酸敏感離子通道1a在酸誘導(dǎo)的大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞自噬中的作用及其機(jī)制研究

陳霖　王新亮

【摘要】 目的：探討酸敏感離子通道1a（ASIC1a）在酸誘導(dǎo)的大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞（SFs）自噬中的作用和機(jī)制。方法：分離大鼠膝關(guān)節(jié)SFs，在不同胞外酸化條件處理后檢測(cè)軟骨自噬蛋白（LC3-Ⅱ）的表達(dá)。觀察ASIC1a阻斷劑對(duì)自噬小體數(shù)量、自噬基因（Beclin-1）mRNA的表達(dá)，自噬相關(guān)蛋白（RRK1/2、p38MAPK）磷酸化的影響;觀察RRK1/2、p38MAPK磷酸化抑制劑對(duì)Beclin-1 mRNA、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：HE染色結(jié)果證實(shí)符合SFs的特征;pH 7.4組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)0.05），其余每?jī)山M間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;pH 7.4組細(xì)胞器完整且形態(tài)規(guī)則，pH 6.0組可見(jiàn)線粒體腫脹，且雙層膜包裹的細(xì)胞自噬小體較多，pH 6.0+Amiloride組細(xì)胞質(zhì)自噬小體數(shù)量稍少，細(xì)胞器形態(tài)有所恢復(fù)，pH 6.0+PcTX1組細(xì)胞質(zhì)自噬小體數(shù)量更高，細(xì)胞器接近正常;pH 7.4組Beclin-1 mRNA表達(dá)0.05），其余每?jī)山M間對(duì)比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：胞外酸化條件可誘導(dǎo)大鼠膝關(guān)節(jié)SFs自噬，阻斷ASIC1a能明顯弱化此作用，且特異性阻斷劑的效果更佳，其機(jī)制可能與調(diào)控Beclin-1基因表達(dá)，抑制ERK1/2磷酸化有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 酸敏感離子通道1a; 膝關(guān)節(jié)炎; 滑膜成纖維細(xì)胞; 自噬; 機(jī)制

Study on the Role and Mechanism of Acid-sensitive Ion Channel 1a in Acid-induced Autophagy of Synovial Fibroblasts of Knee Joint in Rats/CHEN Lin，WANG Xinliang.//Medical Innovation of China，2019，16（20）：0-027

【Abstract】 Objective：To investigate the role of acid-sensitive ion channel 1a（ASIC1a）in acid-induced autophagy of rat knee synovial fibroblasts（SFs）and its mechanism.Method：Rat knee joints SFs were separated，the expression of cartilage autophagy protein（LC3-Ⅱ）was detected under different extracellular acidification conditions.The effects of ASIC1a blockers on the number of autophagy bodies，the expression of autophagy gene（Beclin-1）mRNA and the phosphorylation of autophagy associated protein（RRK1/2，p38MAPK）were observed;the effect of RRK1/2，p38MAPK phosphorylation inhibitor on the expression of Beclin-1 mRNA，LC3-Ⅱ protein was observed.Result：The results of HE staining showed that it was consistent with the characteristics of SFs cells.The expression of LC3-Ⅱ protein in pH 7.4 group < pH 7.0 group < pH 6.5 group < pH 6.0 group/pH 5.5 group，there was no significant difference between the pH 6.0 group and the pH 5.5 group（P>0.05），but there were significant differences between the other each two groups（P<0.05）.The organelle of pH 7.4 group was intact and regular in morphology，mitochondrial swelling was observed in the pH 6.0 group，and the number of autophagosomes encapsulated by bilayer membrane was more.The number of cytoplasmic autophagosomes in the pH 6.0 + Amiloride group was slightly less，and the organelle morphology was restored.The number of cytoplasmic autophagosomes in the pH 6.0 + PcTX1 group was higher，and the organelles were close to normal.The expression of Beclin-1 mRNA in pH 7.4 group < pH 6.0 PcTX1 group < pH 6.0 Amiloride group < pH 6.0 group，and there were significant differences between the two groups（P<0.05）.ERK1/2，p38MAPK phosphorylation levels in pH 7.4 group < pH 6.0 PcTX1 group < pH 6.0 Amiloride group < pH 6.0 group，and there were significant differences between the two groups（P<0.05）.Expressions of Beclin-1 mRNA and LC3-Ⅱ protein in pH 7.4 group < pH 6.0 + PD98059 group < pH 6.0 + PcTX1 group < pH 6.0 + SB203580 group/pH 6.0 group，and there was no significant difference in the expressions of Beclin-1 mRNA and LC3-Ⅱ protein between the pH 6.0 + SB203580 group and the pH 6.0 group（P>0.05），but there were significant differences between the other each two groups（P<0.05）.Conclusion：Extracellular acidification conditions can induce autophagy of SFs in rat knee synovium，blocking ASIC1a can significantly weaken this effect，and the effect of specific blockers is better，the mechanism may be related to regulating Beclin-1 gene expression and inhibiting ERK1/2 phosphorylation.

【Key words】 Acid-sensitive ion channel 1a; Knee arthritis; Synovial fibroblasts; Autophagy; Mechanisms

First-authors address：Guangzhou First Peoples Hospital，Guangzhou 510180，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.20.006

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是臨床常見(jiàn)的自身免疫性疾病，呈全身性發(fā)展，以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要臨床表現(xiàn)[1]。膝關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞（SFs）自噬是軟骨破壞的基礎(chǔ)病因，而骨質(zhì)破壞則是致殘的重要原因，因此探討膝關(guān)節(jié)SFs自噬的機(jī)制意義重大[2-3]。酸敏感離子通道1a（ASIC1a）屬于上皮Na+通道/退化蛋白超家族成員，有研究證實(shí)其在大鼠膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨破壞中有積極作用[4]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，膝關(guān)節(jié)軟骨常呈進(jìn)行性加重性受損，推測(cè)可以通過(guò)抑制膝關(guān)節(jié)SFs自噬抑制軟骨破壞。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，膝關(guān)節(jié)軟骨常呈進(jìn)行性加重性受損，推測(cè)可以通過(guò)抑制膝關(guān)節(jié)SFs自噬抑制軟骨破壞。因此本研究特設(shè)計(jì)離體實(shí)驗(yàn)，首先探討合適的胞外酸化條件，然后重點(diǎn)分析ASIC1a在酸誘導(dǎo)的大鼠膝關(guān)節(jié)SFs自噬中的作用及機(jī)制，以期為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎新藥的研發(fā)提供思路和方向?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 成年雄性SD大鼠20只，SPF級(jí)，7周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（豫）20160001。

1.2 方法

1.2.1 大鼠膝關(guān)節(jié)SFs分離、培養(yǎng)與鑒定 Ⅱ型膠原酶消化法分離大鼠膝關(guān)節(jié)，常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行HE染色鑒定。

1.2.2 不同胞外酸化條件細(xì)胞自噬蛋白（LC3-Ⅱ）的表達(dá)檢測(cè) 設(shè)置pH 7.4組、pH 7.0組、pH 6.5組、pH 6.0組、pH 5.5組（每組5個(gè)樣本），培養(yǎng)30 min后分別加入pH為6.0的培養(yǎng)基共培養(yǎng)3 h。以Western blot檢測(cè)LC3-Ⅱ表達(dá)。

1.2.3 不同干預(yù)方法自噬小體數(shù)量變化檢測(cè) 設(shè)置pH 7.4組、pH 6.0組、pH 6.0+Amiloride組、pH 6.0+PcTX1組（每組5個(gè)樣本），其中Amiloride濃度為100 μmol/L，PcTX1濃度為100 μg/L，于給藥

30 min后加入pH為6.0的培養(yǎng)基共培養(yǎng)3 h。常規(guī)接種、培養(yǎng)、消化并離心分離。固定后以梯度丙酮脫水，包埋，聚合。切片后染色并以透射電鏡觀察。

1.2.4 不同干預(yù)方法自噬基因（Beclin-1）mRNA的表達(dá)檢測(cè) 組別設(shè)置、干預(yù)和操作方法均參照1.2.3。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)Beclin-1 mRNA，提取總核糖核酸（RNA），測(cè)定其含量、純度和完整性后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：94 ℃（5 min）→94 ℃（40 s）→51 ℃（40 s）→72 ℃（1 min），35個(gè)循環(huán)，72 ℃（10 min）。電泳后以凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.5 不同干預(yù)方法自噬相關(guān)蛋白（ERK1/2、p38MAPK）磷酸化水平檢測(cè) 組別設(shè)置、干預(yù)方法均參照1.2.3。以Western blot檢測(cè)ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平，操作方法參照1.2.2。

1.2.6 不同干預(yù)方法Beclin-1 mRNA、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)檢測(cè) 設(shè)置pH 7.4組、pH 6.0組、pH 6.0+PcTX1組、pH 6.0+PD98059組、pH 6.0+SB203580組（每組5個(gè)樣本），干預(yù)30 min后加入pH為6.0的培養(yǎng)基共培養(yǎng)3 h，參照1.2.4檢測(cè)Beclin-1 mRNA表達(dá)，參照1.2.2檢測(cè)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，以SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFs鑒定結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形，核大且呈橢圓形，靠近胞質(zhì)的中央，細(xì)胞呈漩渦樣或平行樣排列，集落性生長(zhǎng)，符合SFs細(xì)胞的特征，見(jiàn)圖1。

2.2 不同胞外酸化條件下LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)對(duì)

比 pH 7.4組、pH 7.0組、pH 6.5組、pH 6.0組、pH 5.5組的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)分別為（0.15±0.03）、（0.26±0.06）、（0.59±0.12）、（0.98±0.15）、（0.96±0.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=67.538，P=0.000），且pH 7.4組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)0.05），其余每?jī)山M間對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 不同干預(yù)措施組間自噬小體數(shù)量對(duì)比 透射電鏡觀察結(jié)果顯示，pH 7.4組細(xì)胞器完整且形態(tài)規(guī)則（圖3a），pH 6.0組可見(jiàn)線粒體腫脹，且雙層膜包裹的細(xì)胞自噬小體較多（圖3b），pH 6.0+Amiloride組細(xì)胞質(zhì)自噬小體數(shù)量稍少，細(xì)胞器形態(tài)有所恢復(fù)（圖3c），pH 6.0+PcTX1組細(xì)胞質(zhì)自噬小體數(shù)量更高，細(xì)胞器接近正常（圖3d）。

2.4 不同干預(yù)措施組間Beclin-1 mRNA表達(dá)對(duì)比 pH 7.4組、pH 6.0組、pH 6.0+Amiloride組、

pH 6.0+PcTX1組Beclin-1 mRNA表達(dá)分別為（0.75±0.13）、（1.25±0.18）、（0.99±0.15）、（0.85±0.11），各組Beclin-1 mRNA表達(dá)對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.220，P=0.000），其中pH 7.4組

2.5 不同干預(yù)措施組間ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平對(duì)比 各組ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平對(duì)比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中pH 7.4組

2.6 不同干預(yù)措施組間Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)對(duì)比 各組Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)對(duì)比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），pH 7.4組0.05），且其余每?jī)山M間對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2和圖5。

3 討論

本研究HE染色結(jié)果顯示所取細(xì)胞經(jīng)分離和培養(yǎng)，生長(zhǎng)為特征明顯的SFs，多呈長(zhǎng)梭形，表現(xiàn)為集落性生長(zhǎng)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。在不同胞外酸化條件干預(yù)后，各組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)呈明顯異常，pH 5.5～7.0組中其表達(dá)水平均明顯高于pH 7.4組，可知胞外酸化處理可增強(qiáng)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)。LC3-Ⅱ蛋白為細(xì)胞自噬的標(biāo)志性蛋白，在細(xì)胞自噬過(guò)程中存在相關(guān)的翻譯后修飾，在自噬發(fā)生過(guò)程中該蛋白可在合成后隨即被Atg4剪切掉羧基端，并經(jīng)相關(guān)生物學(xué)過(guò)程的加工和處理，參與推進(jìn)細(xì)胞自噬進(jìn)程[5-6]。由此可知pH 5.5～7.0胞外酸化條件均可促進(jìn)SFs細(xì)胞自噬，而pH 6.0組和pH 5.5組中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均明顯高于其余各組，可知其對(duì)SFs細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用更強(qiáng)，故本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇pH 6.0組作為酸化處理組。

此外，在不同干預(yù)措施處理后，pH 7.4組未見(jiàn)自噬小體，pH 6.0組自噬小體明顯可見(jiàn)，加入ASIC1a阻斷劑處理的兩組細(xì)胞器狀態(tài)明顯優(yōu)于pH 6.0組，且自噬小體明顯少于pH 6.0組，而加入PcTX1組的透射電鏡下觀察的結(jié)果與pH 7.4組最為接近，可知給予ASIC1a阻斷劑干預(yù)可減輕胞外酸化所致的大鼠膝關(guān)節(jié)SFs自噬情況，且PcTX1的作用明顯優(yōu)于Amiloride。ASIC1a屬于鈣滲透性酸敏感離子通道，胞外酸化可介導(dǎo)其開(kāi)放通道，進(jìn)而促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外鈣離子失衡，從而可引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)，包括細(xì)胞自噬，因而胞外酸化可促進(jìn)細(xì)胞自噬，而經(jīng)過(guò)ASIC1a阻斷劑干預(yù)后，即使在酸化條件下，鈣離子通道的開(kāi)放仍受抑制，鈣離子內(nèi)流受阻，因此細(xì)胞自噬可得到控制，且ASIC1a特異性阻斷劑的作用更佳[7-9]。另外，不同干預(yù)措施Beclin-1 mRNA表達(dá)、ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平對(duì)比結(jié)果可知，pH 7.4組

在本研究進(jìn)一步的對(duì)比結(jié)果中顯示，不同干預(yù)措施組間Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)有明顯差異，其中pH 7.4組最低，pH 6.0組最高，證實(shí)胞外酸化環(huán)境可上調(diào)Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，促進(jìn)大鼠膝關(guān)節(jié)SFs自噬;而pH 6.0+PD98059組中Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯低于除pH 7.4外的其余三組，pH 6.0+SB203580組中Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)則與pH 6.0組相近，表明在胞外酸化條件下加入p38MAPK磷酸化阻斷劑并不會(huì)顯著影響B(tài)eclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，而加入ERK1/2磷酸化阻斷劑則可顯著抑制Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，意味著胞外酸化環(huán)境所致的大鼠膝關(guān)節(jié)SFs自噬可得到顯著控制，推測(cè)抑制ERK1/2磷酸化水平可減輕胞外酸化所致的SFs自噬，而在胞外酸化干預(yù)大鼠膝關(guān)節(jié)SFs自噬的過(guò)程中加入ASIC1a阻斷劑很可能是通過(guò)抑制ERK1/2磷酸化實(shí)現(xiàn)弱化細(xì)胞自噬的作用的。

綜上所述，胞外酸化條件可誘導(dǎo)大鼠膝關(guān)節(jié)SFs自噬，給予ASIC1a非特異性和特異性阻斷劑均能夠弱化此作用，且ASIC1a特異性阻斷劑PcTX1的作用更強(qiáng)，Beclin-1基因表達(dá)可顯著下調(diào)，ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平也可得到顯著控制;在胞外酸化條件下加入ERK1/2磷酸化阻斷劑可有效抑制細(xì)胞自噬，因此推測(cè)上述作用是通過(guò)抑制Beclin-1基因表達(dá)，控制ERK1/2磷酸化水平實(shí)現(xiàn)的。本研究提示ASIC1a特異性阻斷劑PcTX1、ERK1/2磷酸化阻斷劑均可抑制胞外酸化所致的膝關(guān)節(jié)SFs自噬，為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者新藥的研發(fā)指明了方向，而其在人類中應(yīng)用的可行性、有效性和安全性均需更深入觀察探討，應(yīng)作為未來(lái)的研究方向。

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