五味子多糖的分離純化及DPPH自由基清除活性研究

祁玉麗，孫印石，李珊珊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130118）

五味子為木蘭科植物五味子〔Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.〕干燥成熟的果實(shí)，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品中藥，味酸、性甘溫，具有斂肺、滋腎、生津、收汗、澀精之功效[1]。五味子屬于多年生藤本植物，可用于生產(chǎn)藥品、保健品、飲品及化妝品等[2]。五味子中含有多種化學(xué)成分，如揮發(fā)性成分、木質(zhì)素類、有機(jī)酸類、糖類等[3]。早期相關(guān)研究主要集中在木脂素等脂溶性成分[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，五味子多糖具有抗疲勞、抗焦慮、抗變態(tài)、保護(hù)肝損傷、保護(hù)腸道及清除自由基等多種生理活性[5-10]，有重要的研究意義和開發(fā)利用價(jià)值。

多糖提取方法有溶劑提取法、酶解提取法、超聲波提取法、微波提取法及超高壓提取法等。目前，對于五味子多糖的分離純化方法各不相同，不同方法得到的多糖級分的活性也不同。本研究采用傳統(tǒng)的水提醇沉法獲取總多糖[11]，再利用乙醇沉淀分級法，對五味子總多糖進(jìn)行分級純化，并分析其單糖組成以及DPPH自由基清除活性，為五味子多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

五味子，采收于吉林省集安市，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所許世泉研究員鑒定為木蘭科植物北五味子〔S.chinensis(Turcz.)Baill.〕的果實(shí)；單糖標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、半乳糖醛酸（GalA）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖醛酸（GlcA）、甘露糖（Man）（Sigma-Aldrich 公司）；DPPH（Cat# CD4891-500MG，Coolaber 公司）；1-苯基-3 甲基-5-吡唑酮（PMP）、鹽酸-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（源葉生物公司）；維生素C（VC）（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；去離子水，由特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物加工實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

QD8J（BL）單煎機(jī)（青島達(dá)爾電子機(jī)械銷售有限公司）；TGL-16A高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FD-1A-50 低溫冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司）；JP-100ST超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；高效液相色譜儀、LC-16 溶劑輸送泵、CTO-16 柱溫箱、SPD-M20A 紫外檢測器（日本島津儀器有限公司）；Hypersil ODS2 C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5um）（大連依利特分析儀器有限公司）；721G可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；WP-UP-WF-40 微量分析型超純水機(jī)（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 五味子總多糖的提取

選用干燥的北五味子500 g，加入5 L 去離子水，使用單煎機(jī)100 ℃提取2 h，4 層紗布過濾，殘?jiān)貜?fù)提取3 次，合并濾液，使用電磁爐保持微沸狀態(tài)濃縮濾液至1 L，放至室溫，離心（4 500 r/min，10 min），棄去沉淀。向上清液中加入醫(yī)用酒精，調(diào)節(jié)乙醇終濃度為80%，沉淀過夜，離心（4 500 r/min，10 min），收集沉淀。向沉淀中加入800 mL 蒸餾水，充分溶解，重復(fù)醇沉1次。沉淀用蒸餾水復(fù)溶后冷凍干燥，得五味子總多糖（Water-soluble S.chinensis polysaccharides，WSP）。

2.2 五味子多糖的分級純化

將10 g WSP 充分溶解于150 mL 蒸餾水中，加入醫(yī)用酒精調(diào)節(jié)溶液至乙醇終濃度為30%，沉淀過夜，離心（4 500 r/min，10 min），沉淀用少量蒸餾水溶解后冷凍干燥，得到WSP-30。上清液繼續(xù)加入醫(yī)用酒精調(diào)節(jié)溶液至乙醇終濃度為60%，攪拌后靜置過夜，離心（4 500 r/min，10 min），所得沉淀用少量蒸餾水復(fù)溶后凍干，即為WSP-60。所得上清液用醫(yī)用酒精調(diào)節(jié)溶液至乙醇終濃度為80%，重復(fù)上述步驟，得到WSP-80。具體流程見圖1。

圖1 五味子多糖分級純化流程Fig.1 Flow of fractionation and purification of S.chinensis polysaccharides

2.3 單糖組成分析

稱取多糖樣品2 mg，加入2 mol/L 鹽酸-甲醇溶液0.5mL，充氮?dú)夥夤埽?0 ℃水解16 h，氮?dú)獯蹈珊螅尤? mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL，120 ℃水解1 h，然后反復(fù)加入無水乙醇，去除三氟乙酸，再用PMP 衍生化后用HPLC 檢測。采用Shimadzu HPLC 系統(tǒng)，Hypertsil ODS色譜柱，流動(dòng)相為82.0%PBS水溶液（0.1mol/L，pH7.0）和18.0%乙腈（V/V），流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20uL，檢測波長為245 nm。

2.4 多糖樣品的DPPH自由基清除率檢測

2.4.1 試劑的配制 DPPH 溶液的配制：稱取5 mg DPPH，加入無水乙醇定容至100 mL，充分溶解，避光保存。

陽性對照（VC）梯度溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.1000g VC 定容至100 mL，配制成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 濃度梯度的水溶液。

將不同樣品（WSP、WSP-30、WSP-60 和WSP-80）分別配制成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 濃度梯度的水溶液。

2.4.2 DPPH 自由基清除率的測定 取0.5 mL 樣品或VC 水溶液于試管中，加入0.5 mL DPPH 溶液，混勻后避光反應(yīng)1 h，517 nm 處測吸光值。

DPPH 自由基清除率=[1 －（A樣品－A空白）/A對照]×100%，A樣品為 0.5 mL 樣品或 VC 溶液+0.5 mL DPPH的吸光度；A空白為0.5 mL 樣品溶液 +0.5 mL 無水乙醇的吸光度；A對照為0.5 mL DPPH+0.5 mL 蒸餾水的吸光度。

2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用IBM SPSS Statistics 19 軟件中的單因素方差分析進(jìn)行組間比較（P＜0.05為差異具有顯著性），并使用此軟件計(jì)算IC50值。使用軟件Origin8.5 進(jìn)行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 五味子多糖的分級純化以及單糖組成分析

五味子多糖產(chǎn)率為5.2%。通過HPLC 分析單糖組成，結(jié)果表明（圖2、表1），WSP 主要由GalA 組成（70.3%），其余還有Glc（11.1%）和Gal（7.8%）等；WSP-30 主要是GalA（96.2%）組成；WSP-60 主要由GalA（83.8%）組成，此外還含有少量的Rha（4.0%）、Gal（6.5%）、Glc（3.2%）和Man（2.4%）；WSP-80 主要由GalA（45.7%）和 Glc（26.8%）組成。WSP-30、WSP-60和WSP-80 中均含有豐富的GalA，其中，WSP-30 中GalA 含量更是高達(dá)96.2%。GalA 是一種果膠類物質(zhì)的主要成分，分子量較大，在乙醇中的溶解度小，低濃度乙醇易使其沉淀[12]，GalA 在 WSP-30、WSP-60、WSP-80 中的含量依次降低。

圖2 單糖對照品（A）、WSP 樣品（B）的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of monosaccharide reference substance(A),WSP(B)

表1 五味子多糖各級分的產(chǎn)率及單糖組成Table 1 Yield of s.polysaccharides fractions and monosaccharide composition （%）

3.2 五味子多糖的DPPH自由基清除率分析

按照“2.4.2”項(xiàng)下方法測定五味子多糖各級分的DPPH 自由基清除率。從圖3可以看出，五味子多糖的不同級分均具有一定的DPPH 自由基清除活性，在一定濃度范圍，隨著多糖濃度升高，活性增強(qiáng)。當(dāng)多糖濃度均為1.0 mg/mL 時(shí)，WSP 對DPPH 自由基清除率可達(dá)98.7%。多糖濃度在0.1～0.6 mg/mL 時(shí)，WSP-30對DPPH 自由基清除率略高于WSP；濃度繼續(xù)升高，WSP 活性略優(yōu)于 WSP-30。WSP-80、WSP-60 對 DPPH自由基的清除活性較WSP、WSP-30 低。

圖3 五味子多糖各級分的DPPH 自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of DPPH free radicals of S.chinensis polysaccharides fractions

IC50值也是表示抗氧化能力的一個(gè)指標(biāo)，IC50值越低，抗氧化劑的自由基清除能力越強(qiáng)。WSP-30 的DPPH 自由基清除能力最強(qiáng)，IC50值為0.101 mg/mL；其次為陽性對照Vc、WSP，IC50值分別為0.163 mg/mL、0.173 mg/mL；WSP-80、WSP-60 的 IC50值分別為0.525 mg/mL、1.946 mg/mL。

4 討論

果膠是多糖的一種，在許多植物中含量豐富，具有多種活性。GalA為果膠的標(biāo)志性組分，通常認(rèn)為，GalA含量超過65%的多糖可稱為果膠，因此，WSP、WSP-30與WSP-60 均屬于不可多得的天然果膠類物質(zhì)，尤其是WSP-30。許多果膠可作為增稠劑、穩(wěn)定劑等應(yīng)用于食品工業(yè)中，或作為一種水溶性膳食纖維應(yīng)用于保健食品和藥品中[12]。對WSP 及其子級分的甲酯化度、凝膠特性等進(jìn)行研究和分析，可以為五味子多糖的應(yīng)用提供基礎(chǔ)，也是課題組下一步工作的重點(diǎn)。

抗氧化活性與許多常見病都有關(guān)[13]，如癌癥、糖尿病、自身免疫性疾病等。自由基氧化應(yīng)激反應(yīng)對許多生物大分子均有損傷作用，最常見的是對蛋白質(zhì)和DNA 的破壞。DPPH 是常見的具有損傷作用的自由基，其清除率是評價(jià)抗氧化作用的重要指標(biāo)。五味子多糖富含GalA，是一種良好的清除自由基抗氧化劑。本研究中，WSP 對DPPH 自由基清除率能達(dá)95%以上，其子級分也具有一定的DPPH 自由基清除活性。對五味子多糖抗氧化作用的研究可以為五味子的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)和理論支持。

綜上所述，所分離的五味子多糖及其子級分具有DPPH 自由基清除活性，其中，WSP-30、WSP 的DPPH 自由基清除活性較強(qiáng)，IC50值為0.101 mg/mL、0.173 mg/mL。對五味子多糖抗氧化作用的初步研究為篩選優(yōu)質(zhì)多糖與探討其作用機(jī)制及構(gòu)效關(guān)系提供了理論依據(jù)。