生防芽孢桿菌對(duì)黃瓜根際土壤酶活性的影響

閆楊 劉月靜 王帥珂

摘要：采用溫室盆栽試驗(yàn)的方法，研究3株對(duì)黃瓜枯萎病具有較強(qiáng)抑制作用的芽孢桿菌（Bacillus subtilis） B579、Bacillus subtilis 2-1、Bacillus amyloliquefaciens 9-2對(duì)黃瓜根際土壤關(guān)鍵酶活性的影響。結(jié)果表明，生防菌的施入能明顯提高黃瓜根際土壤中堿性磷酸酶、過氧化氫酶、幾丁質(zhì)酶和脲酶等4種與土壤肥力相關(guān)酶的活性。其中，生防菌處理的酶活性最高，其次為拮抗處理和空白對(duì)照處理，病原菌處理的酶活性最低。因此，生防菌處理不僅對(duì)黃瓜具有防病促生長(zhǎng)的作用，同時(shí)還能提高土壤關(guān)鍵酶活性，增加土壤肥力，為今后生態(tài)環(huán)保型生防菌劑的開發(fā)和利用奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：生防芽孢桿菌;土壤酶活性;黃瓜枯萎病;土壤肥力

中圖分類號(hào)： S476+.9 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）07-0108-03

黃瓜枯萎病是一種嚴(yán)重危害黃瓜的土傳性真菌病害[1]，其病原為鐮孢菌屬的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），病菌主要侵入幼根或傷口，使瓜葉迅速萎蔫。一般苗圃黃瓜的枯萎病發(fā)病率為20%～50%，嚴(yán)重的可達(dá)80%以上。土壤是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的樞紐[2]，負(fù)責(zé)物質(zhì)與能量交換，而土壤酶作為土壤中具有高度催化作用的蛋白質(zhì)，主導(dǎo)著土壤中與物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化有關(guān)的生物化學(xué)過程[3]。土壤酶的生物活性指標(biāo)一直是土壤酶學(xué)研究的重點(diǎn)，并逐漸成為土壤微生物生態(tài)效應(yīng)研究的重要方向和領(lǐng)域[4-7]。土壤酶活性的高低可較有效地反映土壤中各種生化反應(yīng)的強(qiáng)度和方向，代表著土壤中物質(zhì)代謝的旺盛程度，是土壤肥力的重要指標(biāo)[8]。脲酶是土壤中最活躍的水解酶類，是廣泛存在于細(xì)菌、真菌和高等植物中的酰胺酶，與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)質(zhì)含量等密切相關(guān)，能水解土壤中的尿素，釋放出供作物利用的銨，其活性與土壤肥力水平顯著相關(guān)[9]。土壤過氧化氫酶活性與土壤的呼吸強(qiáng)度及土壤微生物活動(dòng)相關(guān)，是重要的土壤微生態(tài)環(huán)境指示因子，可以表現(xiàn)出土壤氧化還原的能力[10]，能有效防止過氧化氫的毒害[11]。堿性磷酸酶屬于水解酶類，土壤中的有機(jī)磷在土壤磷酸酶的酶促作用下才能轉(zhuǎn)化為可利用的形態(tài)[12]。幾丁質(zhì)酶參與土壤有機(jī)碳和氮的轉(zhuǎn)化，可以將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨基糖，是土壤中礦質(zhì)氮的主要來源[13-14]。

芽孢桿菌是一類好氧和兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌[15]，對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，可以將物質(zhì)轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)成分供給植物或者刺激土壤中微生物的繁殖以增強(qiáng)土壤肥力，使植物處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)[16]。目前已有的研究大多是僅針對(duì)生防菌提高根際土壤中關(guān)鍵酶活性來進(jìn)行的，本研究中引入枯萎病病菌進(jìn)行生防菌的拮抗性試驗(yàn)。前期研究表明[17-19]，3株生防菌的施入不僅具有防病促生長(zhǎng)的作用，同時(shí)還能提高根際土壤中微生物類群的多樣性。因此，本研究將進(jìn)一步揭示3株生防芽孢桿菌對(duì)黃瓜根際土壤中4種關(guān)鍵酶活性的影響，為今后生防芽孢桿菌菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于聊城大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行，供試黃瓜品種為津優(yōu)1號(hào)。供試菌株為枯萎病病菌（Fusarium oxysporum），由天津科潤(rùn)黃瓜研究所分離保存;芽孢桿菌B579、2-1、9-2等3株生防菌株均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離并保存?？莶菅挎邨U菌B579從天津近郊蔬菜種植區(qū)根圍土分離所得，溫室盆栽試驗(yàn)表明，它對(duì)黃瓜枯萎病有顯著的抑制作用，并能促進(jìn)植物生長(zhǎng);枯草芽孢桿菌2-1從聊城市茌平縣杜郎口鎮(zhèn)中藥材種植基地感染根腐病的丹參根際土壤篩選分離得到，對(duì)丹參根腐病具有生物防治作用;解淀粉芽孢桿菌9-2從聊城本地感染根腐病的中藥材天南星的根際土壤中篩選分離得到，對(duì)天南星根腐病具有較好的生物防治作用?？菸〔【捎肞DA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);芽孢桿菌的培養(yǎng)采用LB液體和固體培養(yǎng)基。 酶活性測(cè)定選用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的土壤酶活性測(cè)定試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 菌液培養(yǎng) （1）芽孢桿菌菌液培養(yǎng)：將斜面保藏的生防芽孢桿菌B579、2-1、9-2菌種分別轉(zhuǎn)入內(nèi)裝30 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)15～16 h，獲得種子液。將1%種子液接種于內(nèi)裝100 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min恒溫振蕩15～16 h，培養(yǎng)結(jié)束后將菌液制備成 1×106 CFU/mL的發(fā)酵液[18]。（2）枯萎病病菌菌液培養(yǎng)：將枯萎病病菌FO在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)生明顯孢子，用無菌水制備成濃度為1×106 個(gè)/mL的孢子懸液。

1.2.2 試驗(yàn)處理 春季培養(yǎng)黃瓜幼苗至2～3張真葉，將幼苗移栽至直徑為30 cm、高為30 cm的花盆中，每盆2～3株幼苗，共計(jì)48盆。共設(shè)置8組處理，每組6個(gè)平行，分別為：① 空白處理（CK），清水澆灌;② 枯萎病病菌處理，枯萎病病菌FO菌液澆灌;③ B579處理，B579菌液澆灌;④ B579+FO拮抗處理，B579菌液+枯萎病病菌FO菌液等量澆灌;⑤ 2-1處理，2-1 菌液澆灌;⑥2-1+FO拮抗處理，2-1菌液+枯萎病病菌FO菌液等量澆灌;⑦ 9-2處理，9-2菌液澆灌;⑧ 9-2+FO拮抗處理，9-2菌液+枯萎病病菌FO菌液等量澆灌。①組澆灌清水50 mL，②③⑤⑦組接種量50 mL，④⑥⑧組接種量為生防菌液與枯萎病病菌菌液各50 mL。

1.2.3 菌液灌根處理 在黃瓜根部進(jìn)行菌液灌根處理。黃瓜在自然條件下，生長(zhǎng)周期為90～120 d，其生長(zhǎng)發(fā)育一般經(jīng)歷發(fā)芽期、幼苗期、初花期和結(jié)果期4個(gè)階段。因此每盆黃瓜從進(jìn)行菌液澆灌之日算起，分別在4、8、12和16周在各株黃瓜根際土壤約5～15 cm深處取樣，測(cè)定土壤堿性磷酸酶（ALP）、過氧化氫酶（AT）、幾丁質(zhì)酶、脲酶（UE）4種不同酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期不同處理對(duì)黃瓜根際土壤中堿性磷酸酶活性的影響

由圖1可知，生防菌處理（B579、2-1、9-2）酶活性變化趨勢(shì)與空白處理相似，均為在處理后4周和8周升高，在12周和16周降低，即變化趨勢(shì)為先升高后降低，且生防菌處理在16周時(shí)堿性磷酸酶活性均明顯高于空白處理組，其次為3組拮抗處理，枯萎病病菌FO處理酶活性最低，并且生防菌處理8周后酶活性逐漸降低，因此生防菌在堿性磷酸酶的酶活性中體現(xiàn)出其最佳使用周期為8周。

2.2 不同時(shí)期不同處理對(duì)黃瓜根際土壤中過氧化氫酶活性的影響

由圖2可知，空白處理組與生防菌B579、2-1和9-2處理基本都為先升高再降低的趨勢(shì)，這4種處理酶活性在整個(gè)生長(zhǎng)期都處于較高狀態(tài)，且在處理12周時(shí)均為最高酶活性，而后3種處理在整個(gè)生長(zhǎng)周期的酶活性均略高于對(duì)照，考慮為生防菌益生作用的結(jié)果。在8組處理的不同時(shí)期，F(xiàn)O處理組過氧化氫酶活性均處于最低狀態(tài)。FO處理與B579+FO，2-1+FO拮抗處理酶活性均處于先降低再升高再降低的趨勢(shì)，而9-2+FO拮抗處理則與生防菌處理組變化趨勢(shì)相同，含F(xiàn)O的4種處理最后的過氧化氫酶活性基本相同。此結(jié)果的原因考慮為在黃瓜的生長(zhǎng)過程中生防菌對(duì)FO病菌的拮抗作用由強(qiáng)變?nèi)踔敝料В瑢?duì)產(chǎn)生過氧化氫酶的微生物影響力逐漸減小，故4種處理過氧化氫酶活性在16周時(shí)基本相同。由此可見，由生防菌處理的黃瓜植株根際土壤過氧化氫酶活性在整個(gè)處理期均處于較高狀態(tài)，且其最佳使用周期為12周。拮抗處理組酶活性相對(duì)較低，但介于生防菌處理組與對(duì)照處理組之間，表明生防菌對(duì)土壤根際的過氧化氫酶活性能產(chǎn)生積極影響。

2.3 不同時(shí)期不同處理對(duì)黃瓜根際土壤中幾丁質(zhì)酶活性的影響

由圖3可知，空白處理組的幾丁質(zhì)酶活性變化趨勢(shì)為先升高再降低，而其他7組處理的酶活性變化趨勢(shì)為先升高再降低再升高。FO處理組在16周的酶活性仍低于同時(shí)期對(duì)照的酶活性。在生防菌（B579、2-1、9-2）處理和生防菌+FO（B579+FO、2-1+FO、9-2+FO）拮抗處理的比較中可以明顯看出，生防菌處理各時(shí)期幾丁質(zhì)的酶活性均高于相應(yīng)拮抗處理同時(shí)期的酶活性（除8周時(shí)的9-2）。由此可見，各處理與空白處理對(duì)于黃瓜根際土壤中的幾丁質(zhì)酶活性變化趨勢(shì)無太大相似性，而FO處理與各生防菌處理、拮抗處理組具有相同趨勢(shì)，且FO處理組的酶活性在各個(gè)時(shí)期仍為最低，并且生防菌處理8周后酶活性均明顯降低。

2.4 不同時(shí)期不同處理對(duì)黃瓜根際土壤中脲酶活性的影響

由圖4可知，在處理4周時(shí)空白處理組和生防菌處理土壤脲酶活性均較高，且在4個(gè)處理中的變化趨勢(shì)為先升高再降低再升高。而FO處理與各拮抗處理在4周時(shí)土壤脲酶活性均較低，且在4個(gè)處理中的變化趨勢(shì)基本與前面4組相似，即同為先升高再降低再升高，且8組處理在16周時(shí)根際土壤中脲酶活性均處于較高狀態(tài)。

3 討論

研究表明，3種生防芽孢桿菌B579、2-1、9-2均能提高黃瓜根際土壤的酶活性。在黃瓜根際施加生防芽孢桿菌菌液后，僅施加生防菌的3組處理的4種酶活性與空白處理的酶活性相比結(jié)果如下：僅施加生防菌的3個(gè)不同處理組各個(gè)取樣時(shí)期的堿性磷酸酶活性明顯高于對(duì)照;不同取樣時(shí)期過氧化氫酶活性均略高于空白處理，這一結(jié)果與曾慶賓等對(duì)微生物菌劑對(duì)烤煙根際土壤過氧化氫酶活性的研究結(jié)果[20]一致，而劉素慧等在EM（有效微生物）對(duì)連作大蒜根際土壤酶活性的影響中也得出了相似結(jié)論[21];各生防菌處理不同時(shí)期的幾丁質(zhì)酶活性相較于空白處理組在總體上同樣偏高;各生防菌處理組不同時(shí)期的脲酶活性與空白處理組相比均有提高，且其變化趨勢(shì)與尹淑麗等不同生防菌對(duì)黃瓜根際土壤酶活性的研究結(jié)果[1]一致。因此，總體上來說，生防芽孢桿菌可提高黃瓜土壤根際的4種不同土壤酶的活性，同時(shí)可說明生防菌對(duì)于植株的生長(zhǎng)具有促生作用。

在用枯萎病病菌FO處理后，可明顯發(fā)現(xiàn)FO處理組不同時(shí)期的4種酶活性相較于空白處理組均明顯降低。而各拮抗處理組的酶活性與FO處理組相比較的情況如下：不同時(shí)期的B579+FO、2-1+FO與9-2+FO 3組拮抗處理的堿性磷酸酶活性均明顯高于FO處理，且這3組處理的堿性磷酸酶活性高于空白處理組，低于對(duì)應(yīng)的僅加入生防菌的處理組，表明生防菌對(duì)于施加了枯萎病病菌的黃瓜根際土壤中堿性磷酸酶活性有較大影響;這3組處理不同時(shí)期的過氧化氫酶活性明顯高于FO處理組但低于空白處理組;拮抗處理組不同時(shí)期的幾丁質(zhì)酶活性相較于FO處理組的變化與堿性磷酸酶活性相似，這與王倡憲等對(duì)黃瓜苗期根系抗病相關(guān)酶活性的研究結(jié)果[22]相似;拮抗處理組不同時(shí)期的脲酶活性無明顯規(guī)律性，但總體能看出施加生防菌的FO的處理組脲酶活性較僅施加FO處理組高。根據(jù)4種不同酶活性的變化，在FO病菌存在的前提下，施加生防菌可提高黃瓜根際土壤的酶活性，聯(lián)系筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究[17，23]，說明生防菌對(duì)于枯萎病病菌存在較明顯的拮抗作用。但對(duì)于生防菌防病促生長(zhǎng)作用的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

在植株根際土壤中施入生防芽孢桿菌菌株可以提高土壤中的酶活性，從而可改善土壤結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤肥力，有利于土壤的健康發(fā)展。本研究通過設(shè)置多種對(duì)照處理研究不同生防菌對(duì)不同土壤酶活性的影響程度，表明生防菌不僅在植株生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到促生作用，而且對(duì)可能存在的致病菌起到拮抗作用，能有效防止枯萎病的發(fā)生，為今后生態(tài)環(huán)保型生防菌劑的開發(fā)和利用奠定了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]尹淑麗，麻耀華，張麗萍，等. 不同生防菌對(duì)黃瓜根際土壤微生物數(shù)量及土壤酶活性的影響[J]. 北方園藝，2012（1）：10-14.

[2]高吉坤，孫雨薇，曹 旭，等. 生防枯草芽孢桿菌B29對(duì)黃瓜根際功能細(xì)菌及土壤酶活性的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：107-110.

[3]張 昕，張立欽，林海萍，等. 引入黃瓜根圍的2株生防菌株的生態(tài)效應(yīng)[J]. 浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，24（6）：649-653.

[4]姜培坤，俞益武，張立欽. 雷竹林地土壤酶活性研究[J]. 浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，17（2）：132-136.

[5]王 娟，谷雪景，趙 吉. 羊草草原土壤酶活性對(duì)土壤肥力的指示作用[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25（4）：934-938.

[6]薛 冬，姚槐應(yīng)，何振立，等. 紅壤酶活性與肥力的關(guān)系[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，16（8）：1455-1458.

[7]Naseby D C，Pascual J A，Lynch J M. Effect of biocontrol strains of Trichoderma on plant growth，Pythium ultimum populations，soil microbial communities and soil enzyme activities[J]. Journal of Applied Microbiology，2000，88（1）：161-169.

[8]任旭琴，潘國(guó)慶，彭 莉，等. 芽孢桿菌菌劑對(duì)淮安紅椒連作土壤養(yǎng)分和酶活性的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，43（2）：239-243.

[9]邱莉萍，劉 軍，王益權(quán)，等. 土壤酶活性與土壤肥力的關(guān)系研究[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2004，10（3）：277-280.

[10]韓忠明，楊 頌，韓 梅，等. 不同菌劑對(duì)人參連作土壤酶活性的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，41（1）：50-53.

[11]馬云華，王秀峰，魏 珉，等. 黃瓜連作土壤酚酸類物質(zhì)積累對(duì)土壤微生物和酶活性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，16（11）：2149-2153.

[12]崔薈萍，趙桂琴，劉 歡. 除草劑對(duì)燕麥田土壤脲酶和堿性磷酸酶活性的影響[J]. 中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2014，36（1）：37-43.

[13]Ekenler M，Tabatabai M A. Beta-glucosaminidase activity of soils：effect of cropping systems and its relationship to nitrogen mineralization[J]. Biology and Fertility of Soils，2002，36（5）：367-376.

[14]王永生，于貴瑞，程淑蘭，等. 中國(guó)東部南北樣帶典型針葉林土壤酶活性分布格局[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，35（11）：3636-3642.

[15]張艷群，來航線，韋小敏，等. 生物肥料多功能芽孢桿菌的篩選及其作用機(jī)理研究[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2013，19（2）：489-497.

[16]張 霞，唐文華，張力群. 枯草芽孢桿菌B931防治植物病害和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[J]. 作物學(xué)報(bào)，2007，33（2）：236-241.

[17]陳 芳，韓德鐸，鄭 宇，等. 枯草芽孢桿菌B579抑真菌作用的初步研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：214-216.

[18]Chen F，Wang M，Zheng Y，et al. Quantitative changes of plant defense enzymes and phytohormone in biocontrol of cucumber Fusarium wilt by Bacillus subtilis B579[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26（4）：675-684.

[19]周 瑩，袁孟娟，韓 軍，等. 丹參根腐病生防芽孢桿菌2-1海藻菌劑的研制[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（1）：167-172.

[20]曾慶賓，李 濤，王昌全，等. 微生物菌劑對(duì)烤煙根際土壤脲酶和過氧化氫酶活性的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016，32（22）：46-50.

[21]劉素慧，劉世琦，張自坤，等. EM對(duì)連作大蒜根際土壤微生物和酶活性的影響[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2011，17（3）：718-723.

[22]王倡憲，李曉林，宋福強(qiáng)，等. 兩種叢枝菌根真菌對(duì)黃瓜苗期枯萎病的防效及根系抗病相關(guān)酶活性的影響[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，20（1）：53-57.

[23]周 瑩，袁孟娟，韓 軍，等. 中藥材丹參根腐病生防菌的分離與鑒定[J]. 北方園藝，2015（1）：145-147.蒙 成，黃艷花. 外引改良玉米自交系對(duì)廣西主要病害抗性鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（7）：111-115.