三七總皂苷通過影響VEGF的表達(dá)改善多柔比星腎病大鼠蛋白尿

帥林 楊頌 余磊

摘要：目的探討三七總皂苷對(duì)多柔比星小鼠腎的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。 方法將 24 只 8 周齡雄性 SD 大鼠隨機(jī)分為 3 組：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組和治療組。模型對(duì)照組和治療組予多柔比星建模，治療組腹腔注射血栓通，連續(xù) 4 周，每周檢測(cè)大鼠尿白蛋白 / 尿肌酐比值，4 周后檢測(cè) 24h 尿微量白蛋白及各組大鼠腎組織中 VEFG 蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 注射多柔比星 1 周后，大鼠尿白蛋白/ 尿肌酐的比值開始升高，3 周和 4 周時(shí)，與模型對(duì)照組相比，治療組的比值較模型對(duì)照組低， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型對(duì)照組相比，治療組的 24h 尿微量白蛋白低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與對(duì)照組相比，模型對(duì)照組和治療組的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VFGF）蛋白表達(dá)降低，與模型對(duì)照組相比，治療組的 VEGF 蛋白表達(dá)較高。 結(jié)論三七總皂苷具有改善化療藥物多柔比星引起的腎損害，其作用機(jī)制可能與增加 VEGF 蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：三七總皂苷;蛋白尿;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VFGF）

【中圖分類號(hào)】R322.6 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2107-2306（2019）05-017-02

大量蛋白尿是腎病綜合征（NS）最主要的表現(xiàn)，也是腎臟疾病最常見的臨床表現(xiàn)之一。多柔比星腎病是實(shí)驗(yàn)性腎損傷的經(jīng)典模型，其主要表現(xiàn)類似于人類的微小病變型腎病，故國(guó)內(nèi)外學(xué)者均用此模型模擬研究腎損傷 [1]。

三七總皂苷（panax notoginseng saponins， PNS）是從多年生草本植物中藥三七中提取的有效成分，毒副作用小， 應(yīng)用于很多疾病，具有活血、補(bǔ)血、溶血及抗溶血、抗炎、降脂、降血糖、抗衰老及抗氧化等作用 [2]。有研究表明三七總皂苷能提高血漿白蛋白，增加尿量，改善患者血液高凝狀態(tài)[3]，并能抑制血小板活化[4]，從而減少微量蛋白尿，且未發(fā)現(xiàn)明顯副作用 [5]。

多柔比星是臨床常用的化療藥物之一，本研究通過建立多柔比星腎病模型，觀察三七總皂苷對(duì)化療后腎性蛋白尿的影響，觀察尿白蛋白 / 尿肌酐比值，并從三七總皂苷對(duì) VEGF 蛋白表達(dá)的影響，探討三七總皂苷改善化療后腎組織損傷的機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物為SPF級(jí)雄性SD（Sprague-Dawley） ?大鼠24只，體質(zhì)量 200-250g。血栓通粉針 （ 主要成分為三七總皂苷，PNS）&nbsp;，麗珠集團(tuán)利民制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：Z44020284。多柔比星， 輝瑞制藥有限公司， 批號(hào)： H20100406。

2.1?分組與給藥 8?周齡雄性 SD?大鼠 24 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為 3 組，每組 8 只，分別為：正常對(duì)照組， 模型對(duì)照組和治療組。模型對(duì)照組和治療組大鼠尾靜脈一次性注射多柔比星5.5mg/kg，繼續(xù)飼養(yǎng)1周。1周后開始藥物干預(yù)，治療組腹腔注射血栓通粉針7.5mg/kg·d （ 相當(dāng)于成人用量 ），對(duì)照組予腹腔灌注等量5%葡萄糖水，連續(xù)4周。

2.2?標(biāo)本采集與檢測(cè) 分別于每周用代謝籠收集清晨隨機(jī)一次尿液，離心（3500r/min，15min），取上清液，置 -80℃ 冰箱保存?zhèn)溆?，待測(cè)尿微量白蛋白、尿肌酐，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。4?周末，留取 24h?尿液，離心取上清， 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)尿微量白蛋白。4?周末，取腎臟皮質(zhì)組織標(biāo)本，提取總蛋白，待測(cè)腎組織 VEGF?的水平， 采用免疫蛋白印跡法檢測(cè)。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) 采用含蛋白酶抑制劑的組織裂解液[1g/L?十二烷基磺酸鈉（SDS）、10g/L脫氧膽酸鈉（Sodium Deoxycholate） 、 10mL/L Triton X-100 、 150mmol/L 氯化鈉（NaCl）、10mmol/L?乙二胺四乙酸 （EDTA）、25mmol/L?Tris HCl（pH?7.2）、1mmol/L?苯甲基磺酰氟 （PMSF）、1?mg/L?抑

肽 酶 （aprotinin） 、 1mg/L 亮 抑 肽 酶 （leupeptin） 、 1mg/L?胃蛋白酶抑制劑 （pepstatin）]?于超聲粉碎儀冰上裂解腎組織 ，

13000r/min?低溫離心 15min 取上清即為總蛋白 ; 每孔 75g?總蛋白進(jìn)行 80g/L?十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDSPAGE）， 濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 ;50g/L 脫脂奶室溫封閉1h;?分別加封閉液稀釋的小鼠抗人 VEGF1-140?氨基端的單克隆抗體 C1?和小鼠抗兔 GAPDH?單克隆抗體于 4℃過夜 ; 然后加辣根過氧化物酶 （HRP）?標(biāo)記的羊抗鼠 IgG?室溫反應(yīng)1h; 電化學(xué)發(fā)光法 （ECL） 發(fā)光試劑反應(yīng) 1min; 曝光。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS16.0?軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，組間比較采用兩兩比較的 t?檢驗(yàn)， 組間差異分析采用 One-way?ANOVA?分析。P?< 0.05?為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三七總皂苷對(duì)各組大鼠尿白蛋白 /?尿肌酐的影響注射多柔比星 1?周后，大鼠尿白蛋白 /?尿肌酐的比值升高，2 周后比值大幅度升高，4 周時(shí)達(dá)到實(shí)驗(yàn)觀察的最高值，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。1 周和 2 周時(shí)，模型對(duì)照組和治療組的尿白蛋白 / 尿肌酐的比值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，3 周和 4 周時(shí)，與模型對(duì)照組相比，治療組的尿白蛋白 / 尿肌酐的比值更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見表 1 和圖 1。

3.2?三七總皂苷對(duì)各組大鼠蛋白尿的影響 給與 SD?大鼠

分別處理 4?周后，留取 24h?尿液進(jìn)行尿微量白蛋白的檢測(cè)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型對(duì)照組和治療組的 24h?尿微量白蛋白明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?< 0.05）， 與模型對(duì)照組相比，治療組的 24h?尿微量白蛋白更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?< 0.05）。見圖 2。

3.3?三七總皂苷對(duì)各組大鼠腎組織中 VEFG 蛋白表達(dá)的影響 在各組大鼠的腎組織中檢測(cè) VEGF 蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 與對(duì)照組相比，模型對(duì)照組和治療組的 VEGF?蛋白表達(dá)明顯降低，與模型對(duì)照組相比，治療組的VEGF?蛋白表達(dá)較高。見圖 3。

三七總皂苷是中草藥三七的主要生理活性成分，目前臨床廣泛應(yīng)用的血栓通制劑的主要成分，具有抗缺氧、衰老、耐缺氧以及提高人體免疫力等作用，在人體各個(gè)系統(tǒng)及物質(zhì)代謝方面都具有明顯優(yōu)勢(shì)。最近的研究顯示，黃芪聯(lián)合三七能有效減輕糖尿病大鼠的尿蛋白，減輕足細(xì)胞的損傷， 主要機(jī)制是減輕足細(xì)胞足突融合，改善足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin?表達(dá)，保護(hù)腎臟[6]。本研究擬用經(jīng)典的多柔比星腎病大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討化療后腹腔灌注三七總皂苷對(duì)腎臟的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，注射多柔比星 1?周后，大鼠尿白蛋白/ 尿肌酐的比值升高，2 周后比值大幅度升高，

4 周時(shí)達(dá)到實(shí)驗(yàn)觀察的最高值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1?周和2 周時(shí)，模型對(duì)照組和治療組的尿白蛋白/ 尿肌酐的比值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，3 周和 4 周時(shí)，與模型對(duì)照組相比，治療組的尿白蛋白/ 尿肌酐的比值更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且能夠減少蛋白尿，表明三七總皂苷具有一定的改善腎功能的作用，減少蛋白尿的發(fā)生。

VEGF?是由多肽鏈通過二硫鍵連接構(gòu)成的同源二聚體糖蛋白，屬于血小板衍生生長(zhǎng)因子家族，也是內(nèi)皮細(xì)胞特異性絲裂原 [7] 。在心、腎、肺等臟器組織都有表達(dá) [8]，在腎小球足細(xì)胞、遠(yuǎn)端腎小管和集合管處高表達(dá)，主要作用是維持腎小球?yàn)V過障的完整性和足細(xì)胞活性 [9]。VEGF?受體主要表達(dá)于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及管旁毛細(xì)血管，VEGF?及受體結(jié)合后，能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、提高毛細(xì)血管通透性、改變細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)血管增生以及維持血管功能等作用[10]。蛋白尿和抑制 VEGF?的表達(dá)成正相關(guān)關(guān)系，抑制 VEGF?通路，能夠降低足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白 nephrin?的表達(dá)，增加足細(xì)胞足突融合 ， 甚至導(dǎo)致腎病綜合征和 /?或腎小球血栓性微血管病變等腎臟疾病的發(fā)生 [10]。本研究在各組大鼠的腎組織中檢測(cè) VEGF?蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型對(duì)照組和治療組的 VEGF?蛋白表達(dá)明顯降低，與模型對(duì)照組相比， 治療組的 VEGF?蛋白表達(dá)升高，提示化療藥物可以通過抑制 VEGF?通路導(dǎo)致大鼠腎臟功能受損，三七總皂苷可通過增加 VEGF 的表達(dá)保護(hù)腎臟功能。

本研究結(jié)果分析，多柔比星能夠通過抑制 VEGF 通路導(dǎo)致大鼠蛋白尿的發(fā)生，損傷大鼠腎功能。三七總皂苷可以逆轉(zhuǎn)多柔比星對(duì) VEGF 通路的抑制，增加 VEGF 蛋白的表達(dá)，從而使腎血管舒張，改善腎臟微循環(huán)，減輕腎小球損害，這可能是三七總皂苷減少尿蛋白形成，保護(hù)腎功能的機(jī)制之一，為血栓通應(yīng)用與臨床化療后保護(hù)患者的腎功能提供了理論依據(jù)。但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Li J S， Chen X， Peng L， et al. Angiopoietin-Like-4， a Potential?Target?of?Tacrolimus，?Predicts?Earlier?Podocyte?Injury?in Minimal Change Disease[J]. Plos One， 2015， 10（9）： e0137049.

[8]?張彬 ， 保莉 ， ?張霞 ， et?al.??糖尿病腎病患者血清

VEGF 與微量白蛋白尿的相關(guān)性研究 [J]. 寧夏醫(yī)學(xué)雜志 ， 2016， 38（3）： 196-198.

[基金項(xiàng)目]2019 年度泰州市人民醫(yī)院院級(jí)科研基金（ZL201917）

[作者簡(jiǎn)介]帥林（1986-），男，漢族，江蘇泰州人，醫(yī)師

[通信作者]余磊E-mail：guying500@163.com