基于核酸適配體檢測(cè)動(dòng)物性食品中氯霉素殘留的研究進(jìn)展

王鑫，劉河冰，陶曉奇,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京，100095) 3(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一種廣譜抗生素，又名左旋霉素，是一種由鏈霉菌產(chǎn)生并對(duì)多種有氧和厭氧微生物具有活性抑制作用的抗生素，分子式為C11H12Cl2Na2O3，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。自1949年被引入臨床實(shí)踐，CAP就由于其廉價(jià)和高效的特點(diǎn)，被廣泛用作治療各種傳染病的獸藥[1]。然而，隨著對(duì)CAP研究的不斷深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)其苯環(huán)上含有的硝基半衰期時(shí)間較長(zhǎng)，在動(dòng)物性食品中的殘留可通過(guò)食物鏈進(jìn)行富集，對(duì)人體有較強(qiáng)的毒性，長(zhǎng)期積累會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生強(qiáng)的耐藥性，甚至導(dǎo)致白血病，再生障礙性貧血和灰色嬰兒綜合癥等疾病發(fā)生[2]。由于其具有種種危害人類健康的毒副作用，美國(guó)、澳大利亞、日本以及中國(guó)等許多國(guó)家都禁止在動(dòng)物食品中使用CAP。歐盟(European Union，EU)規(guī)定在海鮮、牛奶、肉等動(dòng)物性食品中CAP的最高殘留限量(maximum residue limits，MRL)為0.3 μg/kg[3]，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2002年第235號(hào)公告中也明文規(guī)定將氯霉素及其鹽、酯類列入禁止使用藥物，并在所有動(dòng)物性食品的靶組織中不得檢出[4]。為滿足市場(chǎng)監(jiān)管需要，相關(guān)行業(yè)不斷研究發(fā)展快速、準(zhǔn)確和便捷檢測(cè)食品中CAP殘留的高新技術(shù)，為規(guī)范市場(chǎng)行為和保障食品安全建立了一道重要防線。

圖1 氯霉素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecule structure of chloramphenicol

近年來(lái)對(duì)CAP殘留檢測(cè)主要包括儀器分析法和免疫分析法兩大類主流檢測(cè)方法。儀器檢測(cè)方法擁有高通量、靈敏、準(zhǔn)確的分析檢測(cè)能力，在大型分析檢測(cè)機(jī)構(gòu)有著較為廣泛的應(yīng)用，如氣相色譜法(GC)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[7]、液質(zhì)聯(lián)用法(HPLC-MS)[8]等，但儀器操作專業(yè)度高，前處理過(guò)程復(fù)雜耗時(shí)，且后期設(shè)備維護(hù)成本較高，難以推廣到市場(chǎng)中進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，因而對(duì)于大批量樣品的快速高通量檢測(cè)具有一定的局限性[9]。免疫分析方法，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)[10]、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)[11]、放射免疫測(cè)定法(radio immunoassay, RIA)[12]、熒光免疫分析法(fluorescent immunoassay, FIA)[13]和膠體金免疫層析法(gold immunochromatography assay, GICA)[14]等，操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速，靈敏度高、準(zhǔn)確度高，能滿足大多數(shù)檢測(cè)需求，因此發(fā)展快速，應(yīng)用廣泛。然而傳統(tǒng)的免疫分析方法均是基于抗原-抗體特異性識(shí)別反應(yīng)建立起來(lái)的，其原料抗體生產(chǎn)成本高、周期長(zhǎng)，免疫活性易受離子強(qiáng)度、pH等環(huán)境因素影響，標(biāo)記修飾復(fù)雜且難以定向標(biāo)記。核酸適配體作為一種新型識(shí)別元件，合成簡(jiǎn)單快速、成本低、親和力高、性質(zhì)穩(wěn)定且易于修飾標(biāo)記[16-17]，是一種優(yōu)良的抗體替代識(shí)別元件。因此，基于核酸適配體的分析檢測(cè)研究在近些年得到了不斷發(fā)展。本文對(duì)核酸適配體進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹，并綜述了近5年基于該生物識(shí)別元件檢測(cè)動(dòng)物性食品中氯霉素殘留的分析方法，以期為動(dòng)物性食品中氯霉素殘留的有效監(jiān)管和檢測(cè)技術(shù)的深入研究提供有價(jià)值的參考。

1 核酸適配體

核酸適配體(aptamer，Apt)是通過(guò)體外配體指數(shù)級(jí)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)從人工構(gòu)建的寡核苷酸文庫(kù)中篩選出來(lái)的一種對(duì)目標(biāo)靶標(biāo)物質(zhì)具有高度親和力的單鏈寡核苷酸序列[17]，一般由25～80個(gè)核苷酸堿基組成，既可以是RNA也可以是單鏈DNA，其功能與抗體相似，不但能與多種目標(biāo)物進(jìn)行高特異性、高靈敏度地結(jié)合，并且還具有許多優(yōu)于抗體的優(yōu)點(diǎn)，例如核酸適配體是通過(guò)體外合成，不需要依賴動(dòng)物產(chǎn)生受體，批次差異小，生產(chǎn)周期短，并且核酸穩(wěn)定性好，適用范圍更廣，能夠特異性結(jié)合蛋白質(zhì)、細(xì)胞、藥物以及金屬離子等，因此常常被視為更有前途的“化學(xué)抗體”[18]。憑借優(yōu)越的性能，適配體已作為一種新的生物識(shí)別元件被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、食品安全、分子識(shí)別和藥物殘留檢測(cè)等領(lǐng)域的研究[19-21]。我們發(fā)現(xiàn)在近5年結(jié)合核酸適配體檢測(cè)CAP的相關(guān)報(bào)道中，不同的實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的適配體序列雖不盡相同，但通過(guò)仔細(xì)比對(duì)發(fā)現(xiàn)大部分核酸適配體的完整序列中都包含“5′-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G-3′”這一共同序列，所以推測(cè)這就是高特異性識(shí)別目標(biāo)分子CAP的適配體核心序列，并且親和性能被大家所普遍認(rèn)同。

1.1 核酸適配體與靶標(biāo)物結(jié)合模式

核酸適配體對(duì)靶標(biāo)物的親和性類似于抗體抗原的特異性免疫識(shí)別，其結(jié)合模式可劃分為兩大類，即單站點(diǎn)結(jié)合和雙站點(diǎn)結(jié)合模式[23]。如圖2所示，單站點(diǎn)結(jié)合主要是針對(duì)小分子靶標(biāo)物，當(dāng)核酸適配體與小分子物質(zhì)結(jié)合后自身構(gòu)象會(huì)發(fā)生一定的改變，核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)研究證實(shí)了小分子通常被結(jié)合于適配體自身的折疊區(qū)域[24]，這種結(jié)合模式也是被運(yùn)用最多的。雙站點(diǎn)的結(jié)合模式則常常被設(shè)計(jì)用于結(jié)合蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，與小分子相比，類似于蛋白質(zhì)等大分子靶標(biāo)物在結(jié)構(gòu)上往往更加復(fù)雜，但是這些復(fù)雜結(jié)構(gòu)為堆疊、結(jié)構(gòu)互補(bǔ)、氫鍵結(jié)合等結(jié)合方式提供了更多的可能，使有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)大分子常被設(shè)計(jì)成“三明治”夾心法檢測(cè)模式。這兩種結(jié)合模式的探明為后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)提供了強(qiáng)有力的理論支撐。

圖2 核酸適配體結(jié)合模式[23]Fig.2 Aptamer-based assay formats

2 檢測(cè)方法

近年來(lái)應(yīng)用核酸適配體檢測(cè)氯霉素殘留的研究有大量報(bào)道，主要有比色檢測(cè)法、熒光檢測(cè)法、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法、表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)法和生物傳感器檢測(cè)法等，表1為相關(guān)檢測(cè)方法的文獻(xiàn)簡(jiǎn)要概括對(duì)比。研究者們通過(guò)對(duì)核酸適配體的巧妙設(shè)計(jì)，同時(shí)結(jié)合納米金顆粒(AuNPs)、磁性納米粒子、熒光素和量子點(diǎn)(quantum dots, QDs)等各種類型的新型納米標(biāo)記材料，使動(dòng)物性食品中氯霉素殘留的檢測(cè)方式多樣化，并且朝著快速簡(jiǎn)便、高靈敏度、高準(zhǔn)確度和高通量的方向不斷發(fā)展，表2為相關(guān)新型納米標(biāo)記材料特性的簡(jiǎn)要概括總結(jié)。

2.1 比色分析法

比色法是指基于有色待測(cè)物質(zhì)顏色的深淺與組分含量在一定范圍內(nèi)成比例的原理，通過(guò)比較或測(cè)量物質(zhì)溶液的顏色深淺來(lái)確定含量，早在20世紀(jì)40年代就被應(yīng)用于定量分析，是一種常見(jiàn)的分析方法[25-26]?；诤怂徇m配體檢測(cè)氯霉素殘留的比色法成本低，響應(yīng)快速，靈敏度及精密度高[27]，有一定的發(fā)展前景。

在傳統(tǒng)比色法檢測(cè)中，ELISA方法利用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化H2O2和3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)反應(yīng)產(chǎn)生顏色信號(hào)，且待測(cè)物濃度與顏色深淺相關(guān)。該方法所需的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，適合批量檢測(cè)，然而這類非均相反應(yīng)需要多次洗滌孵育，操作繁瑣耗時(shí)。類似于ELISA反應(yīng)，YAN等[28]開(kāi)發(fā)了一種基于核酸適配體的比色法用于檢測(cè)動(dòng)物性食品中CAP殘留，運(yùn)用經(jīng)典的生物素-鏈霉親和素信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)，既可通過(guò)目測(cè)顏色變化定性確定樣品中是否存在CAP超標(biāo)殘留，也可進(jìn)一步使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度達(dá)到定量測(cè)定的目的，在蜂蜜及魚肉中的檢測(cè)限達(dá)到了0.003 1 μg/kg，添加回收率為96.2%～109.0%，該方法靈敏度高且準(zhǔn)確度高，表現(xiàn)出了適配體對(duì)CAP優(yōu)異的識(shí)別能力。此外，新型納米材料的開(kāi)發(fā)為構(gòu)建比色法檢測(cè)技術(shù)提供了全新的思路和平臺(tái)，同樣是催化TMB顯色，HUANG等[29]將核酸適配體特異性識(shí)別結(jié)合的特性與DNAzyme功能化納米探針催化顯色的原理相結(jié)合，建立了一種新型比色生物傳感器用于快速檢測(cè)CAP殘留，將過(guò)氧化氫酶模擬物及適配體互補(bǔ)探針cDNA與納米金結(jié)合，構(gòu)建新的納米金探針，過(guò)氧化氫酶模擬物能催化H2O2使TMB的氧化并產(chǎn)生比色信號(hào)，該方法中新型納米材料的引入使檢測(cè)信號(hào)大大增強(qiáng)，奶粉樣品中添加回收率在92.0%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<2.7%，表明了基于核酸適配體的比色法對(duì)氯霉素的檢測(cè)具有較強(qiáng)的檢測(cè)能力，但不足之處是這種四聯(lián)體DNAzyme制備納米探針過(guò)程復(fù)雜，在大批量檢測(cè)效率上應(yīng)用相對(duì)受限。

表1 核酸適配體檢測(cè)氯霉素殘留的檢測(cè)方法Table 1 The methods of chloramphenicol residue detection via aptamers

近年來(lái)關(guān)于納米金的比色研究在分析檢測(cè)領(lǐng)域十分熱門，金納米粒子高消光系數(shù)和良好的光學(xué)效應(yīng)使得適配體和金納米粒子的組合成為比色生物測(cè)定中成為最強(qiáng)大的生物傳感之一[30]。核酸適配體的單鏈DNA(ssDNA)上的N原子與金原子的靜電吸附作用可以使其結(jié)合在納米金上，AuNPs在分散狀態(tài)下溶液為酒紅色，當(dāng)加入鹽離子后會(huì)引起AuNPs聚集從而呈現(xiàn)藍(lán)紫色。根據(jù)AuNPs在不同狀態(tài)下顯色不同的原理，JAVIDI等[31]設(shè)計(jì)了一個(gè)基于Watson-Crick堿基配對(duì)的適配體終端鎖(ATL)比色法來(lái)檢測(cè)CAP，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的ATL由完整的適配體序列和用作鎖定探針(LP)的短序列寡核苷酸共同組成，當(dāng)待測(cè)物中存在CAP時(shí)，特異性適配體識(shí)別CAP形成復(fù)合物，LP片段從ATL中解離吸附在納米金顆粒上，避免了加入鹽離子而引起的聚集，溶液依然保持透亮的酒紅色，反之鹽離子誘導(dǎo)納米金聚集而呈現(xiàn)藍(lán)紫色，奶粉樣品中在0.1～10.0 nmol/LCAP與相對(duì)響應(yīng)信號(hào)有良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為0.03 nmol/L。該方法的最大優(yōu)勢(shì)在于無(wú)需對(duì)適配體以及其他分子進(jìn)行任何修飾，檢測(cè)所需設(shè)備少，步驟簡(jiǎn)單，通過(guò)紫外可見(jiàn)光光譜即可定量檢測(cè)，弊端是樣品的前處理要求較高，否則基質(zhì)會(huì)影響AuNPs的聚集從而造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

2.2 熒光分析法

熒光分析法是基于一些熒光物質(zhì)能夠在一定的激發(fā)波長(zhǎng)下發(fā)出熒光的原理，通過(guò)檢測(cè)熒光的強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行定性定量分析的一種方法，具有高靈敏度、低背景值和選擇性好等明顯的優(yōu)點(diǎn)，在生命醫(yī)學(xué)，化學(xué)等各種檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[32-33]。核酸適配體新技術(shù)與熒光分析法的結(jié)合為氯霉素等抗生素殘留檢測(cè)提供了新思路，同時(shí)新型納米熒光材料的應(yīng)用也大大提升了熒光分析法的檢測(cè)能力。核酸適配體具有易被化學(xué)鍵修飾的特點(diǎn)，因此常常對(duì)核酸適配體或其互補(bǔ)鏈cDNA末端進(jìn)行熒光標(biāo)記，對(duì)CAP的檢測(cè)根據(jù)核酸適配體的標(biāo)記與否可以劃分為熒光標(biāo)記型檢測(cè)法和熒光非標(biāo)記型檢測(cè)法[34]。

表2 新型納米標(biāo)記材料主要特性Table 2 Main features of new marking nanomaterials

2.2.1 熒光標(biāo)記型檢測(cè)法

熒光標(biāo)記的捕獲探針與目標(biāo)物結(jié)合能夠顯著性地改變體系中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，且待測(cè)物濃度與信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)前后體系熒光信號(hào)的變化即可測(cè)算出待測(cè)物濃度。目前常應(yīng)用于標(biāo)記核酸適配體的熒光物質(zhì)有量子點(diǎn)、熒光染料、上轉(zhuǎn)換材料以及貴金屬納米簇等。

量子點(diǎn)(QDs)又稱半導(dǎo)體納米粒子，是一種準(zhǔn)零維納米材料，其作為新型的納米材料憑借量子產(chǎn)率高，發(fā)射光譜窄、激發(fā)光譜寬，抗光漂白以及可測(cè)量的熒光強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用作熒光標(biāo)記材料。ALIBOLANDI等[35]以量子點(diǎn)作為能量供體，氧化石墨烯(GO)作為能量受體，構(gòu)建了一個(gè)基于適配體的QDs-GO熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)平臺(tái)用于檢測(cè)牛奶樣品中的氯霉素，反應(yīng)中熒光猝滅效率超過(guò)90%，檢測(cè)限為0.03 μg/L，檢測(cè)范圍為0.1～10 nmol/L，該方法與CAP類似物無(wú)交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確度高，達(dá)到了良好的檢測(cè)效果，最大缺點(diǎn)在于GO的制備及純化耗時(shí)約1周，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。由于FRET檢測(cè)模式具有高靈敏度、高效率的優(yōu)勢(shì)，因此近幾年在熒光檢測(cè)法中的研究十分熱門，MIAO等[36]將CdSe量子點(diǎn)作為能量供體，AuNPs探針作為受體，建立了一種基于FRET的適配體檢測(cè)方法用于檢測(cè)氯霉素，在魚肉的實(shí)際樣品中檢測(cè)限為0.002 μg/L，線性范圍為0.001～10 μg/L，與傳統(tǒng)的ELISA相比，該方法不但檢測(cè)步驟少，而且更加省時(shí)，從添加樣品到測(cè)出熒光時(shí)間不足10 min，不足之處是探針的制備技術(shù)難度大，成本較高。在后面的進(jìn)一步研究中，MIAO等[37]又創(chuàng)新性地開(kāi)發(fā)出了一種脂質(zhì)體囊泡探針用于氯霉素FRET檢測(cè)。如圖3所示，脂質(zhì)體囊泡由雙磷脂分子層結(jié)構(gòu)的兩端親水基團(tuán)和中間疏水基團(tuán)構(gòu)成，包裹的大量QDs可以放大探針信號(hào)，在牛奶樣品中檢測(cè)限為0.000 3 μg/L，線性范圍為0.001～10 μg/L，添加回收率均在90%～103%。這種均相檢測(cè)熒光“開(kāi)關(guān)”模式操作簡(jiǎn)便，結(jié)合熒光分析儀即可測(cè)定，并且較未改進(jìn)的FRET模式檢測(cè)靈敏度提高了近7倍，是目前基于適配體熒光法檢測(cè)CAP殘留的所有報(bào)道中檢測(cè)限最低的方法。

圖3 基于核酸適配體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)氯霉素[37]Fig.3 FRET detection based on aptamer for chloramphenicol

上轉(zhuǎn)換納米粒子(upconversion nanoparticles, UCNPs)是一種優(yōu)秀的生物材料，具有檢測(cè)背景值低，抗光漂白，低毒性，壽命長(zhǎng)，大的逆斯托克斯(Stokes)位移，改變組分比例還可實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)等特點(diǎn)，常被用作熒光標(biāo)記材料。WU等[38]建立了一個(gè)上轉(zhuǎn)換納米粒子的適配體檢測(cè)平臺(tái)，將連接有CAP適配體的磁性納米粒子(magnetic nanoparticles，MNPs)作為捕獲探針，連接有cDNA上轉(zhuǎn)換納米粒子作為信號(hào)探針，捕獲探針與靶標(biāo)物結(jié)合后引起cDNA解離并釋放上轉(zhuǎn)換納米粒子，導(dǎo)致MNPs表面熒光信號(hào)減弱，在牛奶樣品中檢測(cè)限達(dá)到0.01 ng/mL，添加回收率為93.67%～101.41%。該方法原理簡(jiǎn)單，靈敏度高，由于使用980 nm激光激發(fā)，可以完全避免源自溶液當(dāng)中生物分子的自發(fā)熒光，同時(shí)這種檢測(cè)方法具有一定的通用性，基于該原理通過(guò)替換合適的適配體，可以嘗試用于檢測(cè)其他抗生素。但樣品的制備涉及2個(gè)標(biāo)記過(guò)程，需要人工設(shè)計(jì)，具有一定的難度，并且標(biāo)記的批間差異性也難以保證。

2.2.2 熒光非標(biāo)記型檢測(cè)法

同熒光非標(biāo)記型檢測(cè)法相比，標(biāo)記型的檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度更高，但是需要對(duì)探針進(jìn)行化學(xué)合成標(biāo)記，過(guò)程繁瑣耗時(shí)，非標(biāo)記型檢測(cè)模式則相對(duì)更加簡(jiǎn)便，無(wú)需使用化學(xué)試劑進(jìn)行復(fù)雜的標(biāo)記及最后的分離純化。DUAN等[2]首次報(bào)道了使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR高靈敏度檢測(cè)食品中的氯霉素殘留，設(shè)計(jì)的方法中CAP適配體首先與生物素化的cDNA進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，cDNA通過(guò)生物素-鏈霉親和素結(jié)合系統(tǒng)固定在綴合有親和素蛋白的MNPs上，當(dāng)存在CAP時(shí)，適配體與CAP特異性結(jié)合形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并從MNPs上釋放用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)。該方法優(yōu)化后能對(duì)真實(shí)牛奶樣品中CAP殘留的進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)，檢出限為0.1 ng/mL,線性范圍為0.1～20.0 ng/mL,添加回收率為94.0%～102.0%，并且對(duì)氯霉素類似物甲砜霉素(TAP)和氟苯尼考(FF)顯示出了較高的選擇性。這種非標(biāo)記熒光檢測(cè)方法中PCR技術(shù)靈敏度高，但是操作過(guò)程復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件有一定的要求，因此在現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)場(chǎng)景中有一定的局限性，但依然提供了一個(gè)新的檢測(cè)思路與方法。

2.3 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法

化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence，CL)，指由發(fā)光物質(zhì)自身電子從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)所產(chǎn)生的發(fā)光，是不需要使用外部光源或光學(xué)系統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)，與熒光分析法相比可以有效避免光漂白效應(yīng)，其檢測(cè)信號(hào)是由光子數(shù)決定的，具有靈敏度高，儀器簡(jiǎn)單，校準(zhǔn)范圍寬，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，因此在分析檢測(cè)領(lǐng)域中占有重要地位。HAO等[39]開(kāi)發(fā)了一種基于化學(xué)發(fā)光的適配體檢測(cè)方法，將連有生物素化CAP適配體的MNPs作為功能化的捕獲探針，連有乙基異魯米諾(ABEI)的花狀金納米結(jié)構(gòu)(AuNF)作為信號(hào)探針，結(jié)合對(duì)碘苯酚(PIP)共同構(gòu)建了一個(gè)穩(wěn)定的ABEI-H2O2-PIP化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)；該方法基于競(jìng)爭(zhēng)的形式實(shí)現(xiàn)了對(duì)CAP的高靈敏度檢測(cè)，牛奶樣品中檢測(cè)限為0.01 ng/mL，線性范圍為0.01～0.20 μg/L。與于秀霞[40]使用HRP催化魯米諾的化學(xué)發(fā)光的方法相比，基于核酸適配體的化學(xué)發(fā)光分析法中AuNF靈敏度高，適配體和磁分離穩(wěn)定性較好，測(cè)定重現(xiàn)性好，是更具有前景的小分子藥物殘留的檢測(cè)方法，但制備修飾的ABEI-AuNF信號(hào)探針相當(dāng)耗時(shí)，相比之下總體優(yōu)勢(shì)不夠突出，同時(shí)該方法也是近5年基于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)僅有的一篇報(bào)道。

2.4 表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)法

表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)是一種表面敏感技術(shù)，具有快速響應(yīng)，超高靈敏度，操作簡(jiǎn)單，能同時(shí)進(jìn)行多重檢測(cè)等特點(diǎn)，是超靈敏檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)中特定分析物的最有效的技術(shù)之一，已廣泛應(yīng)用于食品安全、生物診斷、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等領(lǐng)域。YAN等[41]通過(guò)使用銀材料封裝的內(nèi)層金，制成了一種金核銀殼納米結(jié)構(gòu)材料用于SERS檢測(cè)CAP，將熒光染料Cy5修飾的適配體與納米金粒子通過(guò)共價(jià)鍵連接作為分子識(shí)別探針，當(dāng)存在CAP時(shí)，適配體結(jié)合CAP形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)并引起解離，隨著Cy5-適配體與金核表面分離，SERS信號(hào)強(qiáng)度顯著降低。與在納米顆粒外層附著染料的其他SERS傳感器相比，該方法表現(xiàn)出的靈敏度更高，信號(hào)穩(wěn)定性也更好，實(shí)際的加標(biāo)乳樣品中，檢測(cè)限為0.19 ng/L，回收率為96.6%～110.2%，變異系數(shù)為1.8%～4.9%，具有對(duì)CAP殘留的高靈敏度和檢測(cè)的能力。與免疫分析方法相比，YANG等[42]開(kāi)發(fā)出了1種競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析和磁分離的SERS生物傳感器用于精確和靈敏地檢測(cè)氯霉素，這種SERS生物傳感器由于磁分離技術(shù)的富集作用對(duì)氯霉素檢測(cè)信號(hào)具有很好放大作用，檢測(cè)限達(dá)到10 ng/L，線性范圍0.001～10 μg/L，但結(jié)果表明，免疫分析方法檢測(cè)限低于適配體檢測(cè)方法?？偠灾?，結(jié)合適配體的SERS平臺(tái)適用性廣泛，檢測(cè)效果好，通過(guò)適配體稍作變更即可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其他類型的抗生素殘留的檢測(cè)，但遺憾的是，探針制備復(fù)雜以及昂貴的檢測(cè)成本限制了其應(yīng)用推廣。

2.5 電化學(xué)適配體生物傳感器檢測(cè)法

電化學(xué)適配體生物傳感器是基于核酸適配體材料建立并利用電信號(hào)作為分析和檢測(cè)信號(hào)的新型生物傳感檢測(cè)裝置，具有靈敏度高，響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)。CHEN等[43]首次基于納米金屬有機(jī)骨架(NMOF)建立了一種新型電化學(xué)適配體傳感器同時(shí)檢測(cè)包括氯霉素在內(nèi)的多種抗生素；使用NMOF包封金屬離子并固定cDNA作為信號(hào)標(biāo)簽，CAP與cDNA競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合適配體，CAP靶濃度與測(cè)定的電流信號(hào)成比例，該方法的檢測(cè)限低至0.19 pmol/L，同時(shí)線性范圍為0.002～100 nmol/L，達(dá)到了5個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)CAP的檢測(cè)性能非常優(yōu)秀，并且通過(guò)改變相應(yīng)的適配體還能檢測(cè)其他靶標(biāo)物，但電化學(xué)生物傳感器需要對(duì)電極進(jìn)行改性設(shè)計(jì)，可能會(huì)影響生物活性分子的構(gòu)型從而降低識(shí)別能力，檢測(cè)性能的穩(wěn)定性也難以保證。電化學(xué)發(fā)光(electro chemiluminescence，ECL)同時(shí)具有電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光2種方法的優(yōu)點(diǎn)，與化學(xué)發(fā)光方法相比可以實(shí)現(xiàn)更精確的分析物測(cè)定。FENG等[44]建立的一種“雙電勢(shì)”的新型電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器可同時(shí)檢測(cè)孔雀石綠(MG)和氯霉素，將與適配體互補(bǔ)的cDNA同魯米諾-納米金粒子連接并修飾到陽(yáng)極上作為發(fā)射體，使電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的增強(qiáng)取決于目標(biāo)物MG和CAP的濃度，在實(shí)際魚類樣品的檢測(cè)中，檢測(cè)限分別為0.03 nmol/L和0.07 nmol/L。該方法反應(yīng)迅速，從添加樣品到讀出結(jié)果僅需要1 min左右即可完成，精確度和重現(xiàn)性均表現(xiàn)良好，并且具有多重檢測(cè)的能力，但實(shí)驗(yàn)中的電極修飾難度較大，對(duì)實(shí)驗(yàn)的條件要求苛刻，限制了大規(guī)模的推廣應(yīng)用。

2.6 微流控電泳法

微流控電泳法作為一種快速篩選和高通量檢測(cè)的方法，已成功作為高通量DNA或ssRNA的分離系統(tǒng)，可根據(jù)不同序列的堿基對(duì)數(shù)不同的原理來(lái)檢測(cè)ssDNA和dsDNA。核酸適配體本質(zhì)也是ssDNA或RNA，基于此原理，ZHOU等[45]開(kāi)發(fā)了一種新型無(wú)標(biāo)記的適配體微流控電泳平臺(tái)用于自動(dòng)檢測(cè)抗生素殘留，利用靶標(biāo)物CAP和cDNA同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體，電泳平臺(tái)根據(jù)不同比例的dsDNA和Apt-CAP產(chǎn)生不同的信號(hào)比率，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CAP殘留的精確檢測(cè)，在實(shí)際的魚肉以及牛奶的樣品中，檢出限達(dá)到0.003 μg/mL，并且回收率良好。ZHOU等[46]后來(lái)又進(jìn)一步在此模型上采用PCR信號(hào)放大原理進(jìn)行同時(shí)測(cè)定卡那霉素和CAP，將CAP檢測(cè)的靈敏度再次提高了將近1倍。該方法在抗生素殘留的檢測(cè)方面具有非常大的優(yōu)勢(shì)，首先作為電泳方法，適配體探針不需要信號(hào)源的標(biāo)記，其次整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以在3 min之內(nèi)完成，具備高通量檢測(cè)的能力，并且需要的樣品體積小，也適宜于痕量檢測(cè)，但樣品在檢測(cè)前需離心、真空干燥以及氮吹處理，因此基于核酸適配體的微流控電泳法在實(shí)驗(yàn)室層面的CAP殘留檢測(cè)乃至其他種類的抗生素篩選均具有較大的應(yīng)用潛力，但不適合現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。

2.7 側(cè)流層析試紙條法

可視化的層析試紙條法是一種比較常見(jiàn)的低成本并且無(wú)需專業(yè)技能即可上手操作的快捷檢測(cè)方法。在近些年來(lái)得到了飛速的發(fā)展，已經(jīng)成為食品檢測(cè)乃至醫(yī)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)方向[47]。傳統(tǒng)的基于抗原抗體免疫分析試紙條技術(shù)已經(jīng)在很多方面進(jìn)行了商業(yè)化的生產(chǎn)，但抗體本身具有一些局限性，比如批次的不均一性，無(wú)免疫活性或具有毒性的物質(zhì)難以去制備抗體等，使得利用核酸適配體代替抗體去設(shè)計(jì)測(cè)流層析試紙條成為了一個(gè)新的突破口。趙帥[47]建立了一種基于核酸適配體的側(cè)流層析試紙條法用于快速檢測(cè)氯霉素的殘留，試紙條的樣品墊上附著有適配體標(biāo)記的納米金，T線和C線分別通過(guò)生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)固定有不同序列的cDNA，連接有納米金的適配體會(huì)先與靶標(biāo)物CAP結(jié)合，此方法選擇性良好，當(dāng)存在與CAP結(jié)構(gòu)類似物氟苯尼考和甲砜霉素時(shí)，也不會(huì)產(chǎn)生信號(hào)的變化，借助熒光檢測(cè)讀數(shù)儀能夠定量準(zhǔn)確檢測(cè)出CAP含量，在加標(biāo)樣品的檢測(cè)中檢測(cè)限為0.06 μg/mL，然而B(niǎo)ERLINA等[48]基于量子點(diǎn)并結(jié)合傳統(tǒng)的抗原抗體免疫層析法對(duì)牛奶樣品中的CAP檢測(cè)限達(dá)到了0.2 ng/mL，相比之下提高靈敏度則是目前亟待解決的問(wèn)題?；诤怂徇m配體的側(cè)流層析法是一個(gè)快速定性定量檢測(cè)CAP殘留的好途徑，但試紙條本身不穩(wěn)定，不能夠永遠(yuǎn)維持像實(shí)驗(yàn)室這樣一個(gè)良好的檢測(cè)環(huán)境，容易受到外界環(huán)境如溫度、濕度等因素的影響，因此具有許多不可控的因素而最終影響檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，這是在以后開(kāi)發(fā)類似方法中需要注意并加以解決的地方。

3 展望

氯霉素等獸藥超標(biāo)殘留嚴(yán)重威脅著人們的生命健康，同時(shí)也影響我國(guó)動(dòng)物源性食品對(duì)國(guó)際市場(chǎng)的外貿(mào)出口，因此發(fā)展簡(jiǎn)單快速并且高靈敏度的檢測(cè)方法對(duì)保障食品安全和相關(guān)產(chǎn)業(yè)體系的良性發(fā)展具有重大的戰(zhàn)略意義。

核酸適配體作為新型識(shí)別元件具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，它可以通過(guò)化學(xué)合成進(jìn)行大量低成本生產(chǎn)，性質(zhì)穩(wěn)定，并易于進(jìn)行官能團(tuán)修飾以用作標(biāo)記或固定；可以與新型功能化的納米材料如金屬納米粒子、磁性納米材料、上轉(zhuǎn)換納米材料、熒光染料以及量子點(diǎn)等結(jié)合使用提高檢測(cè)能力；與新的檢測(cè)策略結(jié)合應(yīng)用如FRET等在近幾年的分析檢測(cè)領(lǐng)域中更是炙手可熱。這些優(yōu)勢(shì)使得適配體的研究應(yīng)用極富價(jià)值，然而抗體所構(gòu)建的檢測(cè)體系仍是商業(yè)化應(yīng)用的主流，核酸適配體的實(shí)際應(yīng)用依然存在許多的不足與挑戰(zhàn)，例如臨床或環(huán)境樣品基質(zhì)中通常含有多種干擾物質(zhì)，其中有些會(huì)強(qiáng)烈地阻礙靶標(biāo)與適配體之間的特異性識(shí)別，生物樣品中的某些成分也會(huì)導(dǎo)致適配體自身折疊從而無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)[49]；因此在核酸適配體檢測(cè)真正商業(yè)化應(yīng)用之前，這些問(wèn)題都需要去一一解決。未來(lái)關(guān)于核酸適配體檢測(cè)氯霉素的創(chuàng)新首先可能集中在提高靈敏度、選擇性以及樣品通量和多重檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)上；其次適配體與檢測(cè)能力優(yōu)異的電化學(xué)生物傳感器相結(jié)合并解決電極改性問(wèn)題，將會(huì)使其在實(shí)際應(yīng)用中更進(jìn)一步[50]；最后，目前大多數(shù)報(bào)道的適配體都是對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行體外檢測(cè)，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)膫鞲衅髂茉趶?fù)雜基質(zhì)中或體內(nèi)定性定量檢測(cè)也將是一個(gè)重點(diǎn)的突破方向。

更好的檢測(cè)方法往往是基于現(xiàn)有的基礎(chǔ)上去精進(jìn)并不斷探索出來(lái)的。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，新的檢測(cè)策略、新型標(biāo)記材料的研究不斷深入，簡(jiǎn)便化、高通量、多殘留和高精度的檢測(cè)體系正日益完善，盡管仍有一些技術(shù)瓶頸需要去突破，但作為適用性更強(qiáng)的分子探針，相信核酸適配體在氯霉素等獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域的研究應(yīng)用將會(huì)更加深入，未來(lái)在健康、環(huán)境和食品質(zhì)量方面的應(yīng)用也將潛力巨大。