轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控對中藥材質(zhì)量形成的作用＊

肖 瑩，馮婧嫻，陳萬生＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與生物技術(shù)中心 上海 201203；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院藥學(xué)部 上海 200003）

道地藥材因其具有優(yōu)良的種質(zhì)資源，產(chǎn)于適宜的生態(tài)環(huán)境，以致較同種藥材在其他地區(qū)所產(chǎn)者臨床功效地道實在、療效可靠，千百年來受到藥材市場的推崇。藥材的道地性主要體現(xiàn)在質(zhì)優(yōu)（有效成分含量高）和形優(yōu)（獨特的生物學(xué)性狀，包括色澤、形態(tài)等）兩個方面[1]。以三七為例，道地產(chǎn)區(qū)云南文山所產(chǎn)三七的主要有效成分如多糖、三七素、三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Rd以及總皂苷的含量均顯著高于廣西靖西；同時單株鮮重和產(chǎn)量比廣西靖西的高3-5倍[2]。然而，隨著需求量的增加，道地藥材野生資源日益匱乏，當(dāng)前藥材品質(zhì)低下和資源不可持續(xù)已經(jīng)成為制約中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展最大的瓶頸[3]。揭示和闡明道地藥材形成規(guī)律及其生態(tài)、生物學(xué)實質(zhì)，對道地藥材資源的保護(hù)和開發(fā)，發(fā)展中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

道地藥材獨特品質(zhì)的形成是特定種質(zhì)與環(huán)境飾變長期交互作用的結(jié)果，即“表型=基因型+環(huán)境飾變”。優(yōu)良品質(zhì)遺傳基因是道地藥材形成與發(fā)展的內(nèi)在因素。遺傳因素通過決定“代謝特質(zhì)”與“形態(tài)特征”對道地藥材品質(zhì)形成發(fā)揮主導(dǎo)作用；環(huán)境因子通過“調(diào)控基因時空特異表達(dá)”間接影響藥材品質(zhì)[4]。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是植物基因表達(dá)調(diào)節(jié)最重要的環(huán)節(jié)之一。轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控最重要的成員，在細(xì)胞核內(nèi)特異性識別并結(jié)合基因啟動子上的順式作用元件調(diào)控基因的時空表達(dá)，發(fā)揮中樞核心調(diào)控作用，參與植物生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)控及抗逆反應(yīng)等各個關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。越來越多的報道表明轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控藥用植物“代謝特質(zhì)”與“形態(tài)特征”方面均發(fā)揮了重要作用，且有些轉(zhuǎn)錄因子可同時對兩個方面發(fā)揮調(diào)控作用從而影響有效成分的合成積累與生物學(xué)形態(tài)的塑造形成。因此，轉(zhuǎn)錄因子有可能是道地藥材“質(zhì)優(yōu)”與“形優(yōu)”的關(guān)聯(lián)紐帶之一，為從分子層面闡述道地藥材形成規(guī)律和內(nèi)在機制，進(jìn)而開展藥材品質(zhì)提升和資源保障提供了重要的切入點（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控中藥材質(zhì)量形成的作用

1 轉(zhuǎn)錄因子對藥用植物“代謝特質(zhì)”的調(diào)控作用

中藥有效成分是中藥具有確切臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)。有效成分的有無（真?zhèn)危┒喙眩▋?yōu)劣）是中藥品質(zhì)的核心部分，有效成分的含量已成為評價中藥品質(zhì)的主要內(nèi)容和制定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)[6]。有效成分的高效合成和/或穩(wěn)定積累是道地藥材貨真質(zhì)優(yōu)最重要的因素之一。

中藥有效成分屬于植物次生代謝產(chǎn)物的范疇，包括酚類、黃酮類、木脂素、生物堿、糖苷、萜類、甾類、皂苷等。這些植物次生代謝產(chǎn)物不僅對植物自身的生存和生長具有重要意義，同時也是中草藥發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，即中藥有效成分[7]。例如：萜類化合物青蒿素是植物青蒿抗瘧疾的有效成分；生物堿類化合物鹽酸小檗堿是黃柏治療腹瀉的有效成分；丹參酮和丹參酚酸類化合物是丹參治療心腦血管疾病的有效成分。

通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物次生代謝途徑酶基因表達(dá)，整體激活中藥有效成分生物合成路徑，是實現(xiàn)中藥有效成分高效合成和定向積累的有效途徑，已取得許多令人興奮的研究進(jìn)展。多種轉(zhuǎn)錄因子如bHLH、bZIP、WRKY、AP2/ERF 等均參與藥用植物中包括萜類，生物堿類，苯丙烷及其衍生物類等多種次生代謝產(chǎn)物的合成積累[8-10]。例如：青蒿中的青蒿素是一種倍半萜類化合物，作為目前世界范圍內(nèi)治療瘧疾的首選藥物而受到廣泛關(guān)注，其生物合成途徑逐漸被研究清晰。轉(zhuǎn)錄因子AaERF1 和AaERF2 通過與青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因ADS 和CYP71AV1的啟動子結(jié)合激活青蒿素生物合成途徑，調(diào)控青蒿酸和青蒿素的高效合成[11]；同樣，轉(zhuǎn)錄因子AaORA，AaTAR1，AaGSW1均通過調(diào)控ADS 和CYP71AV1 的表達(dá)影響青蒿素、青蒿酸和二氫青蒿酸等化合物的生物合成[12]。目前應(yīng)用較廣的天然抗腫瘤成分長春堿和長春新堿是來源于藥用植物長春花的萜類吲哚生物堿，其生物合成受到甲基茉莉酸（MeJA）響應(yīng)的AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族成員ORCA3 的影響。ORCA3 可直接作用生物合成途徑上TDC、STR、CPR等多種關(guān)鍵酶，影響長春堿和長春新堿的合成。而bHLH轉(zhuǎn)錄因子BIS1能與環(huán)烯醚萜路徑的G8O 等關(guān)鍵酶基因互作，促進(jìn)長春花中萜類吲哚生物堿的生物合成[13]；本課題組從丹參中分離獲得了信號分子甲基茉莉酸MeJA 響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子SmMYC2a 和SmMYC2b，并發(fā)現(xiàn)他們與SmHCT6、SmCYP98A14 等酶互作同時調(diào)控丹參酚酸類和丹參酮類成分的生物合成[14]；我們從菘藍(lán)（板藍(lán)根的基源植物）中分離獲得了AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子Ii049，并發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子通過參與水楊酸SA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控落葉松脂素等板藍(lán)根抗病毒活性成分的生物合成[15]。

2 轉(zhuǎn)錄因子對藥用植物“形態(tài)特征”的調(diào)控作用

道地藥材的品質(zhì)形成是道地藥材的基因型和特定的生態(tài)環(huán)境長期飾變的共同作用，與非道地藥材相比，通常顯現(xiàn)出獨特的生物學(xué)性狀。例如，寧夏枸杞較其他產(chǎn)區(qū)者，粒大、色紅、肉厚、質(zhì)柔潤、籽少；懷地黃的根更加粗壯；甘肅岷縣的當(dāng)歸主根肥大而長，支根少而粗壯，內(nèi)外質(zhì)地油潤，氣味清香。道地藥材這些獨特的生物學(xué)性狀與藥材的品質(zhì)密切關(guān)聯(lián)。傳統(tǒng)“辨狀論質(zhì)”方法即是以特定形態(tài)特征作為中藥品質(zhì)評判的標(biāo)準(zhǔn)，在藥材商品的鑒定、規(guī)格分級等生產(chǎn)實踐中廣泛應(yīng)用[16]。以丹參為例，現(xiàn)行的丹參商品規(guī)格，一等品丹參需主根直徑＞1 cm，表面紫紅色或黃紅色，斷面紅色或棕色；二等品則直徑介于0.4-1 cm之間[17,18]。此外，大量丹參種質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，葉型[19,20]；株型[21]；花色[22]等性狀也與丹參的品質(zhì)具有顯著的相關(guān)性。因此，挖掘影響藥材特定形態(tài)特征形成的關(guān)鍵遺傳基因是揭示道地藥材優(yōu)良品質(zhì)形成機制的重要內(nèi)容之一。

轉(zhuǎn)錄因子對藥用植物形態(tài)特征的調(diào)控作用近年來聚焦于青蒿素儲存分泌的產(chǎn)所青蒿腺毛發(fā)育的相關(guān)研究中。青蒿葉片上分布的腺毛發(fā)育增強，密度增大，或者處于分泌期的數(shù)量增多等，都可能提高青蒿中青蒿素的產(chǎn)量。MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族成員參與青蒿腺毛的生長發(fā)育過程，在過量表達(dá)AaMYB1的青蒿植株中，腺毛的數(shù)量顯著增加[23]；另一個MYB 家族轉(zhuǎn)錄因子AaMIXTA1主要在分泌型腺毛的兩個基細(xì)胞中優(yōu)勢表達(dá)，能夠促進(jìn)分泌型腺毛的生成，增加腺毛的密度[24]；轉(zhuǎn)錄因子AaHD1 通過參與茉莉酸介導(dǎo)的腺毛生成過程促進(jìn)腺毛的生成[25]；而AaHD8 不僅能夠直接激活青蒿角質(zhì)層生物合成途徑上的基因，還能促進(jìn)AaHD1的表達(dá)，甚至可以與AaMIXTA1互做形成調(diào)控complex進(jìn)一步促進(jìn)腺毛的生成和角質(zhì)層的形成[26]。本課題組通過調(diào)控AP2轉(zhuǎn)錄因子AaTAR1促進(jìn)了青蒿腺毛的發(fā)育[27]。以上轉(zhuǎn)錄因子對青蒿腺毛發(fā)育的調(diào)節(jié)作用，為促進(jìn)青蒿素在青蒿植物中的生物合成創(chuàng)造了良好的條件，均大幅提高了青蒿素的含量。

在一些模式植物的研究中，能夠調(diào)控組織器官生長發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子也相繼被報道。其中擬南芥中的LHY 轉(zhuǎn)錄因子能夠影響開花時間[28,29]；而AtMYB35，AtMYB80，AtMYB33，AtMYB65等會影響花藥的發(fā)育[30-33]；AtMYB26通過調(diào)控木質(zhì)素的合成影響藥室內(nèi)壁次生壁加厚來影響花藥開裂等多種方式影響花的生長發(fā)育[34]。轉(zhuǎn)錄因子ABI4通過誘導(dǎo)一系列脫落酸ABA 相關(guān)反應(yīng)基因的表達(dá)，或與bZIP 轉(zhuǎn)錄因子ABF3 等相互作用影響植物側(cè)根的生成[35,36]。以上研究為揭示紅花、西紅花等以花入藥，丹參、板藍(lán)根等以根入藥的藥材的形態(tài)特征形成機制提供了有益借鑒，有望通過轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控獲得與中藥品質(zhì)相關(guān)聯(lián)的預(yù)期生物學(xué)性狀或形態(tài)特征，進(jìn)而達(dá)到中藥品質(zhì)改良和提升的目的。例如，本課題組發(fā)現(xiàn)MADS 轉(zhuǎn)錄因子家族基因AGL6 表達(dá)與西紅花的柱頭發(fā)育密切關(guān)聯(lián)，推測其可能通過改變柱頭生物量調(diào)控西紅花酸等藥效成分的生物合成；我們通過轉(zhuǎn)錄因子IiWRKY34 調(diào)控板藍(lán)根的根系發(fā)育，不僅有效增加了板藍(lán)根的產(chǎn)量，顯著促進(jìn)了抗病毒活性木脂素類成分的生物合成，還提高了植物抗鹽、抗旱的能力。

3 小結(jié)與展望

基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、生物信息學(xué)等組學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，極大加速了轉(zhuǎn)錄因子的分離、篩選和功能研究的進(jìn)程，也為解密道地藥材品質(zhì)形成機制復(fù)雜命題帶來了前所未有的契機。從轉(zhuǎn)錄因子入手，揭示其對中藥“代謝特質(zhì)”和“形態(tài)特征”的調(diào)控作用，是解析這一復(fù)雜命題的有效途徑，對實現(xiàn)道地藥材種質(zhì)資源保存、選用乃至品質(zhì)提升與遺傳育種具有重要意義。

當(dāng)前，藥用植物野生資源日漸耗竭，人工栽培品已逐漸成為中藥材的主要來源。針對當(dāng)前藥材品質(zhì)低下和資源不可持續(xù)的問題，如何人為地提高種植藥材的質(zhì)量，保證其與道地藥材的品質(zhì)相類同，這是從事中藥材工作的同仁們共同面臨的新課題。本課題組長期聚焦“基于藥效物質(zhì)的中藥品質(zhì)調(diào)控”研究，秉承“質(zhì)量源于設(shè)計”的研究理念，形成了“組學(xué)數(shù)據(jù)獲得與挖掘→品質(zhì)形成機制發(fā)現(xiàn)和驗證→目標(biāo)導(dǎo)向的品質(zhì)改良和優(yōu)化→質(zhì)量評價→種質(zhì)創(chuàng)新”的中藥材種質(zhì)資源評價及創(chuàng)制的研究思路。我們以丹參、板藍(lán)根等大宗藥材為對象，在闡釋其品質(zhì)形成機制的基礎(chǔ)上，開展優(yōu)良種質(zhì)識別、培育、種植和推廣研究：將中藥材品質(zhì)關(guān)聯(lián)的遺傳基因（如轉(zhuǎn)錄因子等）作為分子標(biāo)記（Q-Marker），對種質(zhì)識別、種苗選育和栽培管理等各關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行全程質(zhì)量監(jiān)控，促進(jìn)植株優(yōu)良性狀的形成，從而實現(xiàn)藥材品質(zhì)的“精準(zhǔn)調(diào)控”。我們相信，隨著道地藥材品質(zhì)形成機制的深入研究，轉(zhuǎn)錄因子等遺傳基因?qū)χ兴幤焚|(zhì)調(diào)控作用的逐漸闡明，藥材種植“精準(zhǔn)調(diào)控”技術(shù)的逐步推廣，優(yōu)質(zhì)藥材的獲得模式從“被動篩選”向“主動創(chuàng)制”的轉(zhuǎn)變將得以實現(xiàn)。