高效液相色譜串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定梨中單雙糖含量的研究

王勇 戴麗媛 費(fèi)騰 趙亞坤 李曉磊

摘 要：為了定量測(cè)定梨果實(shí)中單雙糖含量，本文以黃金梨、黃冠梨和雪花梨為研究對(duì)象，采用高效液相色譜串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，對(duì)梨樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖含量進(jìn)行了測(cè)定。高效液相色譜條件：ZORBAX?Carbohydrate（4.6?mm?×150?mm?5μm）色譜柱，30℃柱溫，流動(dòng)相乙腈水（80：20v/v）溶液，流速1.0mL/min;蒸發(fā)光散射器條件：氮?dú)饬魉?.8L/min，漂移管溫度100℃。結(jié)果表明：在15min[KG-*7]內(nèi)，測(cè)得黃金梨、黃冠梨和雪花梨果實(shí)中總糖含量分別為：15.12%、15.05%和13.78%;其中，黃冠梨、雪花梨果糖含量最高，分別占梨果實(shí)的6.52%、6.82%;其次為葡萄糖，分別占梨果實(shí)的5.08%、4.16%;蔗糖含量最少，分別占梨果實(shí)的3.44%、2.80%。而在黃金梨中葡萄糖含量最多，占梨果實(shí)的6.67%;果糖次之，占梨果實(shí)的6.32%;蔗糖含量最少，占梨果實(shí)的2.13%。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;梨;果糖;葡萄糖;蔗糖

中圖分類號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20190815006

我國(guó)梨樹資源豐富，廣泛分布在全國(guó)各地;梨樹的栽培面積和梨的產(chǎn)量一直居于世界第1位。梨果實(shí)中含有糖類、氨基酸、維生素、膳食纖維、礦質(zhì)元素等豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，鮮嫩多汁，酸甜適口，因此深受人們喜愛。

梨中可溶性糖的組成和含量對(duì)梨果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和感官品質(zhì)有重要影響。不同品種梨由于生長(zhǎng)環(huán)境、種屬類別等因素的影響，糖組分也會(huì)有很大差異[1]。本文以黃金梨、皇冠梨、雪花梨為研究對(duì)象，對(duì)其中的果糖、葡萄糖、蔗糖含量進(jìn)行對(duì)比。

對(duì)糖的傳統(tǒng)測(cè)定方法主要有：化學(xué)滴定法[2]，分光光度法[2]，高效液相-示差折光法[3，4]?；瘜W(xué)滴定法對(duì)試劑、操作過(guò)程要求嚴(yán)格且步驟多、操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，滴定終點(diǎn)受實(shí)驗(yàn)條件影響較大。分光光度法準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便、快速[2]，但只能測(cè)定糖的總含量，不能確定糖分的組成。

高效液相色譜儀常與示差折光檢測(cè)器或蒸發(fā)散射檢測(cè)器相串聯(lián)，來(lái)檢測(cè)糖的組分及含量。

示差折光檢測(cè)器法測(cè)定存在靈敏度低，系統(tǒng)平衡時(shí)間較長(zhǎng)，受溫度、流速、基線噪音影響較大，且不能梯度洗脫等缺點(diǎn)。使用蒸發(fā)散射檢測(cè)器（ELSD）作為測(cè)定方法，穩(wěn)定性好、靈敏度比示差折光法高，可以很好的彌補(bǔ)示差法存在的缺點(diǎn)[1]。

所以本研究采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法來(lái)測(cè)定3個(gè)品種梨中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量。

1?材料與方法

1.1?材料

黃金梨（新疆產(chǎn)）、黃冠梨（河北產(chǎn)）、雪花梨（河北產(chǎn)）均購(gòu)于長(zhǎng)春市共和果品超市;果糖、葡萄糖和蔗糖購(gòu)自上海國(guó)藥化學(xué)試劑公司，甲醇為色譜純?cè)噭?，?gòu)自美國(guó)熱電飛世爾科學(xué)有限公司;二次蒸餾水為自制;其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2?定性用對(duì)照品溶液的配制

分別稱取1.25g果糖、葡萄糖、和蔗糖對(duì)照品，置于50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，搖勻。以0.45μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾（聚醚砜，MEMBRANA公司），吸取20μL濾液用于高效液相色譜分析。

1.3?定量用對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖對(duì)照品1.00g，置于3個(gè)50mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度線，搖勻。作為母液備用。

將果糖、葡萄糖、蔗糖母液分別按濃度梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mg/mL）進(jìn)行稀釋。以0.45μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾，吸取20μL濾液用于高效液相色譜分析。

1.4?樣品處理及待測(cè)溶液的制備

1.4.1?樣品的冷凍干燥處理

分別將3個(gè)不同品種的梨稱重，切成小塊，經(jīng)組織搗碎機(jī)（HGB2WTS3，Waring）粉碎5min，將粉碎后的漿均勻倒入玻璃皿成2mm左右的薄層，稱重，置于冰箱（Simens，博西華家用電器公司）冷凍層-20℃冷凍1h，再經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥機(jī)（FDU-2100，日本東京理化株式會(huì)社）干燥24h，快速放置于玻璃干燥器中，依次快速稱重，快速用研缽磨碎用保鮮膜封存于玻璃干燥器中備用。

1.4.2?樣品的烘干干燥處理

分別將3種不同品種的梨采用上述1.4.1操作冷凍1h后不進(jìn)行冷凍干燥，直接在105℃的烘箱中過(guò)夜烘干，之后快速置于干燥器中，待冷卻至室溫，稱重。

1.4.3?樣品的測(cè)定

快速稱取上述樣品粉末0.10g于50mL容量瓶中，加入適量乙腈：水（1：1）混合溶液，在超聲波清洗機(jī)中（舒美KQ-300VDE，昆山超聲儀器公司）70℃，45KHz超聲提取0.5h，冷卻至室溫后，再補(bǔ)充乙腈：水（1：1）定容至刻度線，并搖勻[5，6]。以0.45μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾，所得濾液用于高效液相色譜分析。平行試驗(yàn)3次。

1.5?色譜條件

高效液相色譜儀（Dionex?P680?HPLC?pump，美國(guó)戴安公司）;ZORBAX?Carbohydrate色譜柱（安捷倫4.6?mm×150?mm，?5-Micron，美國(guó)）;流動(dòng)相，乙腈：水（80?：?20?v/v）;流速，1.0mL/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣體積：20μL。

1.6?蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Alltech?3300?ELSD，美國(guó)奧泰公司）條件：漂移管;溫度：100℃，氮?dú)鉃檩o氣（流量：1.8L/min）。

1.7?統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)表示為平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差，采用LSD法對(duì)黃金梨、皇冠梨和雪花梨的果糖含量、葡萄糖含量和蔗糖含量進(jìn)行多重比較（P<0.05）。

2?結(jié)果與討論

2.1?樣品前處理?xiàng)l件的選擇

真空冷凍干燥技術(shù)能夠有效的除去水分，且經(jīng)該技術(shù)處理的樣品營(yíng)養(yǎng)成分損失少[7]。所以，本研究采用真空冷凍干燥法對(duì)樣品進(jìn)行處理。

經(jīng)真空冷凍干燥后的黃金梨、黃冠梨、雪花梨失去的水分占總質(zhì)量的比值，分別達(dá)83.66%、87.77%和87.66%。經(jīng)105℃過(guò)夜烘干后的樣品黃金梨、黃冠梨、雪花梨失去的總水分占總質(zhì)量，分別達(dá)84.66%、89.01%和89.68%。從中可以看出，烘箱干燥處理的樣品失水量比真空冷凍干燥稍大，但差別保持在2.5%之內(nèi)。且烘箱干燥處理后的樣品由于高溫處理，樣品發(fā)生了褐變，糖組分及含量的變化影響了樣品中糖含量的測(cè)定。而真空冷凍干燥處理的樣品可以有效除去水分，其他營(yíng)養(yǎng)成分損失少。所以本研究采用真空冷凍干燥處理樣品。

梨中主要糖分果糖、葡萄糖、蔗糖都易溶于水，升高溫度可以提高糖的溶解度。使用超聲提取法用乙腈：水（1：1）溶液浸提樣品中糖分，可以使糖分子充分浸出，防止梨中糖分未完全浸出而帶來(lái)的誤差。所以本實(shí)驗(yàn)采用浸提溫度為70℃，超聲時(shí)間0.5h[8]。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

將1.2中高效液相色譜分析結(jié)果得出的3種糖標(biāo)準(zhǔn)譜圖，按上述1.5色譜條件測(cè)定峰面積。分別以果糖、葡萄糖、蔗糖梯度濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。3種糖的標(biāo)準(zhǔn)譜圖詳見圖1、圖2、圖3。從3種標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖中可以看出3種糖在15min內(nèi)全部出峰，果糖最先出峰，在7.098min，葡萄糖在8.148min出峰，蔗糖出峰時(shí)間最遲，在11.747min。

2.3?樣品色譜圖

按照1.5色譜條件對(duì)3種不同品種的梨中果糖、葡萄糖、蔗糖進(jìn)行測(cè)定，樣品色譜圖如圖4、圖5、圖6所示。

用高效液相色譜分離3種糖的樣品譜圖結(jié)果表明，本試驗(yàn)所采用的色譜條件可以很好地分離果糖、葡萄糖和蔗糖。3個(gè)樣品譜圖中果糖出峰時(shí)間最早，在7.549min左右，葡萄糖出峰時(shí)間在8.512min左右，蔗糖出峰時(shí)間最晚在12.321min左右，達(dá)到了基線分離效果，色譜基線穩(wěn)定。比較果糖、葡萄糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖，可以看出，樣品的出峰時(shí)間比標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間稍晚一些。

宋曉暉[1]和姚改芳[9，10]的研究結(jié)果表明，梨果實(shí)中主要糖分為果糖、葡萄糖和蔗糖。與本試驗(yàn)得出的結(jié)果一致。姚改芳[9]的研究中，采用高效液相-示差折光檢測(cè)器測(cè)定梨果實(shí)樣品色譜圖中3種糖的出峰順序依次為蔗糖、葡萄糖、果糖;與本研究采用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)法測(cè)定梨樣品中3種糖的出峰順序不同。宋曉暉等[1]的研究，采用高效液相-蒸發(fā)光散射器測(cè)定樣品梨果實(shí)中糖含量，為了使梨樣品色譜圖中山梨糖醇和葡萄糖達(dá)到更好的分離效果，分別在不同柱溫、流動(dòng)相流速和流動(dòng)相比例條件下，測(cè)定梨樣品色譜圖。而本研究確定的色譜條件，色譜圖中不會(huì)檢測(cè)到山梨糖醇，從而避免了山梨糖醇對(duì)葡萄糖的影響。

2.4?精密度實(shí)驗(yàn)

分別將果糖、葡萄糖、蔗糖對(duì)照品配制成濃度為0.08、0.08、0.04mg/mL的溶液，以0.45μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾，吸取適量濾液用于高效液相色譜分析，按上述1.5色譜條件測(cè)定峰面積，外標(biāo)法定量計(jì)算果糖、葡萄糖、蔗糖濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于2.7%。故使用HPLC-ELSD法測(cè)梨中果糖、葡萄糖、蔗糖精密度較好。詳見表2。

2.5?3種梨樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量

分別取3個(gè)品種的梨樣品，按上述1.4方法處理后，以上述1.5色譜條件平行測(cè)定4次（n=4），結(jié)果詳見表3。

從表3中可以看出，黃金梨、黃冠梨、雪花梨中均含有大量果糖、葡萄糖、蔗糖。黃冠梨、雪花梨果糖含量最高，分別占梨含量的6.52%和6.82%;其次為葡萄糖，占梨含量的5.08%和4.16%;蔗糖含量最少，占梨含量的3.44%～2.80%。而在黃金梨中葡萄糖最多，占梨含量的6.32%;果糖次之，占梨含量的6.32%;蔗糖含量最少，占梨含量的2.13%。3種梨中總糖含量由小到大以此為：雪花梨、黃冠梨、黃金梨。3種不同品種的梨果糖含量無(wú)明顯差異，葡萄糖、蔗糖含量有顯著差異，這可能是由于梨的品種及其生長(zhǎng)地、日照時(shí)間、氣候條件、人為施肥程度、成熟度等因素造成的。

結(jié)果表明，黃金梨屬于高果糖、高葡萄糖型，這與宋曉暉等人[1]的研究中新疆梨屬于高果糖、高葡萄糖型相一致。黃冠梨果糖含量最高，蔗糖含量最少，屬于高果糖型;宋曉暉等[1]的研究結(jié)果：黃冠梨中果糖占總糖含量最高，達(dá)30%左右，蔗糖占總糖含量最少達(dá)8.69%左右，屬于高果糖、低蔗糖型。雪花梨果糖含量最高，屬于高果糖型，蔗糖含量最低;高海洋等[11]的研究結(jié)果：雪花梨梨汁中果糖含量最高，可達(dá)70.49g/L，蔗糖含量最低，達(dá)1.638g/L，說(shuō)明雪花梨為高果糖、低蔗糖型。這表明本實(shí)驗(yàn)以黃金梨、皇冠梨和雪花梨為材料，分析處理得出結(jié)果與他人研究得出的結(jié)果相一致。

3?結(jié)論

對(duì)3個(gè)不同品種梨利用組織搗碎機(jī)磨成果漿，然后采用真空冷凍干燥技術(shù)預(yù)處理，乙腈：水（1：1）超聲波提取果糖、葡萄糖和蔗糖，再利用HPLC-ELSD法進(jìn)行定量分析，結(jié)合SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件，通過(guò)差異性可以準(zhǔn)確的分析出梨中可溶性糖的組分（主要為葡萄糖、果糖和蔗糖）、含量和不同品種梨中同種糖的差異性比較。本實(shí)驗(yàn)采用的方法可用于梨中糖含量的質(zhì)量分析與控制，具有實(shí)用價(jià)值。

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作者簡(jiǎn)介：

王勇（1993-），男，在讀碩士研究生。研究方向：食品生物技術(shù)。