長鏈非編碼RNA UC001kfo表達水平與宮頸癌病人預(yù)后的相關(guān)性研究

田丹，李新，尚學(xué)琴，羅雁

宮頸癌（Cervical Cancer）是常見的婦科惡性腫瘤，高發(fā)年齡原位癌為30～35歲，浸潤癌為45～55歲，近年來宮頸癌的發(fā)病有年輕化的趨勢。宮頸癌的典型表現(xiàn)為接觸性陰道出血，陰道流液，常見病理類型為鱗癌、腺癌和腺鱗癌3種類型，其中以鱗癌（60%～80%）最為常見［1］，目前宮頸癌的標準治療方案是以手術(shù)、放療和化療為主的綜合治療［2］。盡管隨著宮頸癌疫苗的推廣和各種治療手段的進步，近幾年的發(fā)病率和死亡率都有所下降，但是宮頸癌的診斷效率和療效仍有待提高。此外，中國人口眾多，仍有很多的女性病人飽受宮頸癌及治療不良反應(yīng)帶來的痛苦，因此全面深入的研究以提高宮頸癌診斷技術(shù)及治療療效任重而道遠［3］。

長鏈非編碼RNA（long non coding RNA，LncRNA）是指轉(zhuǎn)錄長度大于200個核苷酸，不參與編碼蛋白質(zhì)的一類長鏈RNA。最初人們認為LncRNA是基因轉(zhuǎn)錄過程中的副產(chǎn)物，并不參與細胞的其他生物效應(yīng)，但近年來研究顯示LncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4］。研究表明LncRNA在正常組織及腫瘤組織中表達水平存在明顯差異，LncRNA可分別在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和絨毛癌等腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲［5］，因此，LncRNA與婦科惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA UC001kfo在肝癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌以及膀胱癌等多種腫瘤中呈高表達，提示UC001kfo與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其生理病理功能和作用機制尚未明確［6-10］。目前國內(nèi)外關(guān)于UC001kfo在宮頸癌中的相關(guān)研究鮮有報道。本研究通過比較宮頸癌病人癌組織及癌旁組織UC001kfo的表達差異，分析UC001kfo與宮頸癌病人臨床病理特點及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料收集整理2012年4月2日至2017年2月2日云南省第二人民醫(yī)院收治的81例行手術(shù)切除的宮頸癌病人的宮頸癌、癌旁組織標本及其病例資料。所有病人術(shù)前均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為宮頸癌，術(shù)前均未行化療、放療以及其他特殊治療，術(shù)后病理再次確診為宮頸癌，病人臨床診療資料完整。所需組織切除離體后立即取材，獲取組織標本控制在離體10～30 min，標本獲取后置于凍存管并立即保存在液氮中。宮頸癌診斷及其常規(guī)病理資料由2位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師閱片后確診。術(shù)后分期方法采用國際婦產(chǎn)科協(xié)會（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）的分期標準。81例宮頸癌病人的年齡范圍為30～61歲，中位年齡為41歲；年齡＜40歲病人為39例，年齡≥40歲為42例；Ⅰ期15例，Ⅱ期22例，Ⅲ期35例，Ⅳ期9例；鱗癌69例，腺癌12例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。69例病人接受了術(shù)后放和（或）化療。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有病人或其近親屬簽署知情同意書。

1.2隨訪全部病人術(shù)后出院后均進行隨訪，每3～6月隨訪1次，方式為電話、門診或再入院診療時隨訪，內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀體征、全身體格檢查和影像學(xué)（B超、CT和MRI等）檢查?？偵鏁r間為手術(shù)后到病人因腫瘤死亡的時間。腫瘤死亡定義為因腫瘤本身或腫瘤相關(guān)并發(fā)癥導(dǎo)致的臨床死亡。隨訪起始日為術(shù)后病理確診日期，末次隨訪時間為2018年6月22日，截止隨訪終止病人生存40例，死亡41例，無失訪病例。

1.3實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(yīng)（qPCR）采用qPCR檢測宮頸癌組織及癌旁組織中UC001kfo的表達。收集宮頸癌病人癌組織及其癌旁組織標本，將勻漿的組織參照Trizol試劑（美國Invitrogen公司）說明書提取總RNA進行檢測。然后參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（中國賽默飛世爾科技公司）說明中的操作步驟及注意事項將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行qPCR。相關(guān)的引物序列如下：內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的正向引物序列為5′-AATCCCATCACCATCTTC-CAG-3′，反向引物序列為5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′；UC001kfo的正向引物序列為 5′-GCCAACGCAAGAAGTTACCA-3′；反向引物序列為5′-CCAAATCATTCCTAGCCAAAG-3′。比較宮頸癌組織與癌旁組織中UC001kfo基因表達的變化。所有樣品做3個復(fù)孔。本實驗以計算2-ΔΔCt值代表UC001kfo相對表達量，其中ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對照=（Ct樣品UC001kfoCt-Ct樣品GAPDH）-（Ct對照UC001kfo-Ct對照GAPDH）。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)的錄入、整理和統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示。宮頸癌組織及其癌旁組織中UC001kfo表達的差異采用t檢驗進行比較；UC001kfo表達水平與宮頸癌病人臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗進行分析。采用Kaplan-Meier法分析各組病人生存時間，并行Log-rank檢驗，Cox回歸模型用于宮頸癌預(yù)后的多因素分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1UC001kfo在宮頸癌組織中表達及其與病人預(yù)后的關(guān)系qPCR檢測結(jié)果顯示81例宮頸癌病人癌組織UC001kfo的表達（4.694±1.378）明顯高于癌旁組織（1.543±0.598），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=18.751，P=0.000）。本研究根據(jù)UC001kfo在癌組織及其癌旁組織中表達水平將全部病人分為UC001kfo高表達組和低表達組，高表達組定義為宮頸癌組織UC001kfo表達量/癌旁組織表達量＞2；低表達組定義為宮頸癌組織UC001kfo表達量/癌旁組織表達量≤2［10］，其中高表達組病人為 50 例，低表達組為31例。

通過分析UC001kfo表達與宮頸癌病人年齡、腫瘤大小和病理類型等臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果表明：UC001kfo的表達與宮頸癌病人的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤局部浸潤深度關(guān)系密切，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 UC001kfo表達水平與宮頸癌病人臨床病理特征的相關(guān)性/例（%）

2.2UC001kfo表達對病人生存期的影響采用Kaplan-Meier法分析UC001kfo表達與病人生存期關(guān)系，81例宮頸癌病人的中位生存期23.0個月，總體1、3和5年生存率分別為77.3%、55.1%和48.7%。UC001kfo低表達組和高表達組宮頸癌病人的中位生存期分別是49.0個月和35.0個月。與UC001kfo低表達組比較，高表達組病人的中位生存期明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.663，P=0.019），詳見圖1。

圖1 宮頸癌81例中UC001kfo表達水平與生存期的關(guān)系

Cox回歸多因素分析發(fā)現(xiàn)UC001kfo表達水平、FIGO臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤深度為影響宮頸癌病人生存預(yù)后的獨立危險因素，詳見表2。

表2 Cox多因素分析宮頸癌81例臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系

3 討論

從分子生物學(xué)角度更全面深入的研究宮頸癌生存預(yù)后相關(guān)的各種生物標志物具有重要臨床意義。有研究發(fā)現(xiàn) lncRNA H19、CRNDE、HOTAIR、MALAT1和MEG3等LncRNA與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展和臨床預(yù)后相關(guān)［11-12］。例如，有研究報道在宮頸癌組織中MALAT1表達上調(diào)，臨床分析顯示MALAT1高表達與宮頸癌病人腫瘤大小、臨床分期、血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，是影響宮頸癌病人生存預(yù)后的獨立危險因素，該研究還發(fā)現(xiàn)HPV可能通過MALAT1促進腫瘤生長［13-14］。另有研究報道HOTAIR在宮頸癌病人癌組織中的高表達與侵襲性強、預(yù)后不良和放療敏感性等因素有關(guān)［15-16］，lncRNA為包括宮頸癌在內(nèi)的多種婦科惡性腫瘤的診斷和治療提供了新的方向。

潘延鳳等［8，17］利用芯片雜交技術(shù)從肝硬化、肝癌、癌旁及門靜脈轉(zhuǎn)移的肝癌組織中篩選出了lncRNA UC001kfo，其編碼基因位于Chr10（q23.31），共2 043 bp，UC001kfo和細胞骨架蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）在染色體上存在部分區(qū)域的重疊，ACTA2的啟動子在其重疊區(qū)域內(nèi)，UC001kfo與ACTA2存在2段互補序列，并預(yù)測ACTA2可能是UC001kfo的靶基因，其靶蛋白可能是α-SMA。該團隊進一步的研究發(fā)現(xiàn)UC001kfo高表達與肝細胞癌的大血管侵犯和TNM分期有關(guān)，UC001kfo高表達的肝癌病人總生存率和無進展生存率明顯降低，單因素和多因素分析均提示TNM分期和UC001kfo高表達是肝細胞癌病人預(yù)后不良因素；此外，細胞和動物實驗表明UC001kfo能夠促進肝癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其作用機制與α-SMA蛋白上調(diào)有關(guān)，該研究認為UC001kfo可以作為治療肝細胞癌的理想靶點［18-21］。

研究發(fā)現(xiàn)UC001kfo與肺腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，UC001kfo在肺腺癌癌組織中高表達，UC001kfo的高表達與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，UC001kfo高表達病人預(yù)后較差，UC001kfo表達水平是影響肺腺癌病人無進展生存時間和總生存時間的獨立因素（P＜0.05）［7，22］。研究人員通過建立UC001kfo過表達的非小細胞肺癌A549細胞模型，采用蛋白質(zhì)抗體芯片技術(shù)篩選UC001kfo功能相關(guān)的靶蛋白，結(jié)果表明UC001kfo通過增加BMP-5和SCFR蛋白的表達從而促進肺癌的發(fā)生發(fā)展［10］。與以上研究結(jié)論不同，黃秋霞等［9］研究發(fā)現(xiàn)UC001kfo在乳腺癌組織中呈低表達，UC001kfo低表達與高臨床分期呈負相關(guān)，UC001kfo可能在乳腺癌發(fā)生中起抑癌作用，作者分析其原因可能與不同腫瘤細胞微環(huán)境誘導(dǎo)的UC001kfo表達差異有關(guān)。目前l(fā)ncRNA UC001kfo在宮頸癌中的作用尚未明確。本研究結(jié)果提示，與癌旁組織相比，UC001kfo在宮頸癌病人癌組織中呈高表達，為進一步探討UC001kfo的表達水平與宮頸癌病人臨床預(yù)后的關(guān)系，本研究分析了UC001kfo的表達與各種臨床病理因素的關(guān)系，結(jié)果表明UC001kfo表達較高的病人臨床分期晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，局部浸潤明顯，生存期較低表達者明顯縮短，UC001kfo的表達水平是影響宮頸癌病人生存預(yù)后的獨立危險因素。

綜上所述，UC001kfo在宮頸癌組織中高表達，UC001kfo高表達與宮頸癌病人的預(yù)后不良有關(guān)，UC001kfo為宮頸癌的診斷、治療及其預(yù)后提供了新的研究方向，UC001kfo在宮頸癌中作用及其機制尚無確切結(jié)論，有待進一步研究。