基于ERK 表達探討針刺干預大型實驗動物豬心肌缺血效應的初步觀察＊

張金鈴，李 亮，榮培晶，孟 宏，田 毅，何 勛，賈術永，張今朝，李少源，趙 斌，周晟芳，劉 歡，孫銘鴻，張 峰，雷洪濤，方繼良

（1.中國中醫(yī)科學院針灸研究所 北京 100700；2.北京工商大學植物資源研究開發(fā)北京市重點實驗室北京 100048；3.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院 北京100037；4.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院北京 100053；5.中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心 北京 100700）

細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal regulated protein kinase,ERK1/2）、c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、p38和細胞外信號調(diào)控酶組成絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）蛋白酶超家族。ERK1/2 以介導損傷細胞為主，而在早期的損傷中，ERK 參與細胞的內(nèi)源性保護[1]。ERK 作為絲裂原活化蛋白激酶MAPK 家族的一員，它的信號傳遞途徑是調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育及分裂信號網(wǎng)絡的核心，ERK 信號通路的激活在細胞抗凋亡、增殖分化中有重要意義。既往研究亦證實MAPK通路相關蛋白在促進心肌細胞凋亡上扮演著重要角色，激活ERK 可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡有關，其確切機制等待進一步的研究探尋[2]。可見MAPK家族作為生物體內(nèi)重要信號轉導系統(tǒng)，其相關信號通路功能日漸顯著，而其中ERK通路是研究較廣泛的一類，未激活的ERK 受到一定的刺激后，將從細胞漿迅速穿越核膜，進而激活其偶聯(lián)的轉錄因子，調(diào)節(jié)相關靶向基因的轉錄，從而實現(xiàn)調(diào)節(jié)細胞產(chǎn)生生物學效應；心肌梗死是一類缺血性心臟疾病，心肌梗死區(qū)可觀察到大量的心肌細胞凋亡現(xiàn)象[3,4]，崔瑾等研究[5]證實埋針可促進心肌缺血后小型豬缺血心肌血管生成作用，并探討了其通過上調(diào)血管內(nèi)皮細胞生長因子蛋白表達量的作用機制。據(jù)推測到2020年，冠心病將成為人類高致死率的主要原因[6,7]，臨床和實驗研究證明針刺穴位是改善心肌缺血，提高心肌功能的傳統(tǒng)有效方法，穴位埋針的干預手段對缺血心肌有明顯的保護作用，可減輕缺血導致的損傷程度，可上調(diào)心肌細胞轉化生長因子-?3mRNA和相關蛋白含量，促進心肌脈絡損傷的修復、再生-血管新生來改善缺血性損傷[8]，因而研究該通路對于進一步闡明心肌缺血保護的生理病理機制和探索針灸防治效應具有重要臨床意義，故本研究從ERK 蛋白表達為切入點來探索針灸防治慢性心肌缺血效應的分子生物學機制，期望能夠為針灸防治心血管疾病提供相關理論參考。

大型實驗動物豬的心臟冠狀動脈解剖結構及血流動力學生理病理特點與人類相近，其慢性心肌缺血模型更符合缺血性心肌病的臨床病理生理過程[9]，手術操作視野相對于小動物更加清晰，更易于操控；而大量臨床基礎研究也證實了針刺在臨床和實驗上用于治療心臟疾病的療效肯定，但機理尚不完全清楚[10-13]。本研究采用手術蛋白縮窄環(huán)及埋置電針應用于大型實驗動物豬來建立干預慢性心肌缺血模型的實驗方法，探討其效應機制[14-16]，本文作為系列研究的一部分，將從調(diào)節(jié)細胞凋亡及生存信號重要通路之一的ERK1/2 蛋白表達水平繼續(xù)追索證實模型方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

采用普通級巴馬小型豬，體重18-30 kg，許可證號為SCXK（京）2015-004。實驗取材分三組：正常對照組、慢性心肌缺血模型組、針刺組。動物由普通環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水，分籠飼養(yǎng)，每天視動物攝食情況補充標準實驗豬飼料，術前適應性喂養(yǎng)7 天。實驗程序符合倫理要求（倫理批號2013-1-25-973）

1.2 主要儀器試劑

華佗牌針灸針：直徑0.25 mm（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品）；7號埋線針直徑0.7毫米（中港合資鎮(zhèn)江高冠醫(yī)療器械有限公司）；G3H 型多參數(shù)動物監(jiān)護儀（深圳市杰納瑞醫(yī)療儀器有限公司）；AM811型麻醉機（北京易世恒電子技術有限責任公司）；韓氏穴位神經(jīng)刺激儀：型號HANS-200A（韓氏南京濟生醫(yī)療科技有限公司）；MultiSkan3 酶標儀和Fresco 低溫冷凍離心機（Thermo 公司）：戊巴比妥鈉鹽：Genview 分裝，批次：lot37H10520:BCA蛋白定量試劑盒（賽諾博公司）。

1.3 普通級小型巴馬豬心肌慢性缺血模型制備改良方法

參照文獻[17,18]改良造模方法如下：麻醉后采取靜脈維持麻醉狀態(tài)進行氣管插管，呼吸機輔助呼吸，連接心電監(jiān)護儀備用。于左側第3肋間前外側開口約10 cm，剪開心包，鈍性分離游離出冠狀動脈左前降支，血管鉗夾持住Ameroid 環(huán),使環(huán)的側口對準血管，在左冠狀動脈左前降支第一對角支分叉處以下約1cm 處放置Ameroid 縮窄環(huán)（如圖1、圖2 箭頭所示）?？s窄環(huán)內(nèi)徑為雙層環(huán)，內(nèi)層為吸水后會膨脹的酪蛋白，縮窄環(huán)植入完畢后，觀察心律的變化約5 min，如無異常無出血及縮窄環(huán)位置有無阻礙血流，可關閉心包，逐層關胸。待自主呼吸恢復平穩(wěn)后，拔除氣管插管，送回動物房[19]。

圖1

圖2

1.4 干預方法

造模后四周進行穴位埋針后第一次電針，造模后六周第二次進行穴位電針。電針內(nèi)關、足三里穴參數(shù)為：2 Hz、6 mA、20 min。參考文獻[5]方法進行穴位定位埋置電針，埋針前注意消毒處理，按豬針灸穴位圖譜同時對比人類經(jīng)脈循行規(guī)律方法于小型豬后肢取穴足三里穴，前肢取穴內(nèi)關穴；將7 號埋線針的內(nèi)芯取出，每段截取1.5 cm，并用砂紙將內(nèi)芯的兩端打磨光滑，把截取的7號埋線針內(nèi)芯通過9號針套管刺入一側內(nèi)關或足三里皮下肌層，紗布包好針孔防止出血；埋針保留在體內(nèi)到此次實驗結束。每次電針前將毫針刺入埋針穴位處，接通韓式電針儀；各項指標檢測前進行電針干預，將實驗豬麻醉后行電針干預。

1.5 指標檢測

1.5.1 透射電鏡心肌細胞線粒體損傷評分

損傷評分分級方法為電鏡標本隨機選取10 個視野，觀察每視野線粒體損傷情況，分別統(tǒng)計各個評級標準的線粒體數(shù)量，最后按照各個評級標準打分，用總分除以總個數(shù)得出標本的線粒體損傷平均得分。得分越高，則說明損傷越嚴重。分為0-4級，分別為0-4分：0分，線粒體結構正常，充滿顆粒；1分，線粒體結構基本正常，基質(zhì)顆粒少量丟失缺乏；2分，線粒體腫脹，基質(zhì)透明；3 分，線粒體嵴斷裂，基質(zhì)凝固、透明和濃聚；4分，線粒體嵴消失，內(nèi)膜和外膜降解，完整性缺失，嵴消失，空泡樣變。

1.5.2 Western blot 檢測心肌細胞細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated protein kinase,ERK）ERK1/ERK2蛋白表達

（1）首先組織蛋白抽提，預冷PIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑。在蛋白抽提開始前加入0.1PMSF母液，PMSF終濃度為1 mM。稱取組織重量以重量：裂解液體積=1∶9 比例加入裂解液，F(xiàn)luka 電動組織勻漿器15000 rpm轉速進行勻漿，每次10秒，間隔10秒，進行三次勻漿。勻漿時EP 管需要浸入冰水混合物中進行降溫。勻漿完成后再冰上孵育20 分鐘，4 度離心，13000 rpm，20 分鐘。離心完成后取上清，分裝保存，待測。

（2）BAC 法蛋白定量、蛋白濃度調(diào)整，根據(jù)目的蛋白的分子量，配制12%的分離膠，濃縮膠濃度為5%進行目的蛋白和內(nèi)參蛋白的正式實驗：Stripping Buffer于37 攝氏度洗膜30 分鐘，進入去離子水和TBST 各洗膜3次，將膜完全浸沒5%脫脂奶粉-TBST中室溫輕搖30分鐘后室溫孵育內(nèi)參2小時，再次洗膜后二抗孵育2小時后洗膜，ECL 加到膜上反應后膠片曝光顯影定影后掃描分析結果，條帶的對比亮度代表ERK蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS23.0 軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標準誤（±SE）表示。所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布，多組間比較采用重復測量的方差分析。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義的標準。

2 結果

2.1 心肌細胞線粒體損傷評分（圖3）

如圖3 所示：心肌慢性缺血模型組3.767±0.033（n=3）細胞損傷評分與正常對照組0.367±0.167（n=3）比較，評分升高差異有顯著性（**P ＜0.01），表示心肌細胞受損明顯，造模成功；針刺穴位組3.867±0.042（n=6)心肌同樣出現(xiàn)損傷評分升高，與缺血模型組比較差異不顯著（P ＞0.05），此結果意義表明，慢性心肌缺血造模成功，本實驗的針刺穴位參數(shù)沒有起到抑制心肌受損的效應。

圖3 各組心肌損傷評分

圖4 各組心肌細胞ERK蛋白直方圖

圖5 各組心肌ERK蛋白表達情況

2.2 心肌細胞ERK1/2蛋白表達的變化

圖4、5所示結果顯示：ERK1/2的灰度與內(nèi)參比值來反應ERK的蛋白表達量，缺血模型組0.155±0.018/0.116±0.035（n=4）與正常對照組0.047±0.014/0.017±0.021(n=3)比較心肌細胞ERK1/2 蛋白表達有增強升高趨勢，但沒有統(tǒng)計學差異；電針穴位組0.532±0.087/0.460±0.076（n=6）與缺血模型組比較，ERK1/2的表達顯著增強，差異具有統(tǒng)計學意義（**P ＜0.01），電針穴位具有上調(diào)ERK1/2蛋白表達的效應。

3 討論

研究表明細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated protein kinase ERK）信號通路參與缺血預處理的調(diào)節(jié)作用，ERK信號傳導通路在缺血耐受的形成機制中有著重要作用[20]。既往研究電針大鼠“內(nèi)關”抗心肌肥厚機制，發(fā)現(xiàn)可能與抑制Raf/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/ERK信號通路激活有關[21],心肌細胞凋亡發(fā)生過程中ERK1/2 是重要通路，起著關鍵效應[22],激活此通路就可能提高心肌細胞的活性，抑制細胞壞死[23],而針刺可以改善心肌缺血損傷[24]。ERK1/2 信號通路，位于MAPK 信號通路的下游，外界刺激首先激活Ras進一步激活Raf，Raf激活MEK1/2,進而活化ERK1/2，ERK1/2 進入細胞核，激活啟動相應轉錄因子的轉錄[25-27]。本實驗設計在前期工作[19]的基礎上增加了不做干預的慢性心肌缺血組做為模型對照，分為正常、模型和針刺三組，從ERK蛋白表達層面來研究埋置電針的效應途徑。實驗結果顯示慢性心肌缺血模型組ERK1/2 蛋白表達較正常心肌細胞有增加趨勢，這一趨勢與近年研究結果大鼠心肌梗死后磷酸化MEK 及其下游ERK 的表達量與正常心肌相比明顯的增高一致[28]，缺氧可能激活ERK 通路。針刺組穴位埋置電針后心肌細胞的ERK1/2 蛋白明顯增多，表達上調(diào)，說明穴位埋置電針后可能在一定條件下是通過調(diào)動了ERK 表達，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，使心肌細胞凋亡減少，從而產(chǎn)生對心肌缺血性損傷的保護作用。

本實驗心肌細胞線粒體損傷程度的評分參照文獻[29-32]使用flamenging 評分標準分級評分，在前期形態(tài)學觀察[19]的基礎上進行了量化評分分析，統(tǒng)計結果發(fā)現(xiàn)慢性心肌缺血造模手術后缺血模型組損傷評分升高明顯，細胞受損嚴重，而針刺穴位組與模型組比較評分沒有差別，也就是埋置電針的方法沒有起到防治缺血損傷的效應，說明手術后導致了心肌細胞線粒體的損傷模型成功，造模方法可行。雖然本研究組前期統(tǒng)計分析研究結果[33]表明：電針心肌缺血模型豬的內(nèi)關穴可延長ST 段及T 波時限，減慢心率，從而減少心肌耗養(yǎng)量達到保護心肌作用。但是本實驗中補充缺血模型組參照后埋置電針的方法并不能抑制已經(jīng)造成缺血損傷細胞的線粒體變異損傷的程度，需要繼續(xù)探索適宜的針灸參數(shù)與心肌缺血損傷程度的效應關系。

另一方面，Ameroid蛋白縮窄環(huán)的使用是目前國際上公認的應用廣泛的制備慢性心肌缺血模型方式，主要用于大型實驗動物豬和犬等，蛋白縮窄環(huán)是由酪蛋白吸濕物組成，外包鋼圈環(huán)，造模時可置于冠狀動脈左回旋支，吸濕物緩慢吸收組織液后向內(nèi)膨脹，壓迫動脈2-4 周后達到完全堵塞冠狀動脈[34-35]。本研究根據(jù)Ameroid蛋白縮窄環(huán)緩慢吸水膨脹變窄，導致冠狀動脈漸進性阻塞逐漸發(fā)展到心肌缺血狀態(tài)而引起病變的特性制備慢性心肌缺血模型，與現(xiàn)有的急性心肌缺血模型相比，更適合充分反映病變心肌的具體狀況，更符合冠狀動脈粥樣硬化病變的慢性過程。

以往研究未從現(xiàn)代分子生物ERK 蛋白表達角度探討施與埋置電針的干預方法對缺血心肌保護的細胞分子機制，課題系列研究埋置電針的療法應用于大型實驗動物心肌缺血模型豬的設計屬創(chuàng)新性研究，是追尋開拓中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究方法學范例的探索研究。

綜上所述，本研究中的心肌損傷評分統(tǒng)計結果說明手術放置蛋白縮窄環(huán)于左前降支的大型實驗動物豬模型可行，而埋置電針穴位可能在一定損傷范圍內(nèi)通過上調(diào)ERK 表達途徑來發(fā)揮增強機體保護心肌細胞缺血損傷的效應。后續(xù)研究可以增加例數(shù)從而進一步從ERK 蛋白表達角度來探討證實針刺治療大型實驗動物豬心肌缺血模型的可行性以及發(fā)揮埋置電針效應的慢性心肌缺血程度范圍的確定。

總之，應用于大型實驗動物模型豬的系列探索實驗，不足之處是由于實驗周期長、流程復雜、動物死亡率偏高、實驗標本數(shù)量較少，具有一定的局限性；雖然在一定程度上可為臨床操作提供參考，但具有統(tǒng)計學趨勢的指標可以繼續(xù)增加樣本量來進一步證實效應，同時具體的療效也有待于后期大樣本實驗來驗證。