歸腎經(jīng)方對(duì)慢性腎纖維化大鼠β-Catenin、Col1、LN 表達(dá)的影響＊

鄭小利，黃招蘭，胡姍姍，艾 萌，吳文莉，謝 岱，馬 威＊＊

（1.武漢科技大學(xué)醫(yī)院 武漢 430065；2.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 武漢 430030）

對(duì)治療《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》中五臟分類疾病及肢體經(jīng)絡(luò)病的代表方與疾病歸經(jīng)的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)[1,2]，這些教材所用的經(jīng)方（或驗(yàn)方）非常強(qiáng)調(diào)病變部位與所選藥物歸經(jīng)的一致性，因此推測(cè)在辨證論治原則指導(dǎo)下，根據(jù)病位，歸經(jīng)選藥組方可以提高中藥療效[3]。本研究是在經(jīng)驗(yàn)方腎衰Ⅰ號(hào)的基礎(chǔ)上，選擇歸腎經(jīng)的藥物組方，觀察其干預(yù)5/6 腎切除大鼠腎纖維化進(jìn)程的療效及對(duì)Wnt經(jīng)典信號(hào)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠118 只（湖北省動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：4200601113、4200695028），體質(zhì)量200±10 g，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完成于武漢市第一醫(yī)院SPF 動(dòng)物室（SYXK（鄂）2014-030），動(dòng)物設(shè)施使用編號(hào)：No.00070368。動(dòng)物飼喂已輻照滅菌的維持飼料（北京華阜康公司），自由飲食，飲去離子水。動(dòng)物室內(nèi)12 h明暗交替，溫度21±1℃，濕度50%±10℃。

1.1.2 主要儀器

OLYMPUS AU2700 全自動(dòng)生化分析儀、Sysmex-1800i全自動(dòng)血球分析儀、圖像處理采用Biorad凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂公司）、PCR 儀（美國(guó)Thermo 公司），動(dòng)物代謝籠。

1.1.3 主要試劑

雙縮脲法測(cè)定總蛋白（Total Protein，Tp）試劑（批號(hào)：L1306054）、酶法測(cè)定肌酐（Creatinine，Cr）試劑（批號(hào)：D1308083）均購(gòu)于上海長(zhǎng)征公司；紫外-谷氨酸脫氫酶法檢測(cè)尿素（Blood Urea Nitrogen，BUN）試劑（批號(hào)：20131032）購(gòu)于上?？迫A公司；尿蛋白檢測(cè)試劑（批號(hào)）購(gòu)于北京利德曼生化股份有限公司。Fermatas 分子生物學(xué)試劑，引物合成于武漢奧科鼎盛生物科技有限公司；抗體購(gòu)于Abcam 公司，層粘連蛋白（laminin，LN）抗體（ab11575），膠原蛋白Ⅰ（Collagen，Col1）抗體（ab21287），β-Catenin，抗體（ab16051）。

1.1.4 治療藥物

治療用中藥飲片購(gòu)于我院草藥房，由湖北天濟(jì)中藥飲片公司提供。經(jīng)驗(yàn)方腎衰I 號(hào)（黃芪30 g、太子參15 g、白術(shù)12 g、茯苓12 g、枸杞12 g、生地12 g、紅花12 g、益母草12 g、川牛膝12 g、赤芍12 g、當(dāng)歸12 g、丹參12 g、木香6 g、厚樸12 g、熟大黃12 g）為B組，全部藥物均歸腎經(jīng)處方（黃芪30 g、西洋參15 g、山藥12 g、澤瀉12 g、枸杞12 g、生地12 g、雞血藤12 g、益母草12 g、川牛膝12 g、丹皮12 g、阿膠12 g、熟地12 g、沉香6 g、砂仁12 g、熟大黃12 g）為C 組，全部藥物均不歸腎經(jīng)處方（黃芪30 g、太子參15 g、白術(shù)12 g、薏苡仁12 g、麥冬12 g、玉竹12 g、紅花12 g、澤蘭12 g、川芎12 g、赤芍12 g、當(dāng)歸12 g、丹參12 g、木香6 g、厚樸12 g、熟大黃12 g）為A組。三首組方均為195 g·劑-1，按常規(guī)方法煎煮，濃縮至1.5 g·mL-1，按體重?fù)Q算后各組動(dòng)物灌胃劑量為17.25 g·kg-1大鼠（相當(dāng)于成人劑量）。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 5/6腎切除法制備腎纖維化模型[4]

上述動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組24 只和模型組94 只。造模動(dòng)物3%戊巴比妥50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，從左腹部切口打開腹腔，動(dòng)脈夾夾住左腎蒂后切除腎上下極（共切除2/3），以明膠海綿壓迫止血3 min，復(fù)位腎臟，逐層縫合，連續(xù)腹腔注射青霉素3 天。14 天后行第2 次手術(shù)，背部右側(cè)切口摘除右腎。假手術(shù)組采取同樣步驟暴露腎臟。自由飲食60天后（期間造模組死亡動(dòng)物15只），分別隨機(jī)從2組中各取12 只動(dòng)物，代謝籠收集24 h 尿液，記錄尿液容積并檢測(cè)尿蛋白濃度以計(jì)算24 h尿蛋白含量；禁食12 h，戊巴比妥腹腔注射麻醉后腹主動(dòng)脈采血，取腎組織，一部分4%多聚甲醛固定后備用，剩下分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分組治療

剩余造模組動(dòng)物67只，按體重采用分層隨機(jī)方法分為4 組：A 組16 只（灌胃A 方），B 組17 只（灌胃B方），C組17只（灌胃C方），模型組17只與假手術(shù)組動(dòng)物按相同劑量灌胃生理鹽水，連續(xù)60天。按1.2.1方法收集標(biāo)本。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 常規(guī)方法石蠟包埋，切片，HE染色。

1.3.2 Masson染色

用千屏軟件對(duì)Masson 三色法染色樣本進(jìn)行圖像分析，每張腎組織樣本連續(xù)取十個(gè)視野圖像，其中膠原纖維呈綠色為陽(yáng)性，用IPP6.0軟件計(jì)算上述10個(gè)圖片陽(yáng)性面積平均灰度值值為該樣本結(jié)果。各組與假手術(shù)組陽(yáng)性面積比例為該組膠原相對(duì)含量。

1.3.3 生化檢測(cè)

肝素抗凝血離心后分離血漿，以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血BUN、Cr、Tp；EDTA 抗凝血混勻后以全自動(dòng)血球分析儀檢測(cè)Hb；所收集的24 h尿液記錄尿量后，混勻取適量以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)24 h尿蛋白含量。

1.3.4 Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA 表達(dá)檢測(cè)

取各組冰凍保存腎組織50 mg，分別加1 mL Trizol提取總mRNA；經(jīng)核酸含量檢測(cè)，調(diào)整樣本量逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；分別取1 μL 分cDNA 進(jìn)行各指標(biāo)PCR。Wnt2上游引物5'-TCAGGAAAACAGGCGACTATCTC-3'，下游引物5'-GCCTCTCCCACAACACATAACTT-3'，退火溫度60℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度257 bp；GSK-3β上游引物5'-CATCCTTATCCCTCCTCACG-3'，下 游 引 物 5' -TATTGGTCTGTCCACGGTCT-3'，退火溫度55℃，產(chǎn)物長(zhǎng) 度96 bp；β-Catenin 上 游 引 物5'-CTTGGCTATTACGACAG ACT-3'，下 游 引 物5'-CAGCACCTTCAGCACTC-3'，退火溫度55℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度96 bp；LN物長(zhǎng)上游引物5'-ccccaatctctgcgaaccat-3'，下游引物5'-agaggattgcaagcaca cga-3'，退火溫度60℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度216 bp；Col1a1 上游引物5'-caggctggtgtgatggg att-3'，下游引物5'-cacctcgttctccagccttt-3'，退火溫度58℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度73 bp；GAPDH 上游引物5'-GGTGCTGAGTATGT CGTGGAG-3'，下 游 引 物5'-CAGTCTTCTGAGTGG CAGT GAT-3'，退火溫度56℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度98 bp；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（120V，50 mA），Biorad 成像系統(tǒng)掃描成像，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，并分別與各自GAPDH結(jié)果進(jìn)行比較計(jì)算各組指標(biāo)表達(dá)相對(duì)含量。

1.3.5 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)LN、COL1、β-Catenin表達(dá)

經(jīng)烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、滅火內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、山羊血清封閉抗原、一抗孵育（LN或COL1，1∶80稀釋；β-Catenin，1∶100稀釋）過(guò)夜、二抗標(biāo)記、DAB染色、蘇木素復(fù)染及中性樹膠封片完成IHC染色；結(jié)果判斷：以棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)。用千屏圖像采集系統(tǒng)連續(xù)采集每張玻片連續(xù)10個(gè)視野圖像，IPP6.0軟件計(jì)算每張圖片陽(yáng)性表達(dá)的灰度值，再計(jì)算該樣本的平均灰度值。以空白組（LN、Col1、β-Catenin）表達(dá)為1，并計(jì)算各組相對(duì)表達(dá)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若不符合正態(tài)分布則進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化；再進(jìn)行方差同質(zhì)性檢驗(yàn)，若方差齊則接受方差結(jié)果并用LSD法進(jìn)行兩兩比較，若方差不齊，則用Tamhane法進(jìn)行兩兩比較。以P ＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

分組治療過(guò)程中，假手術(shù)組大鼠狀態(tài)良好，生長(zhǎng)及攝食無(wú)明顯異常，毛發(fā)光亮整齊，無(wú)死亡；模型組大鼠精神萎靡，飲食減少，消瘦，毛發(fā)枯槁，且脫毛，期間死亡6只；A組死亡1只；B組死亡2只；C只死亡1只。經(jīng)檢驗(yàn)，各治療組之間死亡率沒有差異（P ＞0.05）。

2.2 造模2月時(shí)，各組動(dòng)物體質(zhì)量、Hb比較

造模2 月，與假手術(shù)組比較，模型組體質(zhì)量、Tp、Hb 顯著降低（P ＜0.05），BUN、Cr 含量顯著增高（P ＜0.01）（表1）。

表1 造模2月部分生化結(jié)果比較(n=12)

2.3 治療60天時(shí)，各組動(dòng)物體質(zhì)量、Hb比較

治療60天后，與假手術(shù)組比較，模型組體質(zhì)量、Hb顯著降低（P=0.000）；與模型組比較，三治療組體質(zhì)量均顯著增高（P=0.000），C 組Hb 含量顯著增高（P=0.000）；與C 組比較，A、B 組Hb 顯著降低（P=0.010,0.024）（表2）。

表2 治療后各組生化與Hb比較

2.4 各組動(dòng)物血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白比較

與假手術(shù)組比較，模型組BUN、Cr、24 h 尿蛋白含量顯著增高（P=0.000）；與模型組比較，三治療組BUN、Cr、24 h尿蛋白含量均顯著降低（P=0.000）（表2）。

2.5 治療60天時(shí)，各組腎組織Masson染色比較

經(jīng)方差檢驗(yàn)，各組Masson染色結(jié)果之間有顯著性差異（F=160.304，P=0.000）。與假手術(shù)組比較，模型組膠原含量顯著增高（P=0.000）；與模型組比較，三治療組膠原含量均顯著降低（P=0.000）；與C 組比較，A組膠原含量顯著增高（P=0.011），B 組與之沒有差異（P=0.916）（圖1，表3）。

2.6 各組動(dòng)物Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA表達(dá)比較

方差齊性檢驗(yàn)顯示，Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA 表達(dá)量的Lenvene 值分別為11.143，4.685，6.339，2.975，2.780（P 值分別為0.000，0.002，0.000，0.026，0.034），說(shuō)明方差不齊。與假手術(shù)組比較，模型組Wnt2、GSK-3β、β-Catenin。與、LN、Col1a1 mRNA表達(dá)均顯著增高（P=0.000）；與模型組比較，各治療組Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA表達(dá)均顯著降低（P=0.000）；A、B 組與C 組LN、Col1a1 mRNA表達(dá)沒有差異（P ＞0.05）（表3，圖2）。

表3 各組腎組織GSK-3β、Wnt2、β-catenin、LN、Col1a1 mRNA表達(dá)比較(±sd)

表3 各組腎組織GSK-3β、Wnt2、β-catenin、LN、Col1a1 mRNA表達(dá)比較(±sd)

與Sham組比較，*P ＜0.05,**P ＜0.01；與model比較，#P ＜0.05,##P ＜0.01；與C組比較，■P ＜0.05

Group n Masson染色Wnt2 GSK-3β β-catenin LN Col1a1 Sham 12 0.967±0.093 1.466±0.161 0.416±0.062 0.416±0.057 1.272±0.368 1.352±0.405 Model 11 8.560±1.359**2.505±0.597**0.784±0.062**0.828±0.067**2.726±0.662**2.393±0.672**A 15 3.143±0.977##■0.462±0.104##■0.510±0.064##0.517±0.064##1.501±0.343##1.616±0.434##B 15 2.335±0.617##0.611±0.116##0.322±0.070##0.378±0.058##1.471±0.354##1.540±0.402##C 16 2.086±0.473##1.100±0.200##0.394±0.101##0.408±0.072##1.432±0.351##1.451±0.291##F(P)160.304(.000)186.555(.000)91.809(.000)59.665(0.000)23.118(0.000)10.387(0.000)

圖2 各組腎組織GSK-3β、Wnt2、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA表達(dá)比較

表4 各組腎組織LN、Col1表達(dá)比較(IHC)(±sd)

表4 各組腎組織LN、Col1表達(dá)比較(IHC)(±sd)

與Sham組比較，*P ＜0.05,**P ＜0.01；與model比較，#P ＜0.05,##P ＜0.01；與C組比較，■P ＜0.05

Group n LN Col1 β-Catenin Sham 12 0.642±0.327 0.811±0.268 0.968±0.430 Model 11 1.302±0.396**1.441±0.397*8.332±1.441**A 15 1.020±0.210#1.075±0.218■5.814±0.915##■B 15 0.951±0.259##0.943±0.211 4.143±1.071##C 16 0.928±0.237##0.844±0.202#3.728±0.871##F(P)10.121(0.000)9.569(0.000)32.257(0.000)

2.7 各組動(dòng)物腎組織Col1、LN、β-Catenin 表達(dá)比較（IHC）

方差齊性檢驗(yàn)顯示，腎組織LN、COL1、β-Catenin ，表達(dá)量的Lenvene 值分別為0.373、0.000、0.000（表4，圖3-5）。與假手術(shù)組比較，模型組LN、COL1、β-Catenin，表達(dá)均顯著增高（P=0.001，0.042、0.000）；與模型組比較，C 組COL1 表達(dá)顯著降低（P=0.047），A、B、C 三組LN、β-Catenin，表達(dá)均顯著降低（P=0.013，0.002，0.001，0.005，0.003，0.000）。

圖3 各組腎組織Col1表達(dá)比較（IHC）（460倍）

圖4 各組腎組織LN表達(dá)比較（IHC）（400倍）

3 討論

中藥歸經(jīng)理論是以臟腑經(jīng)絡(luò)理論為基礎(chǔ)，是中藥藥理理論的一個(gè)重要組成部分。歸經(jīng)理論的論述可以溯至《黃帝內(nèi)經(jīng)》之《素問(wèn)·至真要大論》“夫五味入胃，各歸所喜，故酸入肝，苦先入心……”，表明味對(duì)機(jī)體不同部位有選擇性，即某種味主要入（或走或行）某一臟腑；《名醫(yī)別錄》最早指出藥物入某臟腑的性能，如韭歸心，蒜歸脾腎等；張仲景在《傷寒雜病論》中論述了部分藥物對(duì)人體臟腑經(jīng)絡(luò)某部位的特殊作用和適應(yīng)范圍；金元時(shí)期形成了比較系統(tǒng)的藥物歸經(jīng)理論，張?jiān)卦凇墩渲槟摇分惺状斡涗洸糠炙幬飳儆凇澳承薪?jīng)藥”或“某經(jīng)藥”，正式提出歸經(jīng)學(xué)說(shuō)，并倡導(dǎo)分經(jīng)分部位用藥，李東恒、王好古均對(duì)歸經(jīng)的內(nèi)容進(jìn)行了充實(shí)和完善，李東恒列出了十二經(jīng)脈專藥，《湯液本草》專門記錄了80余種入、走、到經(jīng)的藥物?！皹I(yè)醫(yī)不知臟腑，則病源莫辨，用藥無(wú)方”。歸經(jīng)將臟腑辨證中的病證與藥物作用于人體的部位聯(lián)系起來(lái)，而藥物的作用部位取決于病的定位，因此中藥歸經(jīng)與病的定位有密不可分的聯(lián)系?！凹膊w經(jīng)”是指在辨證基礎(chǔ)上辨明病位，為選擇相應(yīng)歸經(jīng)的藥物指示方向[5]。

圖5 各組腎組織β-Catenin表達(dá)比較（IHC）（與HC比較）

對(duì)《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》中五臟疾病遣方用藥歸經(jīng)的統(tǒng)計(jì)表明，疾病的五臟定位與所用藥物的歸經(jīng)趨向一致，如治療心系疾病的藥物多數(shù)歸心經(jīng)（175味，占治療心系疾病全部藥物歸經(jīng)38%，最多）；治療肺系疾病的藥物多數(shù)歸肺經(jīng)（216 味，占44%，最多）；治療肝系疾病的藥物多數(shù)歸肝經(jīng)（192 味，占29%，最多）；治療脾系疾病的藥物多數(shù)歸脾經(jīng)（121 味，占37%，最多）；治療腎系疾病的藥物歸心經(jīng)藥（175 味，占30%，最多），歸腎經(jīng)藥37 味，占10%，交其他系疾病歸腎經(jīng)藥物占比增加1 倍。這些經(jīng)方（或驗(yàn)方）中的藥物歸經(jīng)有主有次，一方面說(shuō)明方中藥物使用有明確的目的，主要針對(duì)病變部位用藥；另一方面人體內(nèi)各臟腑之間的關(guān)聯(lián)性（整體觀及五行傳變）[6]?！吨嗅t(yī)內(nèi)科學(xué)》中肢體經(jīng)絡(luò)疾病并未納入五臟分類，治療肢體經(jīng)絡(luò)病的藥物歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)顯示以歸肝經(jīng)者最多，說(shuō)明肢體經(jīng)絡(luò)病證歸結(jié)于肝經(jīng)[7]，據(jù)此，潘靜等[8]以當(dāng)歸拈痛湯為驗(yàn)方，調(diào)整其中歸肝經(jīng)藥物的含量（由6.7%調(diào)整至46.7%），而調(diào)整后的當(dāng)歸拈痛湯對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者在降低血尿酸水平和緩解急性期癥狀上明顯優(yōu)于原方（P ＜0.05）。本研究亦是在此理論指導(dǎo)下，組成的歸經(jīng)方，歸腎經(jīng)藥物比例從13.5%提高至34.1%。

Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路在生物進(jìn)化過(guò)程中的一條極為保守而又繁雜的信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞的遷移、增殖、分化、凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程，在腎臟，該信號(hào)途徑參與腎臟的發(fā)育，以及多囊腎、糖尿病腎病、急性腎損傷、腎腫瘤等多種疾病的發(fā)病過(guò)程。正常情況下Wnt 信號(hào)靜默，胞質(zhì)中僅有少量β-Catenin 游離，絕大多數(shù)β-Catenin 與E-cadherin 形成復(fù)合體；而由GSK-3β；、Axin（骨架蛋白）和APC（結(jié)直腸腺瘤性息肉基因產(chǎn)物）組成的降解復(fù)合物促使游離的β-Catenin被蛋白酶降解，從而維持胞內(nèi)β-Catenin的低水平。Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路在腎纖維化進(jìn)程中的地位已經(jīng)得到腎病學(xué)者的認(rèn)同[9-11]，Wnt蛋白通過(guò)激活下游的各種因子，促進(jìn)β-Catenin 在胞質(zhì)及胞核中過(guò)度聚集，促進(jìn)目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，生成各種相關(guān)炎癥介質(zhì)及致纖維化因子，最后導(dǎo)致腎細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)分化，形成腎臟纖維化[12]。LN是種大分子多功能糖蛋白，可識(shí)別細(xì)胞表面受體是基膜與細(xì)胞緊密結(jié)合，是基膜的主要成分，對(duì)基膜的構(gòu)建和穩(wěn)定有重要作用[13]。

本研究顯示，三治療組均能降低β-Catenin 的聚集和表達(dá)，降低COL1的基因表達(dá)，層粘連蛋白表達(dá)均顯著降低，而歸腎經(jīng)組膠原蛋白表達(dá)顯著降低，其他兩治療組沒有顯著性差異（與模型組比較），推測(cè)三治療組均能通過(guò)Wnt/β-Catenin 號(hào)途徑改善模型動(dòng)物纖維化狀態(tài)，歸腎經(jīng)組在改善貧血狀態(tài)、降低腎組織膠原蛋白表達(dá)上更明顯，但三治療組之間Wnt 經(jīng)典信號(hào)通路的主要蛋白β-Catenin等基因的表達(dá)上沒有差異，其調(diào)節(jié)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。