努比亞山羊BMPR-IB基因多態(tài)性與其產(chǎn)羔性狀的關(guān)聯(lián)分析

鄒輝 瞿秋紅 夏琴 崔悅悅 江雨航 韋玲靜 嚴(yán)雪瑜 蔣欽楊 韋英明

摘要：【目的】明確努比亞山羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB（BMPR-IB）基因多態(tài)性與其產(chǎn)羔性狀的關(guān)聯(lián)，為山羊育種尋找新的遺傳分子標(biāo)記。【方法】采用DNA池結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)檢測努比亞山羊BMPR-IB基因全部編碼區(qū)的變異情況，以時(shí)間飛行質(zhì)譜列陣技術(shù)對(duì)候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并分析BMPR-IB基因多態(tài)性與產(chǎn)羔性狀（產(chǎn)羔數(shù)、初生重和斷奶重）的關(guān)聯(lián)性?！窘Y(jié)果】努比亞山羊BMPR-IB基因5'UTR第469位存在A→G堿基突變，內(nèi)含子1第1664位和內(nèi)含子9第11344位處存在G→A堿基突變。3個(gè)SNP位點(diǎn)（5'UTR 469th、Intron1 1664th和Intron9 11344th）存在3種基因型（GG型、GA型和AA型），對(duì)應(yīng)的多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.37、0.11和0.37，其中Intron1 1664th位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P?0.05），5'UTR 469th和Intron9 11344th位點(diǎn)則處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P<0.05）。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，努比亞山羊BMPR-IB基因5'UTR第469位堿基由A→G，其GG型母羊比AA型母羊的產(chǎn)羔數(shù)和子代平均初生重有所減少，但子代平均斷奶重增加;內(nèi)含子1第1664位堿基由G→A，其GA型母羊比GG型母羊的產(chǎn)羔數(shù)和子代平均初生重均有所增加，但子代平均斷奶重減輕;內(nèi)含子9第11344位堿基由G→A，其AA型母羊比GG型母羊產(chǎn)羔數(shù)少，但子代平均初生重和平均斷奶重均增加?？梢姡葋喩窖駼MPR-IB基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)其產(chǎn)羔性狀均無顯著影響（P>0.05）?！窘Y(jié)論】努比亞山羊BMPR-IB基因存在3個(gè)SNP位點(diǎn)（5'UTR 469th、Intron1 1664th和Intron9 11344th），但對(duì)努比亞山羊產(chǎn)羔性狀影響不顯著，說明BMPR-IB基因?qū)ι窖虻漠a(chǎn)羔性狀具有一定種屬特異性。

關(guān)鍵詞： 努比亞山羊;BMPR-IB基因;SNP位點(diǎn);產(chǎn)羔性狀;多態(tài)性;關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)： S827.92? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）04-0860-07

Abstract：【Objective】The correlation between Nubian goat bone morphogenetic protein receptor-IB（BMPR-IB） gene polymorphism and its lambing traits was clarified to search new genetic molecular markers related to goat breeding. 【Method】In this study， DNA pool and PCR products sequencing technique were used to detect the variation of whole coding region of Nubian goat BMPR-IB gene. Time flight mass spectrometry was applied to perform the genotype of candidate SNP loci， and analyze the relationship between polymorphism of BMPR-IB gene and goat lambing traits（lamb number， primary weight and weaning weight）. 【Result】There was a G→A base mutation at the 469th position of 5'UTR of BMPR-IB gene of Nubian goat， a G→A base mutation at the 1664th position of intron 1 and the 11343th position of intron 9. The three SNP loci（5'UTR 469th， Intron1 1664th and Intron9 11344th） had three genotypes（GG type， GA type and AA type）， the polymorphic information content（PIC） respectively were 0.37， 0.11 and 0.37. The gene frequency and genotype frequency of Intron1 1664th were in Hardy-Weinberg equilibrium state（P?0.05）， 5'UTR 469th and Intron9 11344th were in Hardy-Weinberg imbalance（P<0.05）. Correlation analysis showed that the 5'UTR 469th base of the BMPR-IB gene of Nubian goat was A→G， which resulted in a reduction of the lamb number and the average primary weight of the lamb in GG ewes compared with the AA ewes，but increase of the average weaning weight of the offspring. Intron1 1664th base was mutated from G to A， while the lamb number and the average primary weight of the GA ewes were higher than those of the GG ewes， but the average weaning weight of the offspring was reduced. Intron9 11344th base was mutated from G to A. The AA type ewes had fewer lambs than the GG ewes， and their offspring’s average primary weight and average weaning weight increased.The three SNP loci of BMPR-IB gene of Nubian goat had no significant effects on its lambing traits（P>0.05）. 【Conclusion】There are three SNP loci in the BMPR-IB gene of Nubian goats（5'UTR 469th， Intron1 1664th and Intron9 11344th）， but the effect on the lamb traits of Nubian goats is not significant， indicating that the BMPR-IB gene has species specificity on lamb traits for goats.

Key words： Nubian goat; BMPR-IB gene; SNP locus; lambing trait; polymorphism; association analysis

0 引言

【研究意義】山羊產(chǎn)羔性狀與其群體的繁衍速度和規(guī)模密切相關(guān)，是影響?zhàn)B羊業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的重要因素。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）是20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的一個(gè)受體蛋白，可與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（Bone morphogenetic protein receptor，BMPR）結(jié)合，誘導(dǎo)胚胎腹側(cè)中胚層、軟骨和骨的形成，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、遷移凋亡、細(xì)胞支持及胚發(fā)育等生物功能（鄒輝等，2018）。骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB（Bone morphogenetic protein receptor-IB，BMPR-IB）是一種重要的跨膜受體蛋白，主要參與轉(zhuǎn)化生長因子β通路，在調(diào)控成骨分化、細(xì)胞擴(kuò)散及卵巢卵泡發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用，并直接影響綿羊等動(dòng)物的繁殖性狀（孫紅霞等，2009;邵勇鋼等，2012）。因此，篩選出BMPR-IB基因的分子標(biāo)記對(duì)提高山羊產(chǎn)羔性能具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】BMPR-IB是轉(zhuǎn)化生長因子B（Transforming growth factor B，TGFB）超家族中的一員（Dash et al.，2018），屬于TGF-β家族的I型受體，編碼一個(gè)轉(zhuǎn)移生長因子β亞基（TGFβ）受體家族成員（焦丹等，2016）。BMPR-IB基因是多種骨形態(tài)發(fā)生蛋白的膜受體基因，在動(dòng)物輸卵管、骨骼肌、腎臟、下丘腦、子宮、骨骼、垂體、脊髓、耳和卵巢中的表達(dá)量逐漸升高（王小佳等，2017），參與調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞生長和分化、促進(jìn)卵泡發(fā)育及增加卵泡數(shù)目，與卵母細(xì)胞上的生長因子、GDF9和BMP15共同影響動(dòng)物的繁殖性能（Vacca et al.，2010）。已有研究證實(shí)，BMPR-IB基因敲除、沉默及其多態(tài)性均與動(dòng)物排卵數(shù)等繁殖性能相關(guān)（Rodriguez et al.，2016）。綿羊BMPR-IB基因位于第6號(hào)染色體上，其mRNA序列全長3255 bp，DNA序列全長225039 bp，含有12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子（李闖等，2018）。BMPR-IB基因第8外顯子存在1個(gè)FecB（Fecundity booroola）突變（A746G），導(dǎo)致第249位氨基酸由谷氨酰胺突變成精氨酸（Gln→Arg），該突變對(duì)綿羊排卵數(shù)有加性效應(yīng)，對(duì)產(chǎn)羔數(shù)呈部分顯性效應(yīng)，每增加1個(gè)拷貝將多排卵1.65枚;BMPR-IB基因除存在FecB突變位點(diǎn)外，還存在其他突變位點(diǎn)（姚雅馨，2017）。Souza等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，C1113A突變導(dǎo)致出現(xiàn)大量小型有腔卵泡早熟、排卵率增加等表型特征，同時(shí)發(fā)現(xiàn)20個(gè)新的突變位點(diǎn)，其中3個(gè)突變位點(diǎn)（G922T、T1043C和G192T）導(dǎo)致氨基酸改變，但未影響產(chǎn)羔數(shù)。孫紅霞等（2009）、邵勇鋼等（2012）分別以小尾寒羊、蒙古羊和策勒黑羊?yàn)檠芯繉?duì)象，發(fā)現(xiàn)BMPR-IB基因可能是控制小尾寒羊和灘羊多胎性能的主基因;但Chu等（2012）研究濟(jì)寧青山羊、文登奶山羊和蒙古絨山羊外顯子1、外顯子2、外顯子6、外顯子10和3'UTR的多態(tài)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，BMPR-IB基因檢測出的突變位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)羔數(shù)無顯著影響。李文楊等（2012）、劉遠(yuǎn)等（2012a，2012b）分別采用PCR-RFLP對(duì)戴云山羊、閩東山羊、福清山羊和南江黃羊BMPR-IB基因進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測，也未發(fā)現(xiàn)影響產(chǎn)羔數(shù)的堿基突變。Wang等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊和湖羊的BMPR-IB基因均存在3個(gè)突變位點(diǎn)（A746G、C718T和C47T），且對(duì)產(chǎn)羔數(shù)有一定影響，表明BMPR-IB基因可作為產(chǎn)羔性狀的遺傳分子標(biāo)記?？梢?，要明確BMPR-IB基因?qū)Ξa(chǎn)羔數(shù)的影響是否具有種屬或品系特異性，還需進(jìn)一步對(duì)更多數(shù)量和種類的羊群進(jìn)行研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于BMPR-IB基因?qū)?dòng)物繁殖性狀的遺傳效應(yīng)研究已有很多報(bào)道，但該基因在努比亞山羊產(chǎn)羔性狀中的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用DNA池結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)檢測努比亞山羊BMPR-IB基因全部編碼區(qū)的變異情況，以時(shí)間飛行質(zhì)譜列陣技術(shù)對(duì)候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并對(duì)BMPR-IB基因多態(tài)性與產(chǎn)羔性狀（產(chǎn)羔數(shù)、初生重和斷奶重）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為山羊育種尋找新的遺傳分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

努比亞山羊母羊血液均采自廣西扶綏廣羊畜牧養(yǎng)殖有限公司;DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，PCR擴(kuò)增試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，瓊脂糖和DL2000 DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)山羊BMPR-IB基因序列，采用Oligo 7.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增BMPR-IB基因片段序列的引物（表1），所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 DNA提取

根據(jù)血液DNA提取試劑盒說明，提取240只努比亞山羊母羊血液基因組DNA。然后取1.5 μL提取的DNA，采用分光光度計(jì)檢測OD260/OD280。根據(jù)OD260/OD280預(yù)測DNA純度，純品DNA的OD260/OD280為1.6～1.9;再以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA， -40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 基因片段檢測及DNA池測序

PCR反應(yīng)體系30.0 μL：2×Taq Master Mix 15.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至30.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。分別取5.0 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。從有效PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中各挑選3管進(jìn)行片段測序，測序結(jié)果與NCBI上的參考序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。將提取的260管DNA（50 ng/μL）分成13個(gè)組，每組20管（按序號(hào)依次編排），然后從每組20管DNA中取出0.5 μL混在1個(gè)離心管中，混勻，即為1個(gè)混合池，共產(chǎn)生13個(gè)DNA混合池。以混合池DNA為模板對(duì)努比亞山羊BMPR-IB基因的全部外顯子進(jìn)行擴(kuò)增及測序分析。

1. 5 多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）基因分型

采用MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜列陣對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測，并針對(duì)這些SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物進(jìn)行時(shí)間飛行質(zhì)譜基因分型，基因分型的引物見表2。

1. 6 遺傳學(xué)分析

基于基因序列測序結(jié)果，計(jì)算不同SNP位點(diǎn)在努比亞山羊母羊群體中的基因型頻率、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、有效等位基數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）及Hardy-Weinberg平衡等遺傳學(xué)參數(shù)。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

基因序列測序結(jié)果用DNASTAR、MegALign和SAS 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 努比亞山羊血液DNA提取結(jié)果

提取的努比亞山羊血液DNA樣品通過分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測，其濃度和純度均符合要求，獲得的條帶清晰單一（圖1），可供后續(xù)研究使用。

2. 2 努比亞山羊BMPR-IB基因片段DNA池檢測結(jié)果

以提取的努比亞山羊血液DNA混合池為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得的BMPR-IB基因片段大小均與預(yù)期結(jié)果一致（圖2），經(jīng)DNA池序列分析發(fā)現(xiàn)，努比亞山羊BMPR-IB基因5'UTR第469位存在A→G堿基突變，內(nèi)含子1第1664位和內(nèi)含子9第11344位存在G→A堿基突變（圖3）。

2. 3 努比亞山羊BMPR-IB基因SNP位點(diǎn)的基因分型及其遺傳學(xué)分析結(jié)果

利用MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜列陣檢測3種不同基因型（GG、GA和AA）的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種不同基因型的樣品在分型時(shí)分別在3個(gè)區(qū)域密集分布（圖4），僅個(gè)別樣品因偏離檢測軌道而無法檢測出其基因型，絕大部分樣品的檢測結(jié)果在正常軌道上，能很好地區(qū)分出基因型，保證分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。

一般情況下，PIC<0.25為低度多態(tài)，0.25<PIC<0.50為中度多態(tài)，PIC>0.50為高度多態(tài)。由表3可知，5'UTR 469th和Intron9 11344th位點(diǎn)的PIC均為0.37，屬于中度多態(tài);Intron1 1664th位點(diǎn)的PIC為0.11，為低度多態(tài)。此外，Intron1 1664th位點(diǎn)的Ho較高，缺少AA基因型個(gè)體，5'UTR 469th和Intron9 11344th位點(diǎn)的Ho和He較適中，均接近0.50。

從表4可看出，Intron1 1664th位點(diǎn)在努比亞山羊群體中的基因頻率和基因型頻率均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P?0.05），而5'UTR 469th和Intron9 11344th位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率則處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P<0.05），可能是在日常飼養(yǎng)及育種過程中經(jīng)過人為選擇的結(jié)果。

2. 4 努比亞山羊BMPR-IB基因SNP位點(diǎn)與其產(chǎn)羔性狀的關(guān)聯(lián)性

BMPR-IB基因?qū)ε葋喩窖虍a(chǎn)羔性狀（產(chǎn)羔數(shù)、初生重和斷奶重）的關(guān)聯(lián)分析采用固定模型Yi=μ+Gi+ei。式中，Yi為產(chǎn)羔性狀記錄值;μ為群體均值;Gi為基因型效應(yīng);ei為隨機(jī)殘差效應(yīng)。采用SAS 9.0中的GLM過程對(duì)不同BMPR-IB基因SNP位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)、初生重和斷奶重的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果（表5）表明，努比亞山羊BMPR-IB基因5'UTR第469位堿基由A→G，其GG型母羊比AA型母羊的產(chǎn)羔數(shù)和子代平均初生重有所減少，但子代平均斷奶重增加;內(nèi)含子1第1664位堿基由G→A，其GA型母羊比GG型母羊的產(chǎn)羔數(shù)和子代平均初生重均有所增加，但子代平均斷奶重減輕;內(nèi)含子9第11344位堿基由G→A，其AA型母羊比GG型母羊產(chǎn)羔數(shù)少，但子代平均初生重和平均斷奶重都增加。由表5可知，努比亞山羊BMPR-IB基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)其產(chǎn)羔性狀均無顯著影響（P>0.05）。

3 討論

BMPR-IB基因是影響動(dòng)物繁殖性狀的重要基因（潘章源等，2015）。Mahdavi等（2014）采用RFLP-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Kalehkoohi綿羊FecB基因BB型和B+型的羊產(chǎn)羔數(shù)分別較++型的多0.52和0.35只;Miao等（2016）通過全基因組轉(zhuǎn)錄組分析得出BMPR-IB基因與山羊的繁殖力關(guān)系密切。BMPR-IB基因在山羊上的研究已有較多報(bào)道，并獲得一些實(shí)用的分子標(biāo)記投入生產(chǎn)實(shí)踐。Wang等（2015）研究發(fā)現(xiàn)小尾寒羊和湖羊的BMPR-IB基因均存在3個(gè)突變位點(diǎn)（A746G、C718T和C47T），且對(duì)產(chǎn)羔數(shù)有一定影響，表明BMPR-IB基因可作為產(chǎn)羔性狀的遺傳分子標(biāo)記;但Chu等（2012）研究發(fā)現(xiàn)濟(jì)寧青山羊、文登奶山羊和蒙古絨山羊BMPR-IB基因的突變位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)羔數(shù)無顯著影響，李文楊等（2012）在戴云山羊、閩東山羊、福清山羊和南江黃羊上也未發(fā)現(xiàn)影響產(chǎn)羔數(shù)的BMPR-IB基因突變。本研究結(jié)果表明，努比亞山羊BMPR-IB基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)其產(chǎn)羔性狀均無顯著影響，說明BMPR-IB基因?qū)ι窖虻漠a(chǎn)羔性狀具有一定種屬特異性。

DNA混合池檢驗(yàn)SNP位點(diǎn)和時(shí)間飛行質(zhì)譜列陣基因分型是一種成熟且實(shí)用的技術(shù)（李隱俠等，2017）。本研究以努比亞山羊血液為材料，提取的DNA經(jīng)濃度調(diào)節(jié)后確保在制備DNA混合池時(shí)各組分濃度相近，不會(huì)出現(xiàn)因濃度不均而引起的誤差。經(jīng)DNA混合池PCR測序發(fā)現(xiàn)，努比亞山羊BMPR-IB基因存在3個(gè)SNP位點(diǎn)，且這3個(gè)SNP位點(diǎn)的疊峰部分均在90%以上，說明其多態(tài)性較明顯，也證實(shí)本研究的試驗(yàn)方法可行可靠。本研究在努比亞山羊BMPR-IB基因片段上發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP位點(diǎn)，但這些SNP位點(diǎn)的變異對(duì)努比亞山羊產(chǎn)羔性狀影響不顯著，可能是所采集血液樣品上存在數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)上的特異性，也有可能是SNP位點(diǎn)的遺傳效應(yīng)具有種屬效應(yīng)。因此，本研究雖然得出BMPR-IB基因上的SNP位點(diǎn)對(duì)努比亞山羊產(chǎn)羔性狀影響不顯著，但并不能說明該位點(diǎn)對(duì)山羊的產(chǎn)羔性狀沒有影響，而需進(jìn)一步對(duì)BMPR-IB基因進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

努比亞山羊BMPR-IB基因存在3個(gè)SNP位點(diǎn)（5'UTR 469th、Intron1 1664th和Intron9 11344th），但對(duì)努比亞山羊產(chǎn)羔性狀影響不顯著，說明BMPR-IB基因?qū)ι窖虻漠a(chǎn)羔性狀具有一定種屬特異性。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）