頸腰康膠囊的抗炎消腫藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

徐杰 姜文月 王雅儷 王美慧 魏曉雨 邊雨

中圖分類號(hào) R965.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）04-0478-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.10

摘 要 目的：研究頸腰康膠囊抗炎消腫藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，為該制劑的二次開發(fā)、質(zhì)量控制方法建立和技術(shù)改造升級(jí)提供依據(jù)。方法：采用不同溶劑以及大孔吸附樹脂法對(duì)頸腰康膠囊進(jìn)行組分提取分離，獲得A組分（總體富集部位）、B組分（氯仿萃取部位）、C組分（水層部位）和D組分（60%乙醇洗脫部位）。通過小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)和大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)，以醋酸地塞米松為陽性對(duì)照藥物，考察頸腰康膠囊及其不同提取部位（A、B、C、D組分）的抗炎消腫作用，篩選功效部位。采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS）解析功效部位，鑒定其中所含化合物并進(jìn)行組方藥材歸屬。結(jié)果：B組分（氯仿萃取部位）+D組分（60%乙醇洗脫部位）對(duì)大鼠或小鼠的抗炎消腫療效與頸腰康膠囊相當(dāng)，提示二者發(fā)揮了協(xié)同抗炎消腫作用，是頸腰康膠囊的功效部位。UPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)及鑒定結(jié)果顯示，B組分中含有士的寧、黃柏堿、杠柳苷元、石松四酮醇、11-羰基-β-乳香酸等13個(gè)化合物，分別歸屬于馬錢子、防己、香加皮、伸筋草、乳香等藥材；D組分中含有腺嘌呤、羥基紅花黃色素A、黃柏堿、Neoeriocitrin、姜狀三七皂苷R1等7個(gè)化合物，分別歸屬于地龍、紅花、防己、骨碎補(bǔ)、牛膝等藥材。結(jié)論：頸腰康膠囊具有顯著的抗炎消腫作用，其氯仿萃取部位與60%乙醇洗脫部位可能共同為其抗炎消腫的功效部位，所含主要成分為生物堿類、黃酮類及乳香酸類化合物。

關(guān)鍵詞 頸腰康膠囊；提取；分離；抗炎；消腫；超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)；活性成分；物質(zhì)基礎(chǔ)

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the anti-inflammatory and detumescent pharmacodynamic material basis of Jingyaokang capsule， and to provide reference for secondary development， the establishment of quality control method and technological upgrading of the preparations. METHODS： The constituents of Jingyaokang capsule were extracted and separated with different solvents and macroporous adsorption resin to obtain constituent A （overall enrichment part）， constituent B （chloroform extraction part）， constituent C （water-course part） and constituent D （elution part of 60% ethanol）. Using dexamethasone acetate as positive control， the anti-inflammatory and detumescent effects of Jingyaokang capsule and different extraction parts （constituents A， B， C， D） were investigated by mice ear edema and rat paw edema tests to screen the active fraction. UPLC-Q-TOF-MS method was used to analyze active constituent， identify compounds and attribute medicinal material. RESULTS： Anti-inflammatory and detumescent effects of constituent B （chloroform extraction part）+constituent D （elution part of 60% ethanol） were similar to those of Jingyaokang capsule in rats or mice， indicating both had synergistic anti-inflammatory and detumescent effects and were active constituents of Jingyaokang capsule. UPLC-Q-TOF-MS detection and identification showed that constituent B contained 13 compounds as strychnine， phellodendrine， periplogenin， tetraketone alcohol， 11-carbonyl-β-mastic acid， attributing to Strychnos nux-vomica， Stephania tetrandra， Periploca sepium， Lycopodium japonicum， Boswellia carterii， etc. Constituent D contained 7 compounds as adenine， hydroxysafflower yellow A， phellodendrine， neoeriocitrin， zingibroside R1， attributing to rainworm， Carthamus tinctorius， Stephania tetrandra， Davallia mariesii， Achyranthes bidentata， etc. CONCLUSIONS： Jingyaokang capsule shows the significant anti-inflammation and detumescent effects. The chloroform extraction part is synergistic with 60% ethanol elution part， which are the active constituents of anti-inflammation and detumescence，mainly including alkaloids， flavonoids and boswellic acids.

KEYWORDS Jingyaokang capsule； Extraction； Separation； Anti-inflammation； Detumescence； UPLC-Q-TOF-MS； Active constituent； Material basis

頸腰康膠囊是由制馬錢子、伸筋草、香加皮、乳香、沒藥、紅花、地龍、燙骨碎補(bǔ)、防己、牛膝等10味藥材組方的中成藥制劑，具有舒筋通絡(luò)、活血化瘀、消腫止痛的功效，主要用于骨折后瘀血及腫脹疼痛、骨折恢復(fù)期以及腎虛挾瘀所致痹痛（如增生性脊柱炎、腰椎間盤脫出癥）等的治療[1]。然而截至目前，尚未見有關(guān)于頸腰康膠囊抗炎消腫功效的具體活性成分的研究報(bào)道。本研究根據(jù)制劑中各組方藥材中不同成分的理化性質(zhì)，通過石油醚提取、水提醇沉、95%乙醇提取、氯仿萃取和大孔吸附樹脂分離等方法獲得各藥物組分；同時(shí)結(jié)合藥理學(xué)方法，通過小鼠耳廓腫脹與大鼠足跖腫脹等模型，考察不同提取部位的功效作用，篩選該制劑的抗炎消腫功效部位；然后運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS）解析所篩選的功效部位，根據(jù)相對(duì)分子量及串聯(lián)質(zhì)譜信息對(duì)各組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，明確功效活性成分，揭示頸腰康膠囊抗炎消腫藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，為該制劑的二次開發(fā)、質(zhì)量控制方法建立和技術(shù)改造升級(jí)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

JY2003型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；Acquity UPLC型液相色譜儀、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS型質(zhì)譜儀（包含四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)量分析器、MassLynx V4.1工作站等組件，美國Waters公司）；SB-1200D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

頸腰康膠囊（修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：160913，規(guī)格：0.33 g/粒）；醋酸地塞米松片（天津天藥藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：160313，規(guī)格：0.75 mg）；氯化鈉注射液（作為生理鹽水使用，吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1509290509，規(guī)格：500 mL ∶ 4.5 g）；二甲苯（北京化工廠，批號(hào)：20161020）；角叉菜膠（美國Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：1408463）；D101大孔吸附樹脂（天津市大鈞科技開發(fā)有限公司）；乙腈為色譜純，石油醚（30～60 ℃）、氯仿等試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為去離子水。

1.3 動(dòng)物

ICR小鼠108只，雄性，體質(zhì)量為18～22 g，生產(chǎn)許可證：SCXK（吉）-2011-0004；Wistar大鼠108只，雌雄各半，體質(zhì)量為180～220 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2016-0003。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，在溫度20.0～25.9 ℃、濕度40.0%～70.0%、換氣次數(shù)≥15次/h、12 h明暗交替的條件下飼養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 頸腰康膠囊組分的分離制備

取該制劑內(nèi)容物500 g，加石油醚700 mL，超聲（功率：300 W，頻率：50 kHz）脫脂20 min×3次，濾過，藥渣干燥。在石油醚脫脂藥渣中再加12倍量水（V/m，mL/g，以下同），加熱回流3 h，濾過；再加8倍量水，加熱回流3 h，濾過。合并2次提取上清液，70 ℃減壓濃縮至1 g（生藥）/mL；加適量95%乙醇使乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為80%，4 ℃靜置過夜醇沉；3 000 r/min離心5 min，收集上清液，4 ℃貯存待用。取水提藥渣，加6倍量95%乙醇，80 ℃加熱回流2次，每次1 h；合并2次提取液，并與上述水提醇沉上清液合并，50 ℃減壓濃縮至1 g（生藥）/mL；70 ℃減壓干燥，得到A組分。

取A組分樣品溶于適量水中，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至1～2，混勻待充分溶解后，加5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至11～12；以氯仿400 mL萃取3次，靜置分離。取氯仿層揮干溶劑，70 ℃減壓干燥，得B組分（氯仿萃取部位）。另取水層，70 ℃減壓干燥，得C組分（水層部位）。

取C組分樣品溶于適量水中，上樣至D101大孔吸附樹脂，依次用3倍柱體積的水、60%乙醇依次洗脫；收集60%乙醇洗脫液，50 ℃減壓濃縮至2 g（生藥）/mL；70 ℃減壓干燥，得D組分（60%乙醇洗脫部位）。

頸腰康膠囊各部位組分提取分離路線見圖1；各部位組分制備得率見表1。

2.2 頸腰康膠囊的抗炎消腫藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 給藥劑量確定 設(shè)定小鼠灌胃給藥體積為10 mL/kg，醋酸地塞米松片、頸腰康膠囊按臨床用藥劑量折算小鼠給藥劑量[2]，分別為150、450 mg/kg（以5%羧甲基纖維素鈉生理鹽水溶液溶解后給藥）；按表1中頸腰康膠囊各提取分離部位（A、B、C、D）制備得率折合計(jì)算其給藥劑量，分別為80、15、63、13 mg/kg（溶劑同前）。空白對(duì)照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水。

設(shè)定大鼠灌胃給藥體積為10 mL/kg，醋酸地塞米松片、頸腰康膠囊按臨床用藥劑量折算大鼠給藥劑量[2]，分別為100、313 mg/kg（溶劑同前）；按表1中頸腰康膠囊各提取分離部位（A、B、C、D）制備得率折合計(jì)算其給藥劑量，分別為54、10、44、9 mg/kg（溶劑同前）?？瞻讓?duì)照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水。

2.2.2 小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[3-4]方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取雄性小鼠108只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組（陽性對(duì)照）、頸腰康膠囊組、A組分組、B組分組、C組分組、D組分組、B+D組分組，每組12只，分別按“2.2.1”項(xiàng)下給藥劑量連續(xù)給藥5 d。于給藥第3天時(shí)，取二甲苯按20 μL/只涂抹于小鼠右耳內(nèi)外兩側(cè)；于末次給藥1 h后，用乙醚麻醉小鼠，再取二甲苯按20 μL/只涂抹于小鼠右耳內(nèi)外兩側(cè)?？瞻讓?duì)照組小鼠雙耳及其余組小鼠左耳始終不作任何處理。30 min后，處死小鼠，剪下其雙耳，用打孔器在相同部位打下圓形耳片并稱定質(zhì)量，計(jì)算小鼠耳廓腫脹度、腫脹率及腫脹抑制率。耳廓腫脹度（mg）=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量；腫脹率（%）=（右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量）/左耳片質(zhì)量×100%；腫脹抑制率（%）=（模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/模型組平均腫脹度×100%。各組小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

如表2所示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠耳廓腫脹度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明模型復(fù)制成功。與模型組比較，頸腰康膠囊組小鼠耳廓腫脹度顯著降低（P<0.01），表明頸腰康膠囊具有顯著的抗炎消腫效果。與頸腰康膠囊組比較，A組分組小鼠耳廓腫脹度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示A組分為頸腰康膠囊藥效成分的總體富集部位；而基于A組分分離制備的B、C、D 3個(gè)組分組小鼠的耳廓腫脹度與模型組比較雖顯著降低，但與頸腰康膠囊組比較仍顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明B、C、D 3個(gè)組分均未富集到頸腰康膠囊的藥效成分，提示其藥效組分間可能存在協(xié)同作用。與頸腰康膠囊組比較，B+D組分組小鼠耳廓腫脹度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明B組分與D組分聯(lián)合藥效與頸腰康膠囊相當(dāng)，提示二者具有協(xié)同抗炎消腫作用，可能共同作為頸腰康膠囊的抗炎消腫藥效活性物質(zhì)。

2.2.3 大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[5-7]方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取大鼠108只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組（陽性對(duì)照）、頸腰康膠囊組、A組分組、B組分組、C組分組、D組分組、B+D組分組，分別按“2.2.1”項(xiàng)下給藥劑量連續(xù)給藥5 d。于末次給藥1 h后，除空白對(duì)照組大鼠注射等量生理鹽水外，其余大鼠在右后足注射1%角叉菜膠溶液0.1 mL進(jìn)行致炎。測(cè)定致炎前和致炎后1、2、3、4 h時(shí)大鼠右后足跖容積，計(jì)算足跖腫脹度。腫脹度（mL）=致炎后足跖容積-致炎前足跖容積。各組大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

如表3所示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠足跖腫脹度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明模型復(fù)制成功。與模型組比較，頸腰康膠囊組大鼠足跖腫脹度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明頸腰康膠囊具有顯著的抗炎消腫功效。與頸腰康膠囊組比較，各組分組大鼠足跖腫脹度差異結(jié)果與“2.2.2”項(xiàng)下小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證明B組分與D組分聯(lián)合藥效與頸腰康膠囊相當(dāng)，二者具有協(xié)同抗炎消腫作用，可能共同作為頸腰康膠囊的抗炎消腫藥效活性物質(zhì)。

2.3 藥效組分質(zhì)譜解析

按“2.2”項(xiàng)下藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)頸腰康膠囊的功效部位B、D組分進(jìn)行質(zhì)譜解析。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；定量分析質(zhì)量掃描范圍：m/z 50～1 600 Da；電離源溫度：110 ℃；去溶劑氣溫度：300 ℃；錐孔氣、去溶劑氣均為氮?dú)猓涣魉俜謩e為50、600 L/h；負(fù)離子模式：毛細(xì)管電壓2.0 kV，提取錐孔電壓5.0 V，錐孔電壓35 V；正離子模式：毛細(xì)管電壓3.5 kV，提取錐孔電壓5.0 V，錐孔電壓35 V；全信息串聯(lián)質(zhì)譜（MSE）模式進(jìn)行二級(jí)分析，碰撞氣為氬氣，低碰撞能10 eV，高碰撞能30～50 eV。采用甲酸鈉建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以亮氨酸腦啡肽進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校正。

2.3.3 B組分質(zhì)譜解析 B組分質(zhì)譜分析總離子流圖見圖2。經(jīng)過一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜分析并參考文獻(xiàn)[8]，對(duì)各個(gè)峰進(jìn)行解析與鑒定，共鑒別13個(gè)化合物：1號(hào)峰為士的寧，2號(hào)峰為馬錢子堿，3號(hào)峰為偽馬錢子堿，4號(hào)峰為番木鱉次堿，歸屬于制馬錢子藥材；5號(hào)峰為黃柏堿，6號(hào)峰為防己諾林堿，7號(hào)峰為粉防己堿，歸屬于防己藥材；8號(hào)峰為杠柳苷元，歸屬于香加皮藥材；9號(hào)峰為石松四酮醇，歸屬于伸筋草藥材；10號(hào)峰為11-羰基-β-乳香酸，11號(hào)峰為11-羰基-β-乙酰乳香酸，12號(hào)峰為欖香酮酸，13號(hào)峰為乙?；?α-乳香酸，歸屬于乳香藥材。各化學(xué)成分分析鑒定結(jié)果見表4。

2.3.4 D組分質(zhì)譜解析 D組分質(zhì)譜分析總離子流圖見圖3。經(jīng)過一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜分析并參考文獻(xiàn)[8]，對(duì)各個(gè)峰進(jìn)行解析與鑒定，共鑒別7個(gè)化合物：1號(hào)峰為腺嘌呤，歸屬于地龍藥材；2號(hào)峰為羥基紅花黃色素A，3號(hào)峰為苯甲酸，歸屬于紅花藥材；5號(hào)峰為黃柏堿，歸屬于防己藥材；6號(hào)峰為Neoeriocitrin，7號(hào)峰為柚皮苷，歸屬于骨碎補(bǔ)藥材；9號(hào)峰為姜狀三七皂苷R1，歸屬于牛膝藥材。各化學(xué)成分分析鑒定結(jié)果見表5。

3 討論

本研究采用水和95%乙醇聯(lián)合提取，收集頸腰康膠囊中的主要成分；采用石油醚超聲前處理及水提液醇沉，去除樹脂類、多糖類、蛋白質(zhì)類成分[9-11]；水提醇沉上清液與95%乙醇提取液合并得A組分；A組分濃縮后以酸水溶解，以堿性氯仿萃取富集得生物堿類B組分，并分離出水層非生物堿類C組分[12-15]；采用D101大孔吸附樹脂對(duì)水層組分進(jìn)一步分離，以60%乙醇洗脫富集得黃酮類等D組分[16-18]。

本研究以藥效學(xué)指標(biāo)進(jìn)行篩選，證實(shí)提取分離得到氯仿萃取部位（B組分）與60%乙醇洗脫部位（D組分）可能共同為頸腰康膠囊抗炎消腫的活性組分。同時(shí)，將藥效學(xué)結(jié)果與化學(xué)成分的質(zhì)譜鑒定相結(jié)合，運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行成分鑒定。氯仿萃取部位共鑒別13個(gè)化合物，其中4個(gè)化合物歸屬于制馬錢子藥材，依次為士的寧、馬錢子堿、偽馬錢子堿、番木鱉次堿；3個(gè)化合物歸屬于防己藥材，依次為黃柏堿、防己諾林堿、粉防己堿；1個(gè)化合物歸屬于香加皮藥材，為杠柳苷元；1個(gè)化合物歸屬于伸筋草藥材，為石松四酮醇；4個(gè)化合物歸屬于乳香藥材，依次為11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、欖香酮酸、乙?；?α-乳香酸。60%乙醇洗脫部位共鑒別7個(gè)化合物，其中1個(gè)化合物歸屬于地龍藥材，為腺嘌呤；2個(gè)化合物歸屬于紅花藥材，依次為羥基紅花黃色素A、苯甲酸；1個(gè)化合物歸屬于防己藥材，為黃柏堿；2個(gè)化合物歸屬于骨碎補(bǔ)藥材，依次為Neoeriocitrin、柚皮苷；1個(gè)化合物歸屬于牛膝藥材，為姜狀三七皂苷R1。這一結(jié)果與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的頸腰康膠囊鎮(zhèn)痛藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究[8]結(jié)果一致。

頸腰康膠囊為臨床有效的經(jīng)典方劑，但其抗炎消腫藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未完全明確。本研究初步揭示了該復(fù)方制劑中抗炎消腫的主要有效成分，并確定了其中的抗炎消腫藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，可為后續(xù)針對(duì)其藥效物質(zhì)成分建立特征指紋圖譜提供依據(jù)，進(jìn)而有助于提高頸腰康膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)該制劑的技術(shù)改造升級(jí)。

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（收稿日期：2018-05-29 修回日期：2018-12-24）

（編輯：段思怡）