β-1,3-葡聚糖對紅螯螯蝦血細胞的免疫刺激作用

汪蕾 張秀霞 王冬梅 李軍濤 魯耀鵬 鄭佩華 冼健安

摘要：【目的】明確β-1，3-葡聚糖對紅螯螯蝦血細胞免疫力的影響，為開發(fā)β-1，3-葡聚糖作為紅螯螯蝦飼料免疫增強劑提供理論依據?！痉椒ā肯蚣t螯螯蝦注射不同劑量（1和5 μg/g）的β-1，3-葡聚糖，以注射生理鹽水為對照，于注射后的0、6、12、24和48 h采集紅螯螯蝦的血淋巴，測定血細胞總數(shù)（THC）、活性氧（ROS）含量、一氧化氮（NO）含量、非特異性酯酶活力、吞噬活力及血清酚氧化酶（PO）活力?！窘Y果】β-1，3-葡聚糖可刺激紅螯螯蝦血細胞THC、ROS和NO含量、酯酶和血清PO活力顯著提高（P<0.05，下同），注射5 μg/g的β-1，3-葡聚糖劑量還可顯著提高血細胞的吞噬活力;β-1，3-葡聚糖對各類免疫應答的影響存在一定的劑量和時間效應，THC、ROS含量、NO含量及血清PO活力對β-1，3-葡聚糖的刺激更敏感;ROS含量、酯酶活力和血清PO活力呈先上升后下降的變化趨勢，其指標達峰值時，處理時間在24.72～28.20 h范圍內?！窘Y論】注射β-1，3-葡聚糖能提高紅螯螯蝦的循環(huán)血細胞數(shù)量及其細胞免疫力，表明β-1，3-葡聚糖可開發(fā)為紅螯螯蝦飼料免疫增強添加劑。

關鍵詞： 紅螯螯蝦;β-1，3-葡聚糖;血細胞;免疫刺激;流式細胞術

中圖分類號： S968.22? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）04-0883-08

Abstract：【Objective】Effects of β-1，3-glucan injection on immunity of haemocytes of Cherax quadricarinatus were studied. It provided reference for developing β-1，3-glucan as an? immunopotentiator for C. quadricarinatus. 【Method】C. quadricarinatus were injected with different doses（1 and 5 μg/g） of β-1，3-glucan， physiological saline injection was as control， and haemolymph of C. quadrciarinatus were obtained after 0， 6， 12， 24 and 48 h injection， and then total haemocyte count（THC）， reactive oxygen species（ROS） production， nitric oxide（NO） production， non-specific esterase activity， phagocytic activity and plasmic phenoloxidase（PO） activity of haemocytes were determined. 【Result】β-1，3-glucan injection would significantly induce the improvements of THC， ROS and NO productions， activities of esterase and plasmic PO（P<0.05， the same below）. Moreover， β-1，3-glucan at dose of 5 μg/g also significantly induced the phagocytic activity of haemocytes. Effects of β-1，3-glucan on immune responses of C. quadricarinatus haemocytes were dose-dependent and time-dependent. THC， ROS and NO productions and plasmic PO activity were more sensitive to β-1，3-glucan stimulation. ROS production， activities of esterase and plasmic PO rose firstly and then dropped. The elapsed time was between 24.72-28.20 h when these three indicators reached their peaks. 【Conclusion】β-1，3-glucan injection can increase the number of circulating haemocytes and improve their cellular immunity of C. quadricarinatus， indicating that β-1，3-glucan can be developed to be an immunopotentiator for C. quadricarinatus.

Key words： Cherax quadricarinatus; β-1，3-glucan; haemocyte; immunostimulation; flow cytometry

0 引言

【研究意義】紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）原產于澳大利亞，20世紀90年代開始引入我國試養(yǎng)，因其出苗量少、蝦苗價格貴等原因，尚未得到大規(guī)模推廣養(yǎng)殖，而逐漸淡出了我國的水產養(yǎng)殖業(yè)。近年來，由于對蝦病害頻發(fā)、養(yǎng)成率低下，而紅螯螯蝦因出肉率高、生長快、適應性強、味道鮮美等優(yōu)點，成為部分養(yǎng)殖戶的替代養(yǎng)殖品種。目前紅螯螯蝦的人工養(yǎng)殖技術仍處于起步階段，急需營養(yǎng)飼料、病害防控等研究成果為其規(guī)模化發(fā)展提供技術支撐。水產養(yǎng)殖動物病害頻發(fā)是導致養(yǎng)殖失敗的主要原因，因此，研制適宜的免疫增強劑，安全高效地提高水產動物自身的免疫力和抗病力，從而減少用藥，對生產無毒害殘留的優(yōu)質水產品具有重要現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】β-1，3-葡聚糖是目前公認的在眾多水產動物上具有顯著作用的免疫刺激劑（王超和王敏奇，2010;王銀東和何吉祥，2014;劉露等，2017）。飼料添加β-1，3-葡聚糖能顯著提高凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的過氧化氫酶（CAT）活力、溶菌酶活力、酚氧化酶（PO）活力等非特異性免疫功能（劉立鶴等，2005;楊福剛等，2005;趙紅霞等，2010）。飼料中添加400和600 mg/kg的β-1，3-葡聚糖能顯著提高花鱸（Lateolabrax japonicus）的抗氨氮脅迫能力（吳春玉等，2013）。在原代培養(yǎng)的凡納濱對蝦血細胞培養(yǎng)液中添加β-1，3-葡聚糖或其衍生物，均能顯著提高PO活力和呼吸爆發(fā)活力（白楠等，2014）。此外，在飼料中添加0.2% β-1，3-葡聚糖可提高虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的生長性能并改變其部分血液生理指標（王藝等，2018）;向大黃魚（Larimichthys crocea）腹腔注射濃度5 mg/kg的β-1，3-葡聚糖0.1 mL，可顯著降低低氧脅迫下的丙二醛（MDA）含量，提高抗氧化酶的活力與基因表達水平（王永紅等，2018）?！颈狙芯壳腥朦c】目前以注射β-1，3-葡聚糖的試驗方式，并通過細胞學檢測方法流式細胞術（Flow cytometry，F(xiàn)CM）分析血細胞免疫響應的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過分析β-1，3-葡聚糖注射對紅螯螯蝦血細胞免疫功能的影響，探討β-1，3-葡聚糖作為紅螯螯蝦免疫增強劑的可行性，為開發(fā)紅螯螯蝦的安全高效飼料免疫增強劑提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

紅螯螯蝦購自廣州市黃沙水產交易市場，平均體重19.41±3.54 g/尾，在廣東省水產健康安全養(yǎng)殖重點實驗室室內環(huán)境條件下進行暫養(yǎng)。養(yǎng)殖水體環(huán)境條件：pH 7.9～8.0，溫度（24±2）℃，一直保持曝氣，并進行循環(huán)過濾。暫養(yǎng)適應一周后，選取健康無病患、附肢完整、處于蛻皮間期的螯蝦進行試驗。β- 1，3-葡聚糖、SYBR Green I、DCFH-DA、DAF-FM DA和二乙酸熒光素（FDA）均購自Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自Invitrogen公司，其他試劑均為國產分析純。

1. 2 試驗設計

1. 2. 1 β-1，3-葡聚糖注射 β-1，3-葡聚糖以生理鹽水（0.85% NaCl）配制成濃度為1和5 μg/g的工作液。試驗用紅螯螯蝦分為3組，每組3個平行，每個平行20尾。分別按1和5 μg/g（以蝦體重換算注射量）的劑量進行腹節(jié)注射，對照組注射等量生理鹽水。

1. 2. 2 血細胞懸液制備 于注射后0、6、12、24和48 h分別取樣。用2.5 mL一次性注射器吸取600 μL預冷的抗凝劑（葡萄糖20.5 g/L，檸檬酸鈉8 g/L，氯化鈉4.2 g/L，pH 7.5），在紅螯螯蝦的圍心腔抽取血淋巴，以預冷的抗凝劑將血淋巴中的細胞濃度調整至1×106個/mL，用于FCM檢測。每尾紅螯螯蝦的血細胞懸液作為一個單獨樣品進行分析。

1. 3 血細胞指標測定

1. 3. 1 血細胞總數(shù)（Total haemocyte count，THC）

各組試驗分別取血細胞懸液200 μL，加入終濃度為10×的SYBR GreenI（原液濃度10000×），室溫條件下遮光孵育60 min，再用200目篩網進行過濾后，應用流式細胞儀（品牌BD，型號FACSCalibur）進行檢測，根據熒光強度的差異劃分完整細胞區(qū)域和細胞碎片區(qū)域，每個樣品上樣時間為1 min，分析并記錄完整細胞區(qū)域的細胞個數(shù)，每個樣品上樣記錄3次。THC根據冼健安等（2015）的方法進行計算。

1. 3. 2 活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量 以DCFH-DA作為ROS的特異性熒光染料分析ROS含量（冼健安等，2012）。取血細胞懸液200 μL，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA進行標記，室溫條件下遮光孵育30 min，再用200目篩網過濾后上流式細胞儀進行檢測，每個樣品獲取10000個細胞數(shù)據。結果以DCF熒光強度（FL1）為橫坐標、細胞數(shù)量為縱坐標的直方圖顯示，分析胞內DCF平均熒光強度，胞內DCF平均熒光強度與ROS含量呈正比。

1. 3. 3 一氧化氮（NO）含量 以DAF-FM DA作為NO的特異性熒光染料分析NO含量（Xian et al.，2013）。取血細胞懸液200 μL，加入終濃度為10 μmol/L的DAF-FM DA進行標記，室溫條件下遮光孵育60 min，再用200目篩網過濾后上流式細胞儀進行檢測，每個樣品獲取10000個細胞數(shù)據。結果以DAF-FM熒光強度（FL1）為橫坐標、細胞數(shù)量為縱坐標的直方圖顯示，分析胞內DAF-FM平均熒光強度，胞內DAF-FM平均熒光強度與NO含量呈正比。

1. 3. 4 非特異性酯酶活力 采用FDA作為熒光探針測定非特異性酯酶活力。取血細胞懸液200 μL，加入終濃度為5 μmol/L的FDA進行標記，室溫條件下遮光孵育30 min，再用200目篩網過濾后上流式細胞儀進行檢測，每個樣品獲取10000個細胞數(shù)據。結果以FDA熒光強度（FL1）為橫坐標、細胞數(shù)量為縱坐標的直方圖顯示，分析胞內FDA平均熒光強度，胞內FDA平均熒光強度與非特異性酯酶活力呈正比。

1. 3. 5 吞噬活力 以人工熒光微球（Fluorospheres? carboxylate-modified microspheres，黃綠色熒光，直徑1 μm，Molecular Probes，Invitrogen）作為被吞噬物。取血細胞懸液400 μL，加入10 μL濃度為微球原液1/10的微球稀釋液，室溫條件下遮光孵育1 h，再用200目篩網過濾后上流式細胞儀進行檢測，每個樣品獲取10000個細胞數(shù)據。結果以FL1熒光量為橫坐標、細胞數(shù)量為縱坐標的直方圖顯示，吞噬3個或以上熒光微球的血細胞定義為吞噬陽性的細胞，劃定該細胞區(qū)域，計算該區(qū)域細胞比例，即為吞噬率。

1. 3. 6 血清PO活力 以L-DOPA為特異性底物測定PO活力（Huang et al.，2010）。分別取30～50 mL血清，與800 mL L-DOPA[用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.6）配制，磷酸鉀緩沖液為38.1 mL 1 mol/L的K2HPO4+61.9 mL 1 mol/L的KH2PO4]充分混合，立刻讀取490 nm波長下的光密度值，每10 s讀數(shù)一次，共讀數(shù)120 s。以牛血清蛋白為標準蛋白繪制標準曲線，以考馬斯亮藍G-250為染色劑進行染色，在595 nm處比色測定蛋白含量。PO活性單位定義：1 mg蛋白每分鐘OD490增加0.001為一個PO活力單位（U/mg）。

1. 4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據利用SPSS 18.0進行單因素方差分析和二次曲線回歸分析。

2 結果與分析

2. 1 β-1，3-葡聚糖注射對紅螯螯蝦THC的影響

由圖1可知，紅螯螯蝦的初始THC為8.85×106個/mL;葡聚糖注射劑量為1 μg/g時，與注射生理鹽水的對照相比，紅螯螯蝦的THC在注射β-1，3-葡聚糖后6和12 h均表現(xiàn)出顯著升高趨勢（P<0.05，下同），隨后恢復至正常水平;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時，紅螯螯蝦的THC在注射后48 h內均顯著高于對照，最高值出現(xiàn)在注射后6 h，達16.33×106個/mL。

2. 2 β-1，3-葡聚糖注射對紅螯螯蝦血細胞ROS含量的影響

由圖2可知，葡聚糖注射劑量為1 μg/g時，紅螯螯蝦血細胞的ROS含量在注射后6和12 h顯著提高，注射后24 h降回到正常水平;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時，紅螯螯蝦血細胞的ROS含量在注射后48 h內均顯著高于對照，最高值出現(xiàn)在注射后12 h，約為對照的3.55倍?？梢?，在5 μg/g的葡聚糖注射劑量下，紅螯螯蝦血細胞的ROS含量呈現(xiàn)明顯的先升高后下降變化趨勢，對該劑量下的處理時間與ROS含量變化進行二次曲線回歸分析，得出ROS含量達峰值時的處理時間為24.72 h（圖3）。

2. 3 β-1，3-葡聚糖注射對紅螯螯蝦血細胞NO含量的影響

由圖4可看出，葡聚糖注射劑量為1 μg/g時，紅螯螯蝦血細胞的NO含量在注射后6 h急劇升高，約為對照的2.22倍，在注射12 h后逐漸恢復至正常水平;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時，紅螯螯蝦血細胞的NO含量在注射后6 h急劇升高至最高值，約為對照的2.68倍，在注射后12 h開始急劇下降，但仍高于對照，注射后24 h恢復至正常水平。

2. 4 β-1，3-葡聚糖注射對紅螯螯蝦血細胞非特異性酯酶活力的影響

由圖5可看出，葡聚糖注射劑量為1 μg/g時，紅螯螯蝦血細胞的酯酶活力在注射后12和24 h顯著升高，在注射后48 h下降至正常水平;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時，紅螯螯蝦血細胞的酯酶活力在注射后12～48 h顯著高于對照，在12 h時達最高值?？梢?，酯酶活力呈現(xiàn)明顯的先升高后下降變化趨勢，經二次回歸分析得出，注射1和5 μg/g葡聚糖時，螯蝦血細胞酯酶活力達峰值的處理時間分別為26.45和26.88 h（圖6）。

2. 5 β-1，3-葡聚糖注射對紅螯螯蝦血細胞吞噬活力的影響

由圖7可看出，在整個試驗過程中，注射1 μg/g葡聚糖對紅螯螯蝦血細胞吞噬活力無顯著影響（P>0.05）;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時，血細胞吞噬活力在注射后6和12 h顯著提高，并在注射后12 h達最高值，吞噬率為32.6%。

2. 6 β-1，3-葡聚糖注射對紅螯螯蝦血清PO活力的影響

由圖8可看出，葡聚糖注射劑量為1 μg/g時，紅螯螯蝦血清PO活力在注射后6和12 h顯著高于對照，在注射后24和48 h恢復至正常水平;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時，血清PO活力在整個試驗過程中均顯著高于對照，最高值出現(xiàn)在注射后24 h。在注射5 μg/g葡聚糖的處理下，血清PO活力呈明顯的先升高后下降變化趨勢，以處理時間與血清PO活力變化進行二次回歸分析，得出血清PO活力達峰值時的處理時間為28.20 h（圖9）。

3 討論

3. 1 β-1，3-葡聚糖對蝦類THC的影響

蝦類的免疫防御依賴于其先天性免疫，血細胞在細胞免疫和體液免疫過程中均扮演著重要角色（Johansson et al.，2000），因此，THC常作為衡量蝦類免疫狀態(tài)的重要指標。環(huán)境脅迫（Cheng and Chen，2001;Xian et al.，2010）、病原體感染（Li et al.，2008;Ji et al.，2009;Xian et al.，2016）等因素均會導致循環(huán)血細胞數(shù)量的減少，THC下降是免疫力和抗病力低下的一個重要體現(xiàn)。β-1，3-葡聚糖是水產配合飼料中較常用、免疫刺激效果較顯著的一種飼料添加劑（王銀東和何吉祥，2014）。在飼料中添加β-1，3-葡聚糖可顯著提高對蝦的THC，從而提高其免疫力和抗病力。我國對蝦（Penaeus chinensis）的相關研究顯示，注射β-1，3-葡聚糖48 h后，對蝦的THC提高了52.0%（汪小鋒等，2005）。本研究對紅螯螯蝦進行β-1，3-葡聚糖肌肉注射，結果顯示其THC顯著升高，且存在一定的劑量效應。當注射劑量為1 μg/g時，THC在注射后6～12 h顯著提高，隨后恢復至正常水平;當注射劑量為5 μg/g時，THC在整個試驗階段均呈現(xiàn)顯著升高，持續(xù)時間更長。注射β-1，3-葡聚糖后，THC最高值均出現(xiàn)在注射后6 h，表明THC對β-1，3-葡聚糖注射刺激十分敏感。THC最高值也呈一定的劑量效應，注射劑量為1 μg/g時，THC最高值是對照的1.45倍;注射劑量為5 μg/g時，THC最高值為對照的1.98倍?？梢?，β-1，3-葡聚糖的刺激可誘導紅螯螯蝦循環(huán)血細胞數(shù)量增加，從而可能對其免疫力和抗病力產生正面影響，因此，β-1，3-葡聚糖具有作為飼料免疫增強劑的開發(fā)潛力。

3. 2 β-1，3-葡聚糖對蝦類血細胞ROS和NO含量的影響

ROS包括超氧陰離子（[O][2] ）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（OH·）等，是機體內重要的抗菌殺菌物質（Munoz et al.，2000;Lambert et al.，2007）。NO作為一種主要的活性氮（RNS）分子，在哺乳動物殺滅病原微生物過程中發(fā)揮重要作用，近年來在甲殼動物的研究中也發(fā)現(xiàn)NO在殺菌機制中產生作用（Raman et al.，2008;Yao et al.，2010;Xian et al.，2013）。蝦類血細胞經革蘭氏陰性菌細胞壁脂多糖（LPS）（Xian et al.，2016）和病毒雙鏈RNA類似物聚肌胞苷酸（poly I∶C）（Xian et al.，2018）刺激，以及在吞噬過程中均會產生大量的ROS和NO（Raman et al.，2008），表明ROS和NO在蝦類抗菌和抗病毒過程中具有普遍性作用。凡納濱對蝦原代培養(yǎng)血細胞與β-1，3-葡聚糖及其衍生物孵育后，其血細胞呼吸爆發(fā)活力極大提高（白楠等，2014）。在本研究中，注射β-1，3-葡聚糖后紅螯螯蝦血細胞ROS和NO含量均有顯著提高，表明β-1，3-葡聚糖注射刺激了紅螯螯蝦血細胞呼吸爆發(fā)活力的提高。ROS和NO對β-1，3-葡聚糖的響應模式存在一定差異，NO的響應較敏感，最高值出現(xiàn)在注射后6 h，但持續(xù)時間較短，隨后便逐漸恢復至正常水平，可能是由于NO的另一重要作用是作為信號因子參與機體內許多生理與病理過程，其含量受到嚴格控制;另一方面，NO本身極不穩(wěn)定，在胞內很快被代謝為硝酸鹽和亞硝酸鹽。ROS含量的最高值出現(xiàn)在注射后12 h，持續(xù)時間較長，注射高劑量時可持續(xù)整個試驗過程。綜上所述，在β-1，3-葡聚糖免疫刺激下，ROS通路和NO通路均是紅螯螯蝦血細胞的免疫防御機制，其中ROS通路可能起到更為主要的作用。

3. 3 β-1，3-葡聚糖對蝦類血細胞酯酶活力和吞噬活力的影響

酯酶是溶酶體酶類之一，在血細胞抗菌作用中發(fā)揮重要作用。蝦類血細胞酯酶活力是一個較敏感的指標，對環(huán)境脅迫（Xian et al.，2011）和病原體刺激（Xian et al.，2016，2018）均能作出強烈的響應。飼料添加物對酯酶活力的影響目前僅見關于飼料銅離子的研究，結果顯示飼料中添加過量的銅離子會對斑節(jié)對蝦血細胞酯酶活力產生一定的負面影響，可能是過量銅離子產生的細胞毒性所致（冼健安和王安利，2013）。不同微生物抗原物質對酯酶活力的影響也不同，不管是在離體刺激還是在活體注射的情況下，細菌LPS的刺激均能引起對蝦血細胞酯酶活力顯著提升（Guo et al.，2013;Xian et al.，2016），但聚肌胞苷酸[poly（I∶C）]處理對蝦血細胞酯酶活力的影響甚少（Xian et al.，2018）。本研究結果顯示，β-1，3-葡聚糖也能誘導紅螯螯蝦血細胞酯酶活力顯著提高，但其敏感性較ROS和NO低，在注射后12 h才呈顯著升高趨勢。上述結果表明，蝦類免疫系統(tǒng)對不同的微生物抗原物質會產生不同的免疫響應。此外，飼料中添加β-1，3-葡聚糖或酵母細胞壁可顯著提高凡納濱對蝦溶菌活力或溶菌酶活力（許國煥等，2003;楊福剛等，2005;趙紅霞等，2010），酯酶在這一過程中可能起到一定作用。

吞噬功能是蝦類血細胞進行抗菌防御的主要免疫功能之一。本研究中，在低劑量β-1，3-葡聚糖處理下，紅螯螯蝦血細胞的吞噬活力無顯著變化;而高劑量β-1，3-葡聚糖處理顯示出其對紅螯螯蝦血細胞吞噬活力的激活作用。羅氏沼蝦血細胞經LPS刺激后，其吞噬率顯著提高（冼健安等，2011），與本研究結果相似。另有研究表明，各類免疫響應并非單一存在，彼此間可能相互激活，配合發(fā)揮免疫防御功能，如活化的酚氧化酶原（proPO）系統(tǒng)組分能激活血細胞的吞噬能力（Johansson et al.，2000），血細胞在吞噬過程中會產生大量的ROS和NO（Raman et al.，2008）。

3. 4 β-1，3-葡聚糖對蝦類血清PO活力的影響

proPO系統(tǒng)是蝦類免疫系統(tǒng)的重要組成部分，關于proPO系統(tǒng)的作用機理研究已較深入（孟凡倫等，1999;郭慧等，2013）。proPO系統(tǒng)儲存于大顆粒細胞和小顆粒細胞的顆粒中，當有微生物抗原性物質如β-1，3-葡聚糖、脂多糖和肽聚糖等存在時，可被相應模式識別蛋白如β-1，3-葡聚糖結合蛋白（BGBP）、脂肪與β-1，3-葡聚糖結合蛋白（LGBP）等識別并結合，引起顆粒細胞脫顆粒釋放proPO系統(tǒng)，proPO被絲氨酸蛋白酶激活為活性PO，PO將酚氧化為醌，再形成黑色素而發(fā)揮抗菌殺菌作用（徐海圣和徐步進，2001）。體外孵育、注射或飼喂β-1，3-葡聚糖均能顯著提高對蝦的血清PO活力（許國煥等，2003;劉立鶴等，2005;汪小鋒等，2005;白楠等，2014）。本研究結果也顯示，注射β-1，3-葡聚糖能顯著提高紅螯螯蝦的血清PO活力，且具有明顯的劑量效應，高劑量β-1，3-葡聚糖刺激下其血清PO活力的提高幅度更大，持續(xù)時間也更長。

4 結論

注射β-1，3-葡聚糖能提高紅螯螯蝦的循環(huán)血細胞數(shù)量及其免疫力，表明β-1，3-葡聚糖可開發(fā)為紅螯螯蝦飼料免疫增強添加劑。

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（責任編輯 鄧慧靈）