2015-2017年?duì)I口市諾如病毒腹瀉病例檢測(cè)結(jié)果分析

李蕙　單芙蓉　安靜　孫曉巖　郭素英

【摘要】 目的：了解2015-2017年?duì)I口市腹瀉患者中諾如病毒的感染情況和流行趨勢(shì)。方法：收集2015-2017年每年的5-10月份營(yíng)口市54家食源性疾病哨點(diǎn)醫(yī)院腹瀉患者的糞便標(biāo)本363份，采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行核酸檢測(cè)。結(jié)果：共檢出陽性標(biāo)本29份，陽性率為7.99%;檢出GⅠ型諾如病毒4份，檢出率為1.10%，GⅡ型諾如病毒28份，檢出率為7.71%;不同性別、年齡患者的陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;可疑原因食品中，糧食類及其制品的病例陽性率最高（11.11%），其次是果蔬及其制品（10.61%）、肉與肉制品（10.53%）、水產(chǎn)品動(dòng)物及其制品（8.85%）、混合食品（5.71%），乳制品陽性率最低（5.00%）。結(jié)論：營(yíng)口市食源性疾病中存在諾如病毒的感染，以GⅡ型為主，3年檢測(cè)提示諾如病毒已成為營(yíng)口病毒性腹瀉的病原之一，相關(guān)部門應(yīng)及早應(yīng)對(duì)，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，以減少疾病的暴發(fā)與流行。

【關(guān)鍵詞】 諾如病毒; 腹瀉; 實(shí)時(shí)熒光PCR

Analysis on the Results of Detection of Norovirus in Diarrhea Case in Yingkou City From 2015 to 2017/LI Hui，SHAN Furong，AN Jing，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（20）：-153

【Abstract】 Objective：To understand the infection and epidemic trend of norovirus in patients with diarrhea in Yingkou City from 2015 to 2017.Method：A total of 363 stool specimens of patients with diarrhea in 54 cases of food-borne disease sentinel hospital in Yingkou City on May to October from 2015 to 2017 were collected，and real-time fluorescent PCR was used for nucleic acid detection.Result：A total of 29 positive specimens were detected，with a positive rate of 7.99%，4 samples of norovirus GⅠ were detected，the detection rate was 1.10%，and 28 samples of norovirus GⅡ were detected，the detection rate was 7.71%.There were no significant differences in the positive rate between patients of different sex and age（P>0.05）.Among the foods with suspected causes，food and its products had the highest positive rate（11.11%），followed by fruits and vegetables and their products（10.61%），meat and meat products（10.53%），aquatic animals and their products（8.85%），mixed foods（5.71%）and dairy products（5.00%）.Conclusion：Noirovirus infection exists in food-borne diseases in Yingkou City，mainly type GⅡ，3-year detection indicates that noirovirus has become one of the pathogens of viral diarrhea in Yingkou City，relevant departments should deal with it as early as possible and strengthen surveillance in order to reduce the outbreak and epidemic of the disease.

【Key words】 Norovirus; Diarrhea; Real-time fluorescence PCR

First-authors address：Yingkou Affair Center for Health and Wellness，Yingkou 115004，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.20.039

諾如病毒是全球非細(xì)菌性胃腸炎的主要病原體，可以通過污染的食物、水或環(huán)境直接或間接地在人與人之間傳播，屬于杯狀病毒科（Caliciviridae），基因組大小約為7.5 kb，包括3個(gè)開放閱讀框（ORF）。諾如病毒被分類為至少6種基因組，即GⅠ～GⅥ[1]。根據(jù)ORF2全基因序列，GⅠ可分為14個(gè)基因型，GⅡ可分為17個(gè)基因型[2]。GⅠ、GⅡ、GⅣ型可感染人，其中GⅠ和GⅡ型是感染人的主要遺傳組，根據(jù)核苷酸的變異程度可進(jìn)一步細(xì)分為不同基因型[3]。諾如病毒具有很強(qiáng)的傳染性，極易引起暴發(fā)流行[4]。諾如病毒具有感染劑量低、穩(wěn)定性強(qiáng)、多樣性大、基因突變頻繁等特點(diǎn)。除了這些特征外，諾如病毒還易在醫(yī)院、酒店和學(xué)校等封閉環(huán)境中快速?gòu)V泛地傳播[5]。為了解營(yíng)口市感染性腹瀉病例中的諾如病毒感染狀況，目前，營(yíng)口市共有

54家食源性疾病哨點(diǎn)醫(yī)院。本研究通過首次收集營(yíng)口市2015-2017年每年的5-10月共363份急性胃腸炎腹瀉患者糞便標(biāo)本，了解諾如病毒感染的變化趨勢(shì)，為營(yíng)口市諾如病毒的預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015-2017年按照營(yíng)口市食源性疾病諾如病毒監(jiān)測(cè)方案要求，采集54家營(yíng)口市食源性疾病哨點(diǎn)醫(yī)院急性胃腸炎腹瀉患者的糞便標(biāo)本。每年5-10月共收集糞便標(biāo)本363份（10～15 g/份）。

1.2 試劑與儀器 RNeasy Mini Kit病毒核酸提取試劑盒（美國(guó)QIAGEN公司）。全自動(dòng)核酸提取儀QIACube（美國(guó)QIAGEN公司）。諾如病毒GⅠ型/GⅡ型核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）（JC50103，江蘇碩世生物科技有限公司）。QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.3 方法 （1）病毒的RNA提取：在生物安全柜中挑取黃豆大小的糞便（水樣便50～100 μL）置于已標(biāo)記的1.5 mL EP管中，加入500 μL生理鹽水溶解稀釋。震蕩15 s，10 000 r/min 4 ℃離心5 min。取200 μL上清液用RNeasy Mini Kit（JC50103）提取核酸。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。提取的核酸置-40 ℃待用或立即擴(kuò)增。（2）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件：將提取好的核酸標(biāo)本進(jìn)行諾如病毒GⅠ型和GⅡ型Real-time PCR檢測(cè)。每份標(biāo)本擴(kuò)增反應(yīng)體系：RT-PCR反應(yīng)液7.5 μL，酶混合液5 μL，諾如病毒GⅠ型/GⅡ型反應(yīng)液7.5 μL，

待測(cè)標(biāo)本5 μL，總反應(yīng)體積25 μL。待測(cè)標(biāo)本和陰性、陽性對(duì)照同時(shí)按照下列循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)：50 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，55 ℃40 s，

45個(gè)循環(huán);55 ℃時(shí)熒光檢測(cè)，檢測(cè)通道為FAM。

1.4 結(jié)果判定 按照說明書上的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 諾如病毒的檢出情況 2015-2017年每年的5-10月份共收集標(biāo)本363份，其中2015年122份，2016年120份，2017年121份，共檢出陽性標(biāo)本29份，陽性率為7.99%。檢出GⅠ型諾如病毒4份，檢出率為1.10%，GⅡ型諾如病毒28份，檢出率為7.71%，有3例患者同時(shí)感染了GⅠ和GⅡ型諾如病毒，見表1。

2.2 人群特征 男性標(biāo)本194份，女性標(biāo)本169份，男女比例1.15︰1。檢出男性諾如病毒陽性14份（7.22%），女性諾如病毒陽性15份（8.88%）;感染諾如病毒患者中年齡≥70歲陽性率最高（11.11%），其次是0～29歲（8.57%），中年人群的陽性率相對(duì)較低;不同性別、年齡患者的陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3 可疑食品諾如病毒的檢測(cè) 糧食類及其制品的病例陽性率最高（11.11%），其次是果蔬及其制品（10.61%）、肉與肉制品（10.53%）、水產(chǎn)品動(dòng)物及其制品（8.85%）、混合食品（5.71%），乳制品的病例陽性率最低（5.00%），見表3。

3 討論

諾如病毒雖屬自限性疾病，但仍可導(dǎo)致兒童、老年人和免疫力低下患者的致病甚至死亡[6]。其主要傳播途徑有：受污染的食物和水等、低劑量感染（<10個(gè)拷貝）[7]。營(yíng)口市哨點(diǎn)醫(yī)院腹瀉患者中諾如病毒檢測(cè)的結(jié)果顯示：2015-2017年每年的5-10月份共收集標(biāo)本363份，其中2015年122份，2016年120份，2017年121份，共檢出陽性標(biāo)本29份，陽性率為7.99%，每年的食源性腹瀉病例中均有諾如病毒的檢出，每年的檢出率較為平穩(wěn)，沒有出現(xiàn)顯著的上升或下降趨勢(shì)。這可能是由于收集標(biāo)本的數(shù)量存在不足，部分腹瀉癥狀較輕或以嘔吐為主要臨床表現(xiàn)的病例，存在不就診或者未進(jìn)入監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的情況，并且采樣時(shí)間為5-10月份，冬天季節(jié)的樣本沒有覆蓋。據(jù)了解，諾如病毒全年均可發(fā)生感染，并且其喜冷怕熱，冬季正是諾如病毒感染的高發(fā)季節(jié)。提示相關(guān)部門在今后的監(jiān)測(cè)中應(yīng)加強(qiáng)冬季諾如病毒的檢測(cè)。本研究中患者的主要癥狀為惡心嘔吐，腹痛腹瀉水樣便，有的甚至出現(xiàn)發(fā)熱，面色蒼白等較為嚴(yán)重的癥狀，患者中以GⅡ型諾如病毒感染為主，有3例患者同時(shí)感染了GⅠ和GⅡ型諾如病毒;不同性別、年齡患者的陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示諾如病毒是人群對(duì)諾如病毒普遍易感。由于諸多原因，本研究缺少5歲以下兒童感染的數(shù)據(jù)。研究表明，嬰幼兒為諾如病毒易感人群，部分研究顯示老人與兒童最容易感染諾如病毒，但有學(xué)者認(rèn)為年齡與諾如病毒易感性無關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，糧食類及其制品的病例陽性率最高（11.11%），其次是果蔬及其制品（10.61%）、肉與肉制品（10.53%）、水產(chǎn)品動(dòng)物及其制品（8.85%）、混合食品（5.71%），乳制品的病例陽性率最低（5.00%）。本研究所涉及的食品種類多種多樣，糧食和果蔬等農(nóng)產(chǎn)品很容易在加工之前被灌溉水或有機(jī)肥料中的諾如病毒污染，如葡萄等通常被認(rèn)為是諾如病毒暴發(fā)的載體[9]，而貝類食品更是其生存的溫床，因此加強(qiáng)食品衛(wèi)生安全是人們健康生活的重要保障。

核酸檢測(cè)方法是目前諾如病毒檢測(cè)的重要手段之一，具有靈敏、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)。近年來，我國(guó)對(duì)于諾如病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)和分型分析方面也有快速進(jìn)展。白頡等[10]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR手段對(duì)東海海域的貝類食品進(jìn)行了諾如病毒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除太平洋牡蠣、毛蚶外，在僧帽牡蠣和雜色蛤中也存在諾如病毒。文獻(xiàn)[11]結(jié)果顯示，在20.7%的樣本中檢測(cè)到諾如病毒，同源基因組Ⅱ占優(yōu)勢(shì)，并且不同樣本諾如病毒水平差異很大。湖州地區(qū)首次報(bào)道了應(yīng)用直接測(cè)序法對(duì)諾如病毒GⅡ.17幾乎完整基因組測(cè)序序列，這對(duì)于研究病毒的遺傳進(jìn)化，快速診斷試劑的開發(fā)和疫苗的設(shè)計(jì)發(fā)揮重要作用[12]。目前，隨著諾如病毒變異株的出現(xiàn)，世界各地對(duì)于其基因型的研究越來越多。在2016-2017冬季，一種罕見的重組諾如病毒基因型GⅡ.P16-GⅡ.2在亞洲部分地區(qū)急劇增加[13]。香港從2016年8月開始檢測(cè)住院病例患者的諾如病毒GⅡ.P16-GⅡ.2感染情況[14]。在中國(guó)湖州，GⅡ.P16-GⅡ.2菌株在腹瀉病例中也有發(fā)現(xiàn)，并且該菌株的VP1氨基酸序列在HBGA結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸和預(yù)測(cè)的表位中未發(fā)現(xiàn)常見突變[15]。

盡管本研究存在些許不足，但本研究首次對(duì)營(yíng)口市諾如病毒流行趨勢(shì)簡(jiǎn)單的分析，對(duì)今后的研究方向具有一定的指示及指導(dǎo)作用。目前，營(yíng)口市對(duì)諾如病毒的監(jiān)測(cè)工作尚處于起步階段，在今后的工作中著重加深對(duì)其基因型的分布與流行病學(xué)的分析，及時(shí)了解新型GⅡ型變異株或其他重組株出現(xiàn)的機(jī)制和來源，預(yù)測(cè)其流行趨勢(shì)。

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