代謝組學(xué)技術(shù)在抗結(jié)核新藥研發(fā)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

古秀娟 曾婭莉 鄧建軍 霍婷婷 王玉琳 楊潔

中圖分類號(hào) R52；R378.91+1；R96 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）04-0560-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.26

摘 要 目的：了解代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌（MTB）代謝物及代謝途徑檢測(cè)的研究情況，為開(kāi)發(fā)治療耐藥MTB感染的安全新藥提供參考。方法：以“結(jié)核分枝桿菌”“代謝組學(xué)”“藥物靶點(diǎn)”“藥物研發(fā)”等的中英文為關(guān)鍵詞，在PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)中組合檢索2012年-2018年6月發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，并從抗結(jié)核藥物的新靶點(diǎn)（包括MTB脂代謝、能量代謝、氨基酸代謝、miRNA等途徑）、新抗菌化合物的篩選（主要是抑制MTB呼吸鏈的抗菌化合物）及抗結(jié)核新藥的臨床前評(píng)價(jià)等3個(gè)方面總結(jié)代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于抗結(jié)核新藥研發(fā)的研究進(jìn)展。結(jié)果與結(jié)論：共獲得相關(guān)文獻(xiàn)948篇，其中有效文獻(xiàn)40篇。應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，干擾脂代謝途徑的相關(guān)酶或基因等（如分枝菌酸、乙酰輔酶A羧化酶、脂酰輔酶A合成酶、泛酸等），干擾能量代謝的異檸檬酸裂解酶，抑制氨基酸代謝途徑中的色氨酸合成代謝途徑、β-碳酸酐酶合成途徑、丙酮酸激酶相關(guān)途徑，抑制miRNA調(diào)控途徑等均可作為抗結(jié)核藥物研發(fā)的新作用靶點(diǎn)。通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素bc1復(fù)合物QcrB的抑制劑Q203、QOAS，腺苷三磷酸合酶FoF1-ATP抑制劑，細(xì)胞色素AtpE抑制劑BDQ，二芳基喹啉（DARQS）等呼吸鏈抑制化合物，以及腺苷酸合成酶MbtA抑制劑、還原型輔酶Ⅰ脫氫酶Ⅱ抑制劑、蛋白酶ClpP和膜蛋白復(fù)合體3的抑制劑、脂肪?；?腺苷一磷酸（AMP）連接酶FadD32和聚酮合成酶的抑制劑等抗菌化合物。應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)分析藥物作用后機(jī)體的代謝變化，可為抗結(jié)核藥物的毒性、安全性、療效等評(píng)價(jià)提供技術(shù)手段。但目前對(duì)于代謝組學(xué)技術(shù)所獲數(shù)據(jù)的處理方法尚不完善，數(shù)據(jù)分析模型尚需進(jìn)一步完善與優(yōu)化；此外，國(guó)內(nèi)對(duì)代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于抗結(jié)核藥物研發(fā)的研究范圍較窄，且易漏掉對(duì)不穩(wěn)定的小分子和大分子代謝物的分析，因此需結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)或轉(zhuǎn)錄組學(xué)以更高效、準(zhǔn)確地為抗結(jié)核新藥研發(fā)提供支持。

關(guān)鍵詞 代謝組學(xué)技術(shù)；結(jié)核分枝桿菌；耐藥；靶點(diǎn)；抗菌化合物；新藥評(píng)價(jià)；藥物研發(fā)

結(jié)核病（Tuberculosis，TB）是一種慢性傳染性疾病，是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所致。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道，全世界范圍內(nèi)約有三分之一的人口感染MTB，每年約有800萬(wàn)新增病例，至少有300萬(wàn)人死于該病[1]。我國(guó)是MTB感染的大國(guó)，患病人數(shù)位居世界第2位，僅次于印度[2]。雖然早在20世紀(jì)中期已有大量抗結(jié)核藥物研發(fā)問(wèn)世并應(yīng)用于臨床，但由于TB病程長(zhǎng)、臨床用藥不規(guī)范、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染等原因，導(dǎo)致出現(xiàn)了耐藥結(jié)核分枝桿菌（DR-MTB）。因此，目前一線抗結(jié)核藥物如異煙肼、利福平等對(duì)DR-MTB感染的治療效果已不容樂(lè)觀，而多耐藥/泛耐藥MTB感染患者的增多使臨床治療變得更加棘手。因此，積極尋找、開(kāi)發(fā)治療耐藥性TB的有效新藥是一個(gè)刻不容緩的全球性重大課題。目前抗結(jié)核新藥研發(fā)主要包括3個(gè)方面內(nèi)容：（1）藥物作用新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)；（2）新抗菌化合物的篩選及合成；（3）抗結(jié)核藥物的臨床開(kāi)發(fā)（包括藥物臨床前研究和臨床研究。其中臨床前研究是藥物臨床開(kāi)發(fā)最為關(guān)鍵的步驟，涉及藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)、安全性評(píng)價(jià)、藥物化學(xué)等內(nèi)容）。其中，新作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)或新化合物的篩選及合成是抗結(jié)核新藥研發(fā)的基礎(chǔ)，而藥物評(píng)價(jià)是其臨床開(kāi)發(fā)的重要環(huán)節(jié)。

近年來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展并滲透到醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域，其通過(guò)對(duì)小分子代謝物的定量檢測(cè)，可放大基因和蛋白表達(dá)的細(xì)微變化；而且該類技術(shù)所需檢測(cè)的代謝物種類較基因和蛋白質(zhì)少，檢測(cè)所需樣本量少[3]。因此，可利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)所有小分子代謝物進(jìn)行系統(tǒng)分析，以所獲數(shù)據(jù)輔助抗結(jié)核新藥的開(kāi)發(fā)。筆者以“結(jié)核分枝桿菌”“代謝組學(xué)”“藥物靶點(diǎn)”“藥物研發(fā)”等的中英文為關(guān)鍵詞，在PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)中組合檢索2012年-2018年6月發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果，共獲得相關(guān)文獻(xiàn)948篇，其中有效文獻(xiàn)40篇。基于此，本文從抗結(jié)核藥物的新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、新抗菌化合物的篩選及抗結(jié)核新藥的臨床前評(píng)價(jià)等3個(gè)方面，總結(jié)代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于抗結(jié)核新藥研發(fā)的研究進(jìn)展，從而為該領(lǐng)域新藥的進(jìn)一步研發(fā)提供理論支持。

1 代謝組學(xué)技術(shù)用于抗結(jié)核藥研發(fā)的進(jìn)展

代謝組學(xué)是從20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，其通過(guò)檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量約在1 000以內(nèi)的內(nèi)源性小分子代謝物（如低分子油脂、氨基酸、醇、核酸、肽、有機(jī)酸、糖類、維生素等），從而研究這些代謝物的潛在作用；其主要研究方法包括核磁共振波譜法、質(zhì)譜法、色譜法等，其中以核磁共振波譜法應(yīng)用最為廣泛[4]。目前代謝組學(xué)的研究主要分為4個(gè)方面：①特定靶向分子檢測(cè)；②對(duì)某個(gè)代謝途徑進(jìn)行檢測(cè)，如脂代謝、能量代謝等；③對(duì)細(xì)胞內(nèi)外所有小分子代謝物進(jìn)行分析；④對(duì)機(jī)體所有小分子代謝物進(jìn)行非靶向性綜合研究，得到龐大數(shù)據(jù)集后找出差異代謝標(biāo)志物[5]。通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)得到的數(shù)據(jù)往往復(fù)雜多樣，故需要先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理（包括標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化以及數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換）再進(jìn)行分析。而對(duì)采用代謝組學(xué)技術(shù)獲得的龐大數(shù)據(jù)集，目前多采用基于回歸法分析數(shù)據(jù)間線性關(guān)系的數(shù)據(jù)分析模型進(jìn)行處理，主要包括主成分分析法和偏最小二乘法[6]。近年來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于抗結(jié)核藥物的研發(fā)。例如Chuang YM等[7]的研究結(jié)果顯示，無(wú)機(jī)多聚磷酸鹽是MTB生物膜形成的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。該研究組通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，缺乏ppx1基因或ppk2基因的MTB突變菌株細(xì)胞內(nèi)的多聚磷酸鹽出現(xiàn)聚集，而3-磷酸甘油、1-脫氧木酮糖-5-磷酸含量顯著減少，三羧酸循環(huán)代謝物精氨酸和還原型輔酶Ⅰ（NADH）顯著增加；而且ppk2基因缺陷的MTB菌株對(duì)白花丹素、美羅培南的敏感性增加，ppx1基因缺陷的MTB菌株對(duì)氯法齊明的敏感性增加，因此研究者認(rèn)為ppx1、ppk2基因可作為抗結(jié)核藥物作用的新靶點(diǎn)。馮鷺等[8]運(yùn)用代謝組學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，新型海洋放線菌株NH128的代謝物對(duì)MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv有明顯的抑制作用，這可為抗結(jié)核新藥的研發(fā)提供新思路。由此可見(jiàn)，代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，可為藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和抗菌藥物的尋找等提供技術(shù)支持。

2 代謝組學(xué)技術(shù)在抗結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

目前，TB的發(fā)病機(jī)制以及在人巨噬細(xì)胞中長(zhǎng)期潛伏生存的機(jī)制尚不十分清楚，再加上MTB耐藥率的增加，為T(mén)B患者的治療帶來(lái)巨大阻礙。而細(xì)胞內(nèi)許多生命活動(dòng)是發(fā)生在代謝物層面的，如細(xì)胞信號(hào)釋放、能量傳遞、細(xì)胞間通信等都是受代謝物調(diào)控的，因此MTB代謝物的檢測(cè)具有重要意義。本文從MTB脂代謝、能量代謝、氨基酸代謝、miRNA等途徑總結(jié)代謝組學(xué)技術(shù)在抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用。

2.1 脂代謝途徑

MTB感染宿主巨噬細(xì)胞后，以脂肪酸和膽固醇為主要碳源，在細(xì)胞內(nèi)不斷生成脂滴誘導(dǎo)細(xì)胞泡沫化，因此其毒力、致病性及存活狀態(tài)可能與其脂質(zhì)合成及代謝有關(guān)[9]。MTB細(xì)胞壁脂質(zhì)含量高（約占干質(zhì)量的60%），其細(xì)胞壁是一個(gè)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，參與調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、宿主細(xì)胞效應(yīng)分子和抗結(jié)核藥物的運(yùn)輸[10]。分枝菌酸是一類含60～90個(gè)碳原子的分支長(zhǎng)鏈β-羥基脂肪酸，也是MTB細(xì)胞壁的重要組成成分，在MTB毒力和致病性方面起著重要作用[11]。KasB是分枝菌酸合成的關(guān)鍵酶，其發(fā)生磷酸化后能減弱MTB的抗酸活性和毒力[12]。Vilchèze C等[12]采用體外串聯(lián)質(zhì)譜法和定點(diǎn)突變揭示了KasB發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)是在第334、336位的蘇氨酸；同時(shí)，將KasB基因缺失或KasB基因第334、336位發(fā)生突變的MTB缺陷菌株與親本菌株比較后發(fā)現(xiàn)，其脂代謝途徑受到干擾，代謝產(chǎn)物改變，脂肪酸底物攝取減少；且突變菌株的分枝菌酸缺少了4～6個(gè)碳原子并發(fā)生環(huán)丙烷化反應(yīng)，使MTB的抗酸活性和毒力均減弱。這表明，KasB及其編碼基因可作為抗MTB作用靶點(diǎn)。此外，Thompson AP等[13]利用代謝組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，MTB的生物素依賴酶乙酰輔酶A羧化酶（ACCs）在脂肪代謝和能量代謝中起關(guān)鍵作用，該酶也可作為抗MTB的作用靶點(diǎn)。

利用代謝組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，MTB引起的干酪樣壞死物主要成分和感染MTB的泡沫巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)成分基本一致，即主要為磷脂、膽固醇、膽固醇酯、三酰甘油[9]，由此提示MTB的致病性及其在泡沫巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活情況與其脂代謝有關(guān)。MTB的FadD3基因表達(dá)產(chǎn)物是脂酰輔酶A合成酶，該酶可影響MTB的脂代謝和膽固醇代謝。Casabon I等[14]運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)敲除了FadD3基因的MTB菌株后發(fā)現(xiàn)，其代謝產(chǎn)物明顯改變且致病性減弱，說(shuō)明脂酰輔酶A合成酶及其編碼/調(diào)控基因可作為抗MTB的作用靶點(diǎn)。泛酸是MTB脂質(zhì)合成酶的前體物質(zhì)，由PanC、PanD基因編碼。Slavik MC等[15]研究發(fā)現(xiàn)，敲除PanC、PanD基因的變異MTB菌株的脂肪酸底物濃度比正常菌株高且致病性更弱，表明泛酸合成途徑可成為抗MTB的作用靶點(diǎn)。還有學(xué)者運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)比較了野生型MTB與兩種rpoB基因突變型MTB菌株的脂代謝差異，結(jié)果顯示rpoB基因突變株在復(fù)制、生長(zhǎng)等生物活動(dòng)減弱的同時(shí)對(duì)脂肪酸底物的消耗量也有所減少[16]。因此，rpoB基因及其影響的脂代謝途徑可作為抗MTB的作用靶點(diǎn)。

MTB脂代謝途徑與其毒力和致病性密切相關(guān)，因此干擾脂代謝途徑的相關(guān)酶或基因等（如分枝菌酸、ACCs、脂酰輔酶A合成酶、泛酸等）均可作為抗結(jié)核藥研發(fā)的新作用靶點(diǎn)，通過(guò)對(duì)各個(gè)靶點(diǎn)的干擾來(lái)抑制MTB相關(guān)脂代謝途徑，從而達(dá)到治療TB的效果。

2.2 能量代謝途徑

在不利的環(huán)境條件下（如營(yíng)養(yǎng)限制、低氧張力或低/高pH值等），可能引起MTB代謝的廣泛適應(yīng)，使菌株進(jìn)入一個(gè)非常緩慢或不生長(zhǎng)的休眠狀態(tài)，在這一狀態(tài)下的MTB菌株細(xì)胞中腺苷三磷酸（ATP）水平比復(fù)制期菌株低5～10倍[17]。Eoh H等[18]利用代謝組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，休眠狀態(tài)的MTB能量代謝活性下降，進(jìn)而使其多種生物合成活性減弱，這也是MTB對(duì)靶向于蛋白質(zhì)、DNA和細(xì)胞壁生物合成的抗菌藥物（如鏈霉素、利福平、異煙肼等）敏感性降低的主要原因。因此，清除宿主體內(nèi)對(duì)抗菌藥物敏感性低的休眠狀態(tài)MTB是對(duì)抗急性、慢性或潛伏性結(jié)核感染的主要手段。Lee YV等[19]利用代謝組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MTB細(xì)胞中異檸檬酸裂解酶第322位點(diǎn)的賴氨酸突變?yōu)榫彼釙r(shí)，可使其乙醛酸旁路代謝途徑受阻，使休眠狀態(tài)的MTB無(wú)法從乙醛酸旁路獲取能量，從而殺傷休眠狀態(tài)的MTB。因此，異檸檬酸裂解酶可作為抗MTB的作用靶點(diǎn)。

2.3 氨基酸代謝途徑

生物體內(nèi)氨基酸代謝途徑復(fù)雜多樣，而MTB可從宿主的巨噬細(xì)胞內(nèi)攝取丙氨酸、谷氨酸/谷氨酰胺、天冬氨酸/天冬酰胺作為氮源[20]。如Gouzy A等[20]的研究表明，細(xì)菌蛋白AnsP2、AnsA運(yùn)轉(zhuǎn)和水解天冬酰胺后，可將天冬酰胺或其水解產(chǎn)物作為重要氮源，來(lái)保障MTB氨基酸合成代謝途徑的運(yùn)轉(zhuǎn)并有助于MTB抵抗宿主免疫，由此提示AnsP2、AnsA蛋白可作為抗MTB的作用靶點(diǎn)。周寧等[21]運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，TB患者體內(nèi)賴氨酸水平降低，谷氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸和色氨酸水平升高；張宗德等[22]研究發(fā)現(xiàn)，trpD（Rv2192c）基因編碼的鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶參與色氨酸的生物合成，抑制鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生及色氨酸的合成；Angeli A等[23]研究發(fā)現(xiàn)，L-色氨酸可激活MTB中由Rv3273基因編碼的β-碳酸酐酶，而抑制β-碳酸酐酶的活性可顯著抑制MTB的生長(zhǎng)。上述研究表明，氨基酸代謝途徑中的鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶途徑、色氨酸合成及代謝途徑、β-碳酸酐酶合成途徑可作為抗MTB的作用靶點(diǎn)。Noy T等[24]運(yùn)用非靶向性高敏感代謝組學(xué)技術(shù)的研究顯示，丙酮酸激酶的失活可導(dǎo)致MTB中磷酸烯醇式丙酮酸、烏頭酸等氨基酸積累。丙酮酸激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶，其可催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸和ATP，丙酮酸經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成輔酶A（CoA），CoA可作為三大代謝的前體物質(zhì)或直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)而產(chǎn)生ATP。而敲除丙酮酸激酶相關(guān)基因后發(fā)現(xiàn)，MTB在短鏈脂肪酸和葡萄糖組合的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)活動(dòng)減弱，推測(cè)其原因是丙酮酸激酶缺乏可抑制MTB三大代謝途徑且無(wú)法產(chǎn)生足夠的ATP供能，從而抑制MTB的活性和致病性。因此，與丙酮酸激酶相關(guān)的氨基酸代謝途徑也可作為抗MTB的作用靶點(diǎn)。

上述研究表明，氨基酸相關(guān)代謝途徑有望成為抗結(jié)核新藥的作用靶點(diǎn)，通過(guò)抑制氨基酸代謝途徑中的色氨酸合成代謝途徑、β-碳酸酐酶合成途徑、丙酮酸激酶相關(guān)途徑等可起到治療TB的作用。

2.4 miRNA途徑

miRNA是一類非編碼的單鏈微小RNA，在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用，可參與生命活動(dòng)進(jìn)程中的一系列重要過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、代謝、凋亡、自噬等[25]。目前，MTB的免疫逃避機(jī)制尚不十分清楚，但有研究表明miRNA在其中起重要作用。Von Both U等[26]研究發(fā)現(xiàn)，MTB在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖的免疫逃避現(xiàn)象是由hsa-miR-22、hsa-miR-199a、Alu等miRNA/DNA序列調(diào)控元件控制的。Pires D等[27]對(duì)MTB代謝物中miRNA進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-106b-5p可與組織蛋白S的mRNA-3′端非編碼區(qū)結(jié)合，從而避免巨噬細(xì)胞吞噬MTB后對(duì)其的殺傷作用；還能抑制T細(xì)胞的活化，從而避免未被吞噬的MTB被T細(xì)胞直接殺滅。Etna MP等[28]研究發(fā)現(xiàn)，MTB代謝物中的miR-155可抑制ATG3基因表達(dá)，從而抑制樹(shù)突細(xì)胞對(duì)MTB的吞噬及抗原提呈作用，避免MTB被機(jī)體免疫細(xì)胞殺滅。miRNA的檢測(cè)技術(shù)大多采用高通量的RNA測(cè)序技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)，但前者費(fèi)用昂貴，而后者檢測(cè)miRNA的靈敏度不高。目前代謝組學(xué)技術(shù)已可用于小分子核酸的檢測(cè)，雖然在MTB誘導(dǎo)表達(dá)的miRNA檢測(cè)方面的應(yīng)用較少，但是隨著其技術(shù)發(fā)展，其有望為miRNA的檢測(cè)提供新的技術(shù)支持。

利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)不同miRNA進(jìn)行分析，了解其在基因調(diào)控中的作用并作為抗MTB的作用靶點(diǎn)，進(jìn)而篩選或設(shè)計(jì)出相應(yīng)的抗miRNA靶點(diǎn)抑制劑，可為殺滅長(zhǎng)期生存于巨噬細(xì)胞中的MTB提供重要思路。

3 代謝組學(xué)技術(shù)在抗菌化合物篩選中的應(yīng)用

3.1 抑制MTB呼吸鏈的抗菌化合物

呼吸鏈?zhǔn)且粭l電子傳遞鏈，它將代謝物脫下的氫原子傳遞給氧生成水，同時(shí)合成ATP；其中ATP合酶是呼吸鏈途徑生成ATP的重要酶，而細(xì)胞色素復(fù)合物是呼吸鏈的重要組分[29]。近年來(lái)，抑制呼吸鏈新藥成為了一個(gè)新的藥物研發(fā)領(lǐng)域，可為抗DR-MTB新藥研發(fā)提供新的手段，而通過(guò)代謝組學(xué)高通量篩選技術(shù)已獲得ATP合酶或細(xì)胞色素bc1復(fù)合物的小分子抑制劑。MTB可以通過(guò)底物水平磷酸化或氧化磷酸化生成ATP，而當(dāng)MTB發(fā)生高密度突變或缺失突變時(shí)則不能通過(guò)底物水平磷酸化獲得足夠的能量，此時(shí)需要氧化磷酸化供能；在氧化磷酸化過(guò)程中，呼吸鏈的蛋白質(zhì)復(fù)合物在生物膜上建立一個(gè)質(zhì)子動(dòng)力（PMF），這個(gè)PMF的能量隨后被ATP合成酶用于生產(chǎn)ATP。ATP合成酶抑制劑等小分子化合物能阻止呼吸鏈的電子傳遞，破壞PMF，從而阻止ATP的產(chǎn)生，進(jìn)而起到對(duì)MTB的抑制作用[30]。因此Black PA等[30]通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)篩選得到ATP合成酶抑制劑BDQ，該化合物可對(duì)MTB發(fā)揮有效的抗菌作用。氧化磷酸化產(chǎn)生的能量對(duì)MTB的存活必不可少，如Bown L等[31]研究發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素bc1復(fù)合物QcrB的抑制劑Q203、QOAS，腺苷三磷酸合酶FoF1-ATP抑制劑，細(xì)胞色素AtpE抑制劑BDQ，二芳基喹啉（DARQS），這些抑制劑可抑制MTB呼吸鏈從而抑制ATP的產(chǎn)生，導(dǎo)致MTB因不能獲得足夠能量而最終死亡。Q203、QOAS、FoF1- ATP抑制劑、BDQ和DARQS等抗菌化合物的發(fā)現(xiàn)，為抗結(jié)核新藥的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

3.2 其他抗菌化合物

Berney M等[32]利用代謝組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，宿主體內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸和蛋氨酸的中間代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致MTB死亡，因此上述中間代謝產(chǎn)物可能開(kāi)發(fā)為新的抗菌化合物，但這一抗菌產(chǎn)物的作用機(jī)制未完全清楚。Viljoen A等[33]研究發(fā)現(xiàn)，親脂性的雙環(huán)磷酸鹽天然產(chǎn)物CYC可與MTB細(xì)胞壁的合成代謝有關(guān)的酶相結(jié)合，從而抑制MTB細(xì)胞中阿拉伯半乳聚糖霉菌酸化抗原85（Ag85）復(fù)合物的活性，而Ag85復(fù)合物有助于MTB侵入宿主細(xì)胞，且與MTB細(xì)胞壁的形成有關(guān)。利用代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)CYC作用后的MTB代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的脂代謝異常，脂肪酸、三酰甘油利用水平下降，表明MTB的脂合成途徑受到抑制，并推測(cè)CYC可通過(guò)影響Ag85復(fù)合物的活性從而抑制MTB的生長(zhǎng)和對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲。因此，CYC有望開(kāi)發(fā)為MTB的抗菌抑制劑。除此之外，耿葉慧等[34]總結(jié)了大量運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)篩選的MTB相關(guān)抗菌抑制劑，包括與鐵代謝有關(guān)的腺苷酸合成酶MbtA抑制劑、與能量代謝途徑有關(guān)的NADH脫氫酶Ⅱ（NDH-2）抑制劑、與膜運(yùn)轉(zhuǎn)途徑有關(guān)的蛋白酶ClpP和膜蛋白復(fù)合體3的抑制劑、與細(xì)胞壁合成相關(guān)的脂肪?；?腺苷一磷酸（AMP）連接酶FadD32和聚酮合成酶的抑制劑。

近年來(lái)，抑制呼吸鏈的新藥研發(fā)是國(guó)內(nèi)的熱門(mén)研究領(lǐng)域，利用代謝組學(xué)技術(shù)篩選抑制MTB呼吸鏈的小分子抑制劑是抗結(jié)核新藥研發(fā)過(guò)程中的一大進(jìn)步。除此之外，S-腺苷甲硫氨酸和蛋氨酸的中間代謝產(chǎn)物、CYC、MbtA抑制劑、NDH-2抑制劑、ClpP蛋白酶抑制劑、膜蛋白復(fù)合體3抑制劑、FadD32抑制劑等也有望成為新型MTB抗菌化合物。

4 代謝組學(xué)技術(shù)在抗結(jié)核新藥評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

利用代謝組學(xué)技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)藥物作用后機(jī)體的代謝變化，從而為藥物的毒性、安全性、療效等評(píng)價(jià)提供依據(jù)。目前，代謝組學(xué)技術(shù)用于抗結(jié)核中藥的研究較多，例如Jahromi HK等[35]利用代謝組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)蘭花提取物Salep具有抗氧化能力，對(duì)抗結(jié)核藥異煙肼導(dǎo)致的肝毒性有預(yù)防作用。而在抗結(jié)核藥物評(píng)價(jià)方面，關(guān)瑾等[36]研究發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核藥物的毒副作用會(huì)破壞體內(nèi)正常細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)、改變細(xì)胞的代謝，因此利用代謝組學(xué)技術(shù)獲得的體內(nèi)某種代謝物或生物分子的動(dòng)態(tài)變化可作為藥物毒性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。Das MK等[37]對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)給藥的TB患者的尿液進(jìn)行全程代謝動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，對(duì)其尿液中的上千種代謝物進(jìn)行綜合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，患者尿液的代謝譜發(fā)生明顯變化，并且這一變化比組織病理學(xué)觀察、血液生化指標(biāo)檢測(cè)和體質(zhì)量測(cè)定等毒性評(píng)價(jià)方法的結(jié)果更敏感，在監(jiān)測(cè)藥物毒性作用的發(fā)生與發(fā)展方面有很好的應(yīng)用前景。廖艷等[38]運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，某種抗結(jié)核藥物組的小鼠尿液中牛磺酸和葡萄糖水平明顯升高，檸檬酸和α-酮戊二酸水平明顯降低，表明該結(jié)核藥的毒性可能與三羧酸循環(huán)的能量代謝異常、線粒體功能異常以及葡萄糖代謝紊亂有關(guān)。此外，金文龍等[39]利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)新型抗結(jié)核藥物Bis-biguanide dihydrochloride（BBD）的代謝通路進(jìn)行研究，結(jié)果顯示BBD對(duì)卡介苗菌株的碳水化合物、嘌呤堿的代謝及氨基酸合成路徑影響較大，尤其對(duì)半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的代謝有抑制作用，表明BBD對(duì)MTB核糖體的氧化磷酸化等代謝通路有明顯的抑制作用。迪拉馬尼是一種新型多耐藥MTB抗菌藥物，Shimokawa Y等[40]將該藥與人或動(dòng)物血漿共同孵育，利用代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)到R-2-氨基-4，5-二氫噁唑衍生物為該藥的主要代謝物，并且確立了藥物半衰期、藥物作用適宜的溫度及pH值。

對(duì)抗結(jié)核藥物的毒性、安全性及療效等進(jìn)行評(píng)價(jià)是藥物研發(fā)的必經(jīng)過(guò)程。代謝組學(xué)作為新興發(fā)展的技術(shù)，為抗結(jié)核新藥研發(fā)提供了重要的技術(shù)手段。用藥后機(jī)體尿液的代謝物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、BBD的作用機(jī)制研究、迪拉馬尼代謝產(chǎn)物檢測(cè)及半衰期等的確定等成果都有助于抗結(jié)核新藥研發(fā)工作的進(jìn)一步開(kāi)展。

5 結(jié)語(yǔ)

運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)生物體小分子代謝物進(jìn)行綜合分析研究，可發(fā)現(xiàn)并明確MTB的特殊代謝途徑，進(jìn)而可為抗結(jié)核新藥的研發(fā)提供更多信息，包括：分枝菌酸、ACCs、脂酰輔酶A合成酶、泛酸等脂代謝途徑相關(guān)抗菌靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)；異檸檬酸裂解酶等能量代謝途徑相關(guān)抗菌靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)；色氨酸、β-碳酸酐酶、丙酮酸激酶等氨基酸合成代謝途徑相關(guān)抗菌靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)；與miRNA調(diào)控的免疫逃逸機(jī)制相關(guān)抗菌靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)；Q203、QOAS、FoF1-ATP酶、BDQ、DARQS以及其他MTB相關(guān)抗菌抑制劑等新抗菌化合物的發(fā)現(xiàn)；抗結(jié)核藥物的毒性、安全性、療效評(píng)價(jià)等。

通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)往往會(huì)得到海量的數(shù)據(jù)集，而目前對(duì)于海量數(shù)據(jù)處理的方法大多是基于回歸法探討代謝物之間的線性關(guān)系，但還難以從所獲代謝物的數(shù)據(jù)來(lái)精確反映藥物代謝的反應(yīng)速率等，而且對(duì)非線性數(shù)據(jù)的處理方法還不完善，因此代謝組學(xué)樣本數(shù)據(jù)處理分析模型仍需要進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)。此外，國(guó)內(nèi)目前關(guān)于代謝組學(xué)技術(shù)在抗結(jié)核藥研發(fā)中的研究范圍還比較窄，且容易漏掉對(duì)性質(zhì)不穩(wěn)定的小分子和大分子代謝物的分析，因此建議將代謝組學(xué)技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)或轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究相結(jié)合，多學(xué)科交叉融合，以更加高效、準(zhǔn)確地為抗結(jié)核新藥的研發(fā)提供多方位的技術(shù)支持。

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（收稿日期：2018-06-28 修回日期：2019-01-03）

（編輯：段思怡）