甲基尿石素A對(duì)油酸誘導(dǎo)的Huh—7細(xì)胞脂質(zhì)累積的改善作用及其機(jī)制研究

張聰 周俊旋 盛　磊 馬俊俏 李　歆 鄭國華 劉思丹 邱振鵬

甲基尿石素A對(duì)油酸誘導(dǎo)的Huh-7細(xì)胞脂質(zhì)累積的改善作用及其機(jī)制研究Δ

張 聰*，周俊旋，盛 磊，馬俊俏，李 歆，鄭國華，劉思丹，邱振鵬 #（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065）

中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）06-0741-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.06.05

摘 要 目的：研究甲基尿石素A對(duì)油酸誘導(dǎo)的人肝癌Huh-7細(xì)胞脂質(zhì)累積的改善作用及機(jī)制。方法：采用油酸誘導(dǎo)建立細(xì)胞脂質(zhì)累積模型。取Huh-7細(xì)胞，分為對(duì)照組（培養(yǎng)基）和模型組（1 mmol/L油酸）、低劑量藥物組（1 mmol/L油酸+10 μmol/L甲基尿石素A）和高劑量藥物組（1 mmol/L油酸+20 μmol/L甲基尿石素A），采用油紅O染色法觀察細(xì)胞中脂質(zhì)累積情況；采用三酰甘油（TG）酶法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG含量，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測(cè)細(xì)胞中脂肪酸合成酶（FASN）、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP-1）、過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPAR-α）、PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平；采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中FASN的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：采用油酸誘導(dǎo)后，細(xì)胞膜周圍出現(xiàn)大量脂滴累積；細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)及TG含量均顯著升高，F(xiàn)ASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平及FASN的蛋白表達(dá)水平均顯著升高，PPAR-α的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。采用甲基尿石素A干預(yù)后，細(xì)胞膜周圍的脂滴明顯減少；細(xì)胞中脂質(zhì)及TG含量均顯著降低，F(xiàn)ASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平及FASN的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：甲基尿石素A對(duì)油酸誘導(dǎo)的Huh-7細(xì)胞脂肪累積有一定的改善作用，其機(jī)制可能與下調(diào)FASN、SREBP-1、PPAR-γ等相關(guān)因子的表達(dá)，抑制脂肪酸從頭合成、促進(jìn)脂質(zhì)代謝有關(guān)。

關(guān)鍵詞 甲基尿石素A；油酸；人肝癌Huh-7細(xì)胞；脂質(zhì)累積；機(jī)制

Study on Improvement Effect of Methylated Urolithin A on Oleic Acid-induced Lipid Accumulation in Huh-7 Cells and Its Mechanism

ZHANG Cong，ZHOU Junxuan，SHENG Lei，MA Junqiao，LI Xin，ZHENG Guohua，LIU Sidan，QIU Zhengpeng （College of Pharmacy， Hubei University of TCM， Wuhan 430065， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effect and mechanism of methylated urolithin A on oleic acid-induced lipid accumulation in human liver cancer Huh-7 cells. METHODS： Oleic acid was adopted to induce lipid accumulation model cells. Huh-7 cells were divided into control group （culture medium）， model group （1 mmol/L oleic acid）， low-dose group （1 mmol/L oleic acid+10 μmol/L methylated urolithin A） and high-dose group （1 mmol/L oleic acid+20 μmol/L methylated urolithin A）. Oil red O staining was used to observe lipid accumulation in cells. Triglyceride（TG） enzyme assay was applied to determine the TG content in cells. PCR was employed to detect the mRNA expression of FASN， SREBP-1， PPAR-α and PPAR-γ in cells. Western blotting was used to determine the protein expression of FASN in cells. RESULTS： After induced by oleic acid， a large amount of lipid droplet accumulated around the cells； the intracellular lipid and TG content， mRNA expression levels of FASN， SREBP-1 and PPAR-γ， protein expression levels of FASN were increased significantly， while mRNA expression level of PPAR-α was decreased significantly （P<0.01）. After intervened with methylated urolithin A， lipid droplet around the cells decreased significantly； the contents of lipid and TG in cells were decreased significantly， while the mRNA expression levels of FASN， SREBP-1 and PPARγ and protein expression level of FASN were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Methylated urolithin A can improve oleic acid-induced lipid accumulation in Huh-7 cells， the mechanism of which may be associated with inhibiting fat synthesis， promoting lipid metabolism and down-regulating the expression of metabolism-related factors as FASN， SREBP-1 and PPAR-γ.

KEYWORDS Methylated urolithin A； Oleic acid； Human liver cancer Huh-7 cells； Lipid accumulation； Mechanism

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種常見慢性肝臟疾病[1]，其病理特征主要為肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量堆積，其中以三酰甘油（TG）的累積為主[2]，可進(jìn)一步發(fā)展至肝硬化、肝細(xì)胞癌等[3]。“雙重打擊學(xué)說”作為NAFLD的發(fā)病機(jī)制已被廣泛認(rèn)可，即脂質(zhì)在肝臟細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的聚集（即“第一次打擊”）觸發(fā)了一系列的細(xì)胞毒性事件（即“第二次打擊”），從而導(dǎo)致肝損傷[4]。因此，抑制肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積成為了預(yù)防和治療NAFLD的重要途經(jīng)。

尿石素類（Urolithins）化合物是存在于石榴等水果及其他堅(jiān)果中的鞣花單寧經(jīng)體內(nèi)腸道菌群作用后代謝而成的一類具有不同酚羥基的二苯并喃-6-酮衍生物，其具有抗癌、降脂、抗炎、抗氧化等作用[5]。Kang I等[6]研究發(fā)現(xiàn)，尿石素 A、B、D均可減少脂肪肝細(xì)胞中TG的累積。但尿石素類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，易被氧化[7]，故其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、生物利用度較低，限制了其廣泛應(yīng)用。甲基尿石素A是尿石素A結(jié)構(gòu)上第8位的羥基中氫原子被甲基取代后的產(chǎn)物，其與尿石素A、B等具有相似的藥理學(xué)作用，且因甲基取代使其化學(xué)性質(zhì)比尿石素A更為穩(wěn)定，故其生物利用度得以提高；此外，甲基尿石素A相較于尿石素A等更易合成、成本更低，因此更具開發(fā)應(yīng)用價(jià)值[8-9]。Qiu Z等[10]研究表明，甲基尿石素A與尿石素A、B具有相似的抗炎、抗增殖作用。但目前關(guān)于甲基尿石素A改善脂質(zhì)累積方面的作用尚未見研究報(bào)道?；诖?，本課題組采用油酸誘導(dǎo)人肝癌Huh-7細(xì)胞建立脂質(zhì)累積模型，考察甲基尿石素A對(duì)脂質(zhì)累積的改善作用并探討其分子機(jī)制，為該化合物的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；xMark型酶標(biāo)儀、Trans-Blot? TurboTM全能型蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、Power Pac Basic型電泳儀、TC20型細(xì)胞計(jì)數(shù)器、CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；CKX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；XB 220A型分析天平（瑞士Precisa公司）。

1.2 藥品與試劑

甲基尿石素A原料藥[武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部周本宏教授合成惠贈(zèng)，純度（高效液相色譜法）：>97%]；油酸[阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號(hào)：O108484]；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所，批號(hào)：CK04）；組織細(xì)胞TG酶法測(cè)定試劑盒（北京普利萊技術(shù)有限公司，批號(hào)：E1013）；BCA 蛋白定量試劑盒、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液、M-PERTM哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑、InvitrogenTM TRIzolTM RNA提取試劑、InvitrogenTM SuperScriptTM Ⅳ逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Thermo Fisher Scientific公司）；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；脂肪酸合成酶（FASN）、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP-1）、過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPAR-α）、PPAR-γ、β-actin的上下游引物（美國Invitrogen公司）；兔FASN單克隆抗體、兔β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（美國CST公司，批號(hào)分別為C20G5、4970、7074）；熒光定量PCR試劑（上海星漢生物科技有限公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；牛血清白蛋白（BSA，北京索萊寶科技有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS（pH 7.4）、0.25%胰蛋白酶溶液、青霉素-鏈霉素雙抗（美國Hyclone公司）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠試劑盒（美國EpiZyme Scientific公司）；油紅O染液（武漢谷歌生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人肝癌Huh-7細(xì)胞購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Huh-7細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“培養(yǎng)基”），在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（以下培養(yǎng)條件相同）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，先經(jīng)胰蛋白酶消化后，再進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 藥物溶液配制

2.2.1 油酸溶液 吸取油酸10 μL，加入0.1 mol/L NaOH溶液305 μL，于70 ℃水浴中加熱30 min，制成100 mmol/L的油酸母液；以10%BSA溶液稀釋制成10 mmol/L的油酸溶液，以0.22 μm濾膜濾過即得，于-20 ℃條件下保存，備用。

2.2.2 甲基尿石素A溶液 稱取甲基尿石素A原料藥48.2 mg，以二甲基亞砜1 mL溶解制成200 mmol/L的母液，于-20 ℃條件下保存，備用。臨用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋制成20 mmol/L的溶液，以0.22 μm濾膜濾過后使用 。

2.3 造模/給藥濃度篩選

2.3.1 油酸造模濃度篩選 （1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh-7細(xì)胞，以5×104個(gè)/孔的密度接種于12孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h后，分為對(duì)照組和不同濃度油酸組。其中，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，其余組分別加入含油酸終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取細(xì)胞用PBS清洗3次，75%乙醇固定20 min，在避光條件下以油紅O染液染色30 min[11]，PBS清洗后在顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況；然后每孔加入60%異丙醇0.5 mL，室溫放置15 min以充分溶解細(xì)胞上附著的染液[12]；采用酶標(biāo)儀于485 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（A），A值越大則表明脂質(zhì)含量越高。（2）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh-7細(xì)胞，以8×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，分為對(duì)照組和不同濃度藥物組（加樣量同“（1）”項(xiàng)下），培養(yǎng)24 h。另設(shè)不含細(xì)胞、只加入培養(yǎng)基的空白組。每孔加入CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔A值，并計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=（A給藥組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%]。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.2 甲基尿石素A給藥濃度篩選 按“2.3.1（2）”項(xiàng)下方法接種細(xì)胞、培養(yǎng)，分為對(duì)照組和不同濃度甲基尿石素A組，并另設(shè)空白組。其中，空白組、對(duì)照組同法處理，其余組分別加入含甲基尿石素A終濃度為5、10、20、40、80 μmol/L的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。按“2.3.1（2）”項(xiàng)下方法，自“每孔加入CCK-8 試劑10 μL……”起同法操作，測(cè)定并計(jì)算細(xì)胞存活率。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 甲基尿石素A對(duì)細(xì)胞中脂質(zhì)累積的影響考察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh-7細(xì)胞，以8×104個(gè)/孔的密度接種于12孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h后，分為對(duì)照組、模型組（劑量根據(jù)“2.3.1”項(xiàng)結(jié)果確定）、低劑量藥物組（劑量根據(jù)“2.3.2”項(xiàng)結(jié)果確定）和高劑量藥物組（劑量根據(jù)“2.3.2”項(xiàng)結(jié)果確定）。其中，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，其余組分別加入含相應(yīng)終濃度油酸或油酸+甲基尿石素A的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。然后按“2.3.1（1）”項(xiàng)下方法，自“取細(xì)胞用PBS清洗3次，75%酒精固定20 min……”起同法操作，進(jìn)行油紅O染色，觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況并測(cè)定各孔A值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 甲基尿石素A對(duì)細(xì)胞中TG含量的影響考察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh-7細(xì)胞，以5×106個(gè)/皿的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，每皿5 mL，培養(yǎng)24 h后，按“2.4”項(xiàng)下方法分組、給藥及培養(yǎng)。按照TG酶法測(cè)定試劑盒說明書步驟，測(cè)定細(xì)胞中TG含量。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 甲基尿石素A對(duì)細(xì)胞中FASN、SREBP-1、PPAR-α、PPAR-γ的mRNA表達(dá)的影響考察

采用PCR法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh-7細(xì)胞，以2×106個(gè)/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后，按“2.4”項(xiàng)下方法分組、給藥及培養(yǎng)。采用TRIZol試劑抽提細(xì)胞RNA，并采用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后檢測(cè)FASN、SREBP-1、PPAR-α、PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系（10 μL）組成：cDNA 0.5 μL，上下游引物1.0 μL，2×Taq PCR Mix 5.0 μL，雙蒸水3.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)（引物序列見表1）。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法[13]計(jì)算相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平（Ct表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列

Tab 1 Primer sequence

[基因名稱＼&引物序列 ＼&序列長(zhǎng)度，bp＼&β-actin＼&正向：5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′＼&190＼&＼&反向：5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′＼&＼&FASN＼&正向：5′-TGGTCTTTCTGTGCTTGGATT-3′＼& 80＼&＼&反向：5′-GGAGTCTTGGCAGGGTGGA-3′＼&＼&SREBP-1＼&正向：5′-GGCACGGGAGGATGGACT-3′＼&130＼&＼&反向：5′-GCTTCTTTGCTGTGAGATGACC-3′＼&＼&PPAR-α＼&正向：5′-CCCAGTGGAGCATTGAACAT-3′＼&223＼&＼&反向：5′-GTGACATCCCGACAGAAAGG-3′＼&＼&PPAR-γ＼&正向：5′-CTCTCCGTAATGGAAGACCAC-3′＼&184＼&＼&反向：5′-CAGGCTCCACTTTGATTGCAC-3′＼&＼&]

2.7 甲基尿石素A對(duì)細(xì)胞中FASN的蛋白表達(dá)的影響考察

采用Western blotting法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh-7細(xì)胞，按“2.5”項(xiàng)下方法接種、分組、給藥及培養(yǎng)。用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑（三者體積比為 1 ∶ 1 ∶ 98），冰上裂解30 min；在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液稀釋10倍，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。加入蛋白上樣緩沖溶液，混勻，于95 ℃變性5 min，-20 ℃保存，待測(cè)。取變性后的蛋白樣品40 μg進(jìn)行SDS- PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h；分別加入FASN、β-actin一抗（1 ∶ 1 000），4 ℃培養(yǎng)過夜，然后以TBST緩沖液清洗10 min×3次；加入二抗（1 ∶ 8 000），室溫孵育1 h，以TBST緩沖液清洗10 min×3次；加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。采用凝膠成像儀檢測(cè)，以Image J 1.8.0軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)灰度值，用來表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 油酸和甲基尿石素A的造模/給藥濃度

油紅O染色結(jié)果顯示，1.0～2.5 mmol/L的油酸均能使細(xì)胞中形成大量脂滴累積；當(dāng)油酸濃度≥2.0 mmol/L時(shí)，細(xì)胞形態(tài)萎縮、數(shù)量減少。細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著油酸或甲基尿石素A作用濃度的升高，細(xì)胞存活率隨之下降；當(dāng)油酸≤1.0 mmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率>80%；當(dāng)甲基尿石素A濃度≤20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率>80%。因此，選擇1.0 mmol/L為油酸的造模濃度，10、20 μmol/L為甲基尿石素A的給藥濃度，在這一濃度條件下，兩者對(duì)細(xì)胞均無明顯毒性。不同濃度油酸作用下各組細(xì)胞脂質(zhì)累積情況顯微圖見圖1，不同濃度油酸或甲基尿石素A作用下各組細(xì)胞存活率見圖2。

3.2 甲基尿石素A對(duì)細(xì)胞中脂肪累積的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞鏡下可見有明顯的脂肪累積現(xiàn)象，細(xì)胞膜周圍有大量紅色脂滴；A值檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞中脂質(zhì)含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，低、高劑量藥物組細(xì)胞鏡下可見紅色脂滴明顯減少；A值檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞中脂質(zhì)含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組細(xì)胞脂質(zhì)累積情況顯微圖見圖3，脂質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果見圖4。

3.3 甲基尿石素A對(duì)細(xì)胞中TG含量的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中TG含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，低、高劑量藥物組細(xì)胞中TG含量均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組細(xì)胞中TG含量測(cè)定結(jié)果見圖5。

3.4 甲基尿石素A對(duì)細(xì)胞中FASN、SREBP-1、PPAR-α、PPAR-γ的mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，PPAR-α的mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，低、高劑量藥物組細(xì)胞中FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而PPAR-α的mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組細(xì)胞中FASN、SREBP-1、PPAR-α、PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果見圖6。

3.5 甲基尿石素A對(duì)細(xì)胞中FASN蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中FASN的蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，低、高劑量藥物組細(xì)胞中FASN蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組細(xì)胞FASN的蛋白電泳圖見圖7，蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果見圖8。

4 討論

NAFLD的典型特征是肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚，而TG作為積聚脂質(zhì)的主要成分，其累積主要是由其合成與轉(zhuǎn)化之間的不平衡引起的[14]。研究表明，機(jī)體脂肪酸過量累積能促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化及脂質(zhì)合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的生成，使大量脂肪堆積，從而引起肥胖[15]。脂肪酸的大量積聚會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成慢性損傷，這一過程與NAFLD的慢性肝脂肪變性相似[14]。油酸是人體內(nèi)天然存在的一種脂肪酸，以其為誘導(dǎo)劑建立脂質(zhì)累積模型的方法已被廣泛應(yīng)用，具有成本低、耗時(shí)短、可較好地模擬NAFLD狀態(tài)下肝細(xì)胞損傷的優(yōu)點(diǎn)[16]。肝癌細(xì)胞具有易于培養(yǎng)、穩(wěn)定等特點(diǎn)[17]，是目前研究NAFLD常用的細(xì)胞模型。因此，本研究以人肝癌Huh-7細(xì)胞為對(duì)象，采用油酸誘導(dǎo)建立體外脂質(zhì)累積細(xì)胞模型。

FASN是脂肪合成的關(guān)鍵酶，可催化乙酰輔酶 A 和丙二酰輔酶A從頭合成長(zhǎng)鏈軟脂酸棕櫚酸酯的所有步驟，其編碼基因的表達(dá)直接影響脂肪酸的合成，對(duì)調(diào)控機(jī)體脂肪酸累積具有重要意義[18]。Kim KH等[19]研究證實(shí)，抑制FASN的表達(dá)能抑制肝脂質(zhì)累積，改善肝脂肪變。SREBP-1是調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，PPARs對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成、運(yùn)輸和儲(chǔ)存具有重要的調(diào)節(jié)作用[20]。FASN、SREBP-1、PPAR-α和PPAR-γ均為調(diào)節(jié)脂肪酸從頭合成和TG合成的關(guān)鍵因子，PPAR-γ的表達(dá)增強(qiáng)能促進(jìn)前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化[21]；SREBP-1的表達(dá)增強(qiáng)能激活FASN的表達(dá)；FASN的表達(dá)增強(qiáng)，能促進(jìn)脂質(zhì)合成，顯著增加脂質(zhì)在體內(nèi)沉積[22]。PPAR-α是線粒體脂肪酸β氧化過程中的關(guān)鍵酶，能使脂肪酸從線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體基質(zhì)中被代謝[16]。由此可見，F(xiàn)ASN、SREBP-1、PPAR-γ對(duì)機(jī)體脂質(zhì)累積具有正向調(diào)節(jié)作用，而PPAR-α對(duì)脂質(zhì)累積具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，油酸誘導(dǎo)后，細(xì)胞中FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平及FASN的蛋白表達(dá)水平均顯著升高，PPAR-α的mRNA表達(dá)水平顯著降低，提示肝細(xì)胞中脂質(zhì)累積可能是由于脂肪酸的從頭合成增強(qiáng)，從而激活脂質(zhì)攝取和抑制脂質(zhì)分解而引起的。采用甲基尿石素A干預(yù)后，能明顯抑制油酸誘導(dǎo)的細(xì)胞中脂質(zhì)累積，降低細(xì)胞中TG含量；細(xì)胞中FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA和FASN的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，而PPAR-α的mRNA表達(dá)水平無顯著變化。由此推測(cè)，甲基尿石素A可能主要通過抑制脂肪酸從頭合成途徑來抑制脂質(zhì)累積，而并未激活脂肪酸β氧化途徑，故對(duì)PPAR-α 的mRNA表達(dá)無顯著影響。

綜上所述，甲基尿石素A可能通過下調(diào)FASN、SREBP-1、PPAR-γ等相關(guān)因子的表達(dá)，抑制脂肪酸從頭合成、促進(jìn)脂質(zhì)代謝，從而降低細(xì)胞內(nèi)TG含量、改善油酸誘導(dǎo)的細(xì)胞中脂質(zhì)累積狀態(tài)，在NAFLD的防治領(lǐng)域具有一定的藥用潛力。

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（收稿日期：2018-09-07 修回日期：2019-01-25）

（編輯：段思怡）