實驗用新西蘭兔綠膿假單胞菌病的診斷與防治

居海亮

摘 要：綠膿假單胞菌屬于條件致病菌，會使兔子出現(xiàn)肺炎或是出血性腸炎特征的病癥。某實驗室在2017年9月購進(jìn)了一批新西蘭兔，在規(guī)定的檢疫期內(nèi)，相繼發(fā)病，通過臨床觀察、解剖試驗以及生化試驗等多種方式檢驗后，所發(fā)病癥經(jīng)確認(rèn)是感染了綠膿假單胞菌?；诖?，本文主要分析了實驗用新西蘭兔綠膿假單胞菌病的診斷與防治，先對綠膿假單胞菌病進(jìn)行了闡述，然后通過一系列試驗對新西蘭兔的綠膿假單胞菌病進(jìn)行診斷，最后提出了有效的防治方法，以此為相關(guān)人士研究提供一定的參考意見或建議。

關(guān)鍵詞：綠膿假單胞菌病;新西蘭兔;診斷

中圖分類號：S858.291 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）14-0195-02

1 綠膿假單胞菌與疾病闡述

1.1 綠膿假單胞菌

綠膿假單胞菌屬于革蘭氏陰性菌，是一種無莢膜、芽孢的多形態(tài)桿菌，不但可以單獨存在，而且也可成雙存在，有時還會以短鏈形態(tài)存在。菌體一端帶有一根鞭毛，長度大約為0.75-2.4μm，運動較為活潑。其能夠寄生在傷口處并產(chǎn)生綠膿菌素，并且膿汁顏色為暗綠色。且在1882年，Gessard在綠色膿汁中提取出了此種細(xì)菌。另外綠膿假單胞菌是常見細(xì)菌，其病原體分布較為廣泛，比如：土壤、空氣以及水體中都會存在此種細(xì)菌。在人體的消化道、呼吸道以及皮膚上也易存在此細(xì)菌。此外，由于細(xì)菌對抗菌素有著較強的抵抗性，所以現(xiàn)已成為醫(yī)院發(fā)生感染病原的主要細(xì)菌，若是宿主抵抗力較差，受到此細(xì)菌的感染會產(chǎn)生致命效果[1]。此細(xì)菌的主要傳染源有病兔或攜帶者的尿液及其它分泌物，受到這些分泌物污染的水源及飼料等物質(zhì)都是傳染源，并且無明顯季節(jié)性特征，若是在治療其他疾病時濫用抗生素等藥物，也可誘發(fā)綠膿假單胞菌病

1.2 綠膿假單胞菌病

綠膿假單胞菌病又被稱作銅綠假單胞菌病。人類、牲畜都易感染此疾病，屬于散發(fā)性傳染病。當(dāng)新西蘭兔患有此病時主要表現(xiàn)為腸炎或是出血性肺炎。另外，新西蘭兔屬于肉用兔品種，在20世紀(jì)初，美國用美國白兔、弗朗德兔、安哥拉兔等多種兔種雜交培育成新西蘭兔，同時成為美國企業(yè)用于試驗最多的兔種，現(xiàn)已培育為近交品系。

2 臨床癥狀與解剖觀察

在2017年9月，某實驗室為了進(jìn)行實驗從某飼養(yǎng)場購買了24只體重為2.0KG的普通新西蘭兔。在隔離檢疫觀察期，有10只兔子出現(xiàn)了患病癥狀，4只新西蘭兔出現(xiàn)死亡問題。通過觀察發(fā)現(xiàn)，患病的新西蘭兔相繼帶有精神沉郁、食量減少等問題，有些病兔體溫升高、呼吸急促;少數(shù)病兔呈腹式呼吸，在鼻孔附近有黃色膿性分泌物;部分病兔有腹瀉癥狀，其腹瀉物為褐色粘液，還有3只病兔糞便中帶有血絲。通過對新西蘭兔飼養(yǎng)場的詢問，其場內(nèi)兔子也發(fā)生過類似病癥，并有零星死亡。

通過對檢疫期間死亡的新西蘭兔解剖檢查后、可以觀察到病死兔的胃臟內(nèi)存有大量積液，并且十二指腸的腸粘膜帶有血絲，肺臟充血、部分肺臟呈大面積出血;脾臟腫大，呈櫻桃紅色。在所有病死途中，有2只新西蘭兔的肺臟呈現(xiàn)深紅色肝樣變，其器官有出血現(xiàn)象，并伴有膿性分泌物，飼養(yǎng)場中所死亡的新西蘭兔也有同種病理變化。

3 實驗檢查

3.1 鏡檢

鏡檢就是將所要檢測的標(biāo)本進(jìn)行取樣、制片，并使用顯微鏡觀察、分析。譬如：動物排泄物、動物組織、植物細(xì)胞、人體組織等都可進(jìn)行鏡檢，主要用于協(xié)助診斷疾病。具體檢查過程為，在采樣后，通過涂片、染色等程序后，使用顯微鏡進(jìn)行樣本檢查，此種方式簡單便利，無須使用其他特殊藥物或是器材等物品。通常情況下主要使用革蘭氏染色法，能夠檢測出革蘭氏陽性球菌或陰性球菌、桿菌等細(xì)菌。若與臨床資料相結(jié)合，具有較大的判斷參考價值[2]。在本次實驗中，通過對實驗室、飼養(yǎng)場內(nèi)死亡的新西蘭兔病料采集后，選擇了并制作出了臟器樣本與分泌物樣本，在對樣本瑞士染色后使用顯微鏡進(jìn)行觀察。通過觀察發(fā)現(xiàn)，此病菌無兩級著色，具有較多形態(tài)，既有單個存在體，也有成雙的存在，兩端鈍圓，是一種細(xì)桿菌。

3.2 分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)是研究微生物的一種方法，其主要目的是為了從自然物混雜微生物群體中得到所需純種微生物。具體實驗方法為：使用劃線分離法、液體稀釋法以及單孢子分離法等多種方式在固定的平板培養(yǎng)基中進(jìn)行。在對病料進(jìn)行分離培養(yǎng)時，要先進(jìn)行接種培養(yǎng)，通過采集病死兔呼吸道上的分泌物、腸液以及肺臟的樣本，將其接種于胰蛋白胨大豆（TSA）與綿羊血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中;讓后將培養(yǎng)基放置在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行24小時培養(yǎng)觀察。待24小時培養(yǎng)過后，綿羊血瓊脂培養(yǎng)基中長出了菌落呈β溶血，而TSA中長出了較為寬大扁平、濕潤光滑的銅綠色菌落。

3.3 生物化學(xué)試驗

在對病死兔進(jìn)行生物化學(xué)試驗時，要使用梅里埃VETEK 2 compact型號的全自動微生物檢定設(shè)備，利用GN細(xì)菌鑒定卡進(jìn)行細(xì)致檢測，通過生化試驗后，其陽性試驗結(jié)果為：ILATK、LIP、IMLTa、d MNE、CIT、CMT與BAIap等物質(zhì);陰性結(jié)果為：硫化氫、腺苷、BNAG、d MAL、血糖、ODC淀粉瓊脂以及磷酸酯酶等物質(zhì)。由結(jié)果可知，其與綠膿假單胞菌之間有著99%相似度。

3.4 毒力試驗

毒力是指毒性的強弱，通過對病死兔進(jìn)行毒力試驗，可以有效了解綠膿假單胞菌病對新西蘭兔造成的影響。在進(jìn)行此試驗時，需要先接種出肉湯培養(yǎng)基，在37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24個小時。然后使用小白鼠進(jìn)行毒力試驗，先挑選出10只體重在10-20g范圍內(nèi)的ICR小鼠，將其分別為2組，其中一組的小白鼠，要在每只腹腔內(nèi)部注射0.2mL經(jīng)過培養(yǎng)的肉湯培養(yǎng)基;另一組是試驗對照組，有關(guān)人員要對每只小白鼠的腹腔內(nèi)注射0.2mL的生理鹽水[3]。待兩組小白鼠注射完畢后，通過觀察發(fā)現(xiàn)，注射過肉羊培養(yǎng)基的小白鼠在2個小時后出現(xiàn)了卷毛或是蜷縮等癥狀，并且在注射24小時之后全部死亡，而對照組的小白鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

4 新西蘭兔綠膿假單胞菌病的治療方法

綠膿桿菌的抗藥性較強，許多種類的抗生素都無法治療此疾病，因而為了確保治療效果良好，治療新西蘭兔時要先進(jìn)性藥物過敏試驗，并選擇使用高敏藥物。第一，慶大霉素。每只新西蘭兔進(jìn)行肌肉注射，抗生素用量為2萬-4萬單位/次，并且要連續(xù)使用3-5天;第二，多黏菌素B。依照新西蘭兔的體重進(jìn)行抗生素注射，每只兔子的抗生素用量為1萬范圍/KG，每天兩次，連續(xù)使用3天;第三，羧芐青霉素。每只兔的藥劑用量為20萬-40萬單位/次，采取肌肉注射方式，每天兩次，連續(xù)使用3天;第四，復(fù)方新諾明。同樣依照新西蘭兔的體重進(jìn)行藥物治療，每只兔子的服用劑量為200mg/KG，采取口服形式，每天兩次。第五，新霉素。每只新西蘭兔的注射用量為2萬-4萬單位/KG體重，每天兩次，需要連續(xù)使用3-4天，治療效果顯著。第六，中藥治療。需要準(zhǔn)備2g郁金、2g白頭翁、2g黃柏、2g黃芩、1g黃連、2g梔子、2g白芍、1g大黃、1g訶子、1g甘草，將此些草藥研制為細(xì)末，然后使用開水進(jìn)行沖泡，待半小時后與新西蘭兔的飼料進(jìn)行混合拌料，值得一提的時。預(yù)防用量是每只新西蘭兔1g/KG體重，治療是每個兔子的使用量為2g/KG體重。

而在此次試驗中，由于時間較為緊迫，所以未對新西蘭兔進(jìn)行藥敏試驗，經(jīng)過查閱相關(guān)書籍與文獻(xiàn)可知，抗生素要選擇使用頭孢噻肟與慶大霉素，同時配合使用DXMS注射液，使用次數(shù)為每天2次，連續(xù)喂藥3天。對于存在較為嚴(yán)重腹瀉問題的家兔，要在其飲用水中加入口服補液鹽，從而增強兔子體內(nèi)的電解質(zhì)，使其快速恢復(fù)體力。與此同時，飼養(yǎng)場也對出現(xiàn)綠膿假單胞菌病癥狀的病兔使用以上方法進(jìn)行治療，效果良好。而實驗室所購買的剩余新西蘭兔在藥物治療后狀況開始好轉(zhuǎn)并恢復(fù)，未出現(xiàn)死亡問題。

5 新西蘭兔綠膿假單胞菌病的防治辦法

第一，要做好新西蘭兔衛(wèi)生管理工作，保證飲用水源與飼料干凈、衛(wèi)生，同時要做好防鼠與滅鼠工作。對于存在綠膿假單胞菌感染病史的兔場，要使用治療此病的單價或是多價滅活苗進(jìn)行防治，對每個兔子進(jìn)行皮下注射或是肌肉注射1ml滅活苗。新西蘭兔的免疫期為半年，共免疫2次。在發(fā)生此種病癥時，有關(guān)人員要將病兔與可疑病兔進(jìn)行隔離治療，并對兔舍進(jìn)行全方位消毒，對于病死兔及其污物要做燒毀、深埋處理，以此斷絕此病的蔓延途徑[4]。除此之外，還要對飼養(yǎng)的籠具進(jìn)行徹底的清理、消毒，以免殘留的病兔分泌物對其周圍環(huán)境造成污染，使其它新西蘭兔患病。通常情況下，此病癥所需清理的消毒藥品為4%燒堿液。

第二，要嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)范進(jìn)行飼養(yǎng)管理。對于新西蘭兔的養(yǎng)殖，飼養(yǎng)者要使用科學(xué)合理的方式進(jìn)行喂養(yǎng)，在飼料方面，要科學(xué)配比并制作出全價飼料，以此避免新西蘭兔因營養(yǎng)不良或缺失出現(xiàn)抵抗力下降等多種問題。而且全價飼料能夠確保新西蘭兔具有較強的免疫力與抵抗力。若是在實驗室中飼養(yǎng)新西蘭兔，則需嚴(yán)格按照GB14925-2010文件清理并維護(hù)實驗動物的生產(chǎn)環(huán)境與試驗環(huán)境。

第三，要遵照預(yù)防為主的原則進(jìn)行新西蘭兔的養(yǎng)殖。在飼養(yǎng)新西蘭兔時，有關(guān)飼養(yǎng)單位要時刻牢記預(yù)防為主、防重于治的飼養(yǎng)原則。對于1個月零以上的新西蘭兔來說，要使用治療此病的滅活菌苗進(jìn)行免疫，并且每半年對兔子進(jìn)行一次皮下注射，即可有效防控綠膿假單胞菌病的發(fā)生。

第四，禁止亂用、濫用抗生素藥物。在使用藥物進(jìn)行疾病防治時，要依照藥物說明進(jìn)行使用，不可亂使用抗生素藥物。這是因為發(fā)生綠膿假單胞菌病的主要原因就是抗生素的濫用，在平時飼養(yǎng)新西蘭兔時，為了提升其抵抗力，許多飼養(yǎng)者都會在其飲用水或飼料中添加抗生素，這使得新西蘭兔體內(nèi)的綠膿假單胞菌具有了較強的抗藥性，耐藥效果較強，最終導(dǎo)致細(xì)菌在兔體內(nèi)迅速繁殖，引發(fā)了綠膿假單胞菌病。

6 新西蘭兔綠膿假單胞菌病實驗總結(jié)

在對患病新西蘭兔進(jìn)行試驗檢查時，分別對鏈球菌病與巴士桿菌病予以鑒別，并且依照細(xì)菌菌落的形狀與色澤將鏈球菌感染問題排除;再經(jīng)過對樣本瑞士染色后，為發(fā)現(xiàn)兩級有著色現(xiàn)象，所以將巴士桿菌感染問題排除。按照培養(yǎng)菌落的色澤與生化試驗結(jié)果、毒力試驗結(jié)果可知判定，新西蘭兔所患病癥為綠膿假單胞菌感染。由于時間有限，未做藥敏試驗，在參考相關(guān)成功經(jīng)驗的資料后，選擇其相同藥物進(jìn)行治療，治療效果明顯。

7 結(jié)語

綜上所述，通過對患病的新西蘭兔進(jìn)行了鏈球菌病與巴士桿菌病發(fā)熱鑒別，依照相關(guān)實驗結(jié)果可知，為了減少此疾病的發(fā)生，在養(yǎng)殖新西蘭兔時，有關(guān)人員應(yīng)當(dāng)注意飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生，并且要保證新西蘭兔的飲用水與食物無污染，不可濫用抗生素，以此避免新西蘭兔患有綠膿假單胞菌病，減少飼養(yǎng)場的經(jīng)濟(jì)損失。

參考文獻(xiàn)

[1] 高倩倩，孟小斌，陳雪芹，等.亞胺培南和阿米卡星雙耐藥銅綠假單胞菌的特性分析[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2019，19（04）：404-408.

[2] 周妃妃，許磊.耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌分布方式以及耐藥性研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2019，57（08）：92-94.

[3] 龍瑞清，劉卓慧，李書聆，等.綠膿假單胞菌感染中耳上皮細(xì)胞可以激活TGF-β1 Smad信號通路[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，38（10）：65-69.

[4] 寧建國，張秋桂，匡艷華.衡陽地區(qū)綠膿假單胞菌臨床分布特征及耐藥性分析[J].湘南學(xué)院學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，14（03）：31-33.