù)雜，但其經(jīng)濟(jì)、無(wú)毒，特別是在大腸桿菌基因工程菌大規(guī)模發(fā)酵中具備較大潛在價(jià)值[19]。

在LB和TB培養(yǎng)基中表達(dá)的結(jié)果如圖4-B所示，TB培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，雖然表達(dá)后菌體濃度較大，總蛋白量高，但雜蛋白所占的比例較大，Image Lab軟件分析結(jié)果表明目的蛋白只有19.3%，而在LB培養(yǎng)基中目的蛋白占30.3%，表達(dá)量較高。

2.4 誘導(dǎo)溫度對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響

分別在25、28 和37 ℃對(duì)目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(圖5)，通過(guò)Image Lab軟件分析得出，在37 ℃表達(dá)的目的蛋白占總蛋白的31.9%，而在25和28 ℃表達(dá)的目的蛋白僅占12.5%和16%。可見溫度對(duì)目的蛋白的表達(dá)量影響較大，與許崇利[19]用pET-28c(+)載體在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)β2毒素的結(jié)果一致，推測(cè)pET-28系列載體的適合誘導(dǎo)表達(dá)溫度為37 ℃。

A-誘導(dǎo)劑對(duì)蛋白表達(dá)的影響;B-培養(yǎng)基對(duì)蛋白表達(dá)的影響圖4 不同誘導(dǎo)劑和培養(yǎng)基對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of different inducer and medium on expression of N-Lg-Flo1 protein注：黑色箭頭所指條帶為目的蛋白;M-蛋白質(zhì)Marker。下同。圖A中，1- BL21(DE3)(pET-28a(+))菌體裂解液；2～3- IPTG和乳糖誘導(dǎo)的BL21(DE3)(pETLF1)菌體裂解液；圖B中：1～2- BL21(DE3)(pETLF1)在LB和TB培養(yǎng)基中的菌體裂解液。

圖5 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of different induction temperature onexpression of N-Lg-Flo1 protein注：1- 37 ℃培養(yǎng)BL21(DE3)(pET-28a(+))菌體裂解液；2～4- 25、28和37 ℃誘導(dǎo)的BL21(DE3)(pETLF1)菌體裂解液。

2.5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響

誘導(dǎo)2 h，菌體濃度較低，目的蛋白還沒(méi)有表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，目的蛋白開始大量表達(dá)(圖6)，Image Lab軟件分析表明，誘導(dǎo)6 h后，目的蛋白占總蛋白的比例相差不明顯，在30%～33%。為了便于細(xì)胞破碎且節(jié)省成本，可以選擇誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of different induction time on expression of N-Lg-Flo1 protein注：1-BL21(DE3)(pET-28a(+))誘導(dǎo)8h的菌體裂解液；2～6-BL21(DE3)(pETLF1)誘導(dǎo)2、4、6、8和10 h的菌體裂解液。

2.6 乳糖加入量對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響

誘導(dǎo)劑的加入量對(duì)菌體總蛋白量和目的蛋白的表達(dá)量影響不大(圖7)，Image Lab軟件分析表明，目的蛋白所占的相對(duì)比例在30%～32%，相差很小，因此選擇加入0.2 g/L的乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，可以降低成本。

圖7 乳糖加入量對(duì)N-Lg-Flo1蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of different lactose concentrationson expression of N-Lg-Flo1 protein注：1-0.2 g/L乳糖誘導(dǎo)的BL21(DE3)(pET-28a(+))菌體裂解液；2～6- 0.2、0.4、0.6、0.8和1 g/L乳糖誘導(dǎo)的BL21(DE3)(pETLF1)菌體裂解液。

2.7 N-Lg-Flo1蛋白的純化

利用pET-28a(+)表達(dá)載體上的His-tag的親和性，用Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和柱對(duì)表達(dá)的N-Lg-Flo1包涵體蛋白變性液進(jìn)行分離純化，洗脫曲線如圖8所示，第1個(gè)洗脫峰為沒(méi)有和親和柱結(jié)合的雜蛋白峰，第2個(gè)洗脫峰為目的蛋白的洗脫峰，較為單一，150 mmol/L的咪唑可以將目的蛋白洗脫下來(lái)。將洗脫峰對(duì)應(yīng)的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖9)，雜蛋白被大量除去，目的蛋白的純度可以達(dá)到90%以上。通過(guò)Image Lab軟件分析及超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)得的蛋白濃度，計(jì)算得到目的蛋白的回收率約為88%。

圖8 N-Lg-Flo1蛋白親和層析洗脫曲線Fig.8 Affinity chromatography elution curve of N-Lg-Flo1 protein

圖9 Ni-NTA親和柱純化后SDS-PAGEFig.9 SDS-PAGE of proteins purified by Ni-NTA affinity column注：1- 包涵體蛋白變性溶解液；2～5- 雜蛋白；6～8- 目的蛋白

2.8 N-Lg-Flo1蛋白的甘露糖結(jié)合活性

通過(guò)熒光光譜測(cè)定N-Lg-Flo1蛋白與甘露糖的結(jié)合活性，通過(guò)對(duì)目的蛋白溶液的波長(zhǎng)掃描，確定最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為275 nm和336 nm，在此波長(zhǎng)下，進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定。如圖10所示，添加100 mmol/L甘露糖的蛋白溶液和沒(méi)有添加甘露糖的蛋白溶液相比，熒光淬滅，信號(hào)強(qiáng)度減弱了25%，表明N-Lg-Flo1蛋白存在與甘露糖的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合部位的氨基酸可能為Trp、Phe或Tyr。KOBAYASHI等[20]的研究推測(cè)Flo1蛋白的第228位Trp是甘露糖的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而Lg-Flo1蛋白的228位被Leu取代，推測(cè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)可能為196位的Trp。

圖10 N-Lg-Flo1蛋白與甘露糖結(jié)合熒光強(qiáng)度變化Fig.10 Change in fluorescence intensity by the binding of D-(+)-mannose to N-Lg-Flo1 protein

3 結(jié)論

將巴氏酵母絮凝蛋白基因Lg-FLO1的N端序列克隆到pET-28a(+)載體上，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pETLF1，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。通過(guò)對(duì)菌體破碎液進(jìn)行SDS-PAGE和Image Lab軟件分析，確定了較優(yōu)的誘導(dǎo)表達(dá)條件：在LB培養(yǎng)基中表達(dá)，乳糖作為誘導(dǎo)劑，乳糖終質(zhì)量濃度0.2 g/L，誘導(dǎo)溫度37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間6 h，目的蛋白的表達(dá)量均高于30%。該結(jié)果與其他使用乳糖作為誘導(dǎo)劑的科研人員的研究結(jié)果相似，采用乳糖誘導(dǎo)時(shí),目標(biāo)蛋白在總蛋白中所占比例與IPTG誘導(dǎo)相當(dāng)，甚至酶的活性更高[19,21-22]。對(duì)包涵體目的蛋白變性溶解后，經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和柱分離純化，目的蛋白的純度可以達(dá)到90%以上，回收率約為88%。熒光光譜分析表明，復(fù)性后的目的蛋白與100 mmol/L的甘露糖作用，熒光信號(hào)強(qiáng)度減弱了25%，表明N-Lg-Flo1蛋白具有與甘露糖的結(jié)合活性。