山桃外植體的安全消毒方法研究

張雪冰 王鴻 張帆 陳建軍 李寬瑩

摘要：以甘肅山桃為材料，采用 75% 的乙醇、0.1% 的氯化汞（HgCl2）、消毒片（有效氯500 mg/片）、新型植物組織培養(yǎng)防污染殺菌劑植培靈和益培隆，對(duì)材料莖段消毒效果行進(jìn)比較，以篩選出合理有效的消毒方法來替代氯化汞消毒。結(jié)果表明：采用 0.1% 的氯化汞（HgCl2）與75%乙醇組合使用的消毒效果要明顯好于消毒片，植培靈和益培隆的污染率均為0%，其中益培隆的死亡率高于植培靈。綜合考慮污染率、死亡率、對(duì)植物生長的影響以及廢液對(duì)環(huán)境的影響等因素，植培靈為替代傳統(tǒng)氯化汞（HgCl2）消毒的最佳選擇。

關(guān)鍵詞：山桃;外植體;消毒方法;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S662.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號(hào)：1001-1463（2019）06-0029-04

Abstract：In this paper， the influence of genetic factors and environmental factors on seed vigor of corn were summarized. The determination methods of seed vigor of corn were expounded. The research direction of seed vigor of corn was also forecasted.

Key words：Corn; Seed vigor; Environmental factors; Genetic factors; Research

核果類果樹是我國果樹栽培的重要種類。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人民生活水品的提高，現(xiàn)有的果品品種已經(jīng)滿足不了人們的需求，當(dāng)務(wù)之急選育出優(yōu)良品種十分重要，而組培快繁技術(shù)為果樹的遺傳育種開辟了新道路[1 ]。桃是薔薇科桃屬核果類果樹，現(xiàn)利用組培快繁技術(shù)，能夠有效的縮短苗木繁育周期，提高種苗的繁育系數(shù)，同時(shí)也促進(jìn)了桃的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[2 ]。果樹是一種高度雜合體， 實(shí)生苗間差異很大， 常常影響試驗(yàn)結(jié)果。莖尖無性繁殖可以獲得大量苗木，能為這類試驗(yàn)提供整齊一致的理想試驗(yàn)材料[3 - 4 ]。然而，外植物污染是植物組織培養(yǎng)的三大難題之一，污染的主要原因之一就是外植體帶菌[5 ]。首先是外植體的選取，其中包括選取部位和選取時(shí)間;其次是外植體消毒方法的選擇，一般外植體的表面和內(nèi)部都會(huì)攜帶一些菌，而這些菌直接影響到組培苗的生? ? ?長[6 ]。為了減少外植體的污染率，應(yīng)該盡可能選取帶菌少并且不攜帶內(nèi)生菌的材料作為外植體，選擇消毒效果顯著且對(duì)環(huán)境污染小的滅菌劑，有助于建立起綠色環(huán)保又有效的滅菌培養(yǎng)體系[7 ]。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

6月初選取山桃[Amygdalus davidiana? （Carrière） de Vos ex Henry]1年生嫩枝作為試驗(yàn)材料，采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所蘭州實(shí)驗(yàn)基地，以中上部分帶芽莖段為外植體。

1.2? ?試驗(yàn)方法

預(yù)處理：將田間采回的試驗(yàn)材料用自來水沖洗30 min，剪成2～3 cm帶芽莖段。在超凈工作臺(tái)上將剪好的莖段用無菌水漂洗1遍。

試驗(yàn)分4個(gè)處理。處理①：75% 乙醇+ 0.1%的氯化汞（HgCl2）作消毒試劑，在 75% 的乙醇中浸泡30 s 后，再用 0.1% HgCl2浸泡相應(yīng)的處理時(shí)間，用無菌水把殘留物沖洗干凈后接入培養(yǎng)基中，觀察培養(yǎng)結(jié)果。0.1% HgCl2浸泡相應(yīng)的處理時(shí)間分別是30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min。處理②：75% 的乙醇+消毒片（有效氯500 mg/片）作消毒試劑，在 75% 的乙醇中浸泡30 s后，再用消毒片（有效氯500 mg/片）浸泡相應(yīng)的處理時(shí)間，最后用無菌水把殘留物沖洗干凈后接入培養(yǎng)基中，觀察培養(yǎng)結(jié)果。消毒片（有效氯500 mg/片）浸泡相應(yīng)的處理時(shí)間分別是30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min。處理③：新型植物組織培養(yǎng)防污染殺菌劑植培靈作消毒試劑，配置添加了不同濃度殺菌劑植培靈的培養(yǎng)基，然后將在超凈工作臺(tái)上處理好的莖段接入添加好不同濃度植培靈的培養(yǎng)基中并觀察培養(yǎng)結(jié)果。植培靈的處理濃度分別是，0.5 mL/L、1 mL/L、2 mL/L、3 mL/L、4 mL/L、5 mL/L、6 mL/L、7 mL/L。處理④：新型植物組織培養(yǎng)防污染殺菌劑益培隆作消毒試劑，配置添加了不同濃度殺菌劑益培隆的培養(yǎng)基，然后將在超凈工作臺(tái)上處理好的莖段接入添加好不同濃度益培隆的培養(yǎng)基中并觀察培養(yǎng)結(jié)果。處理濃度分別是A 0.1 mL/L +B 5 mg/L、A 0.2 mL/L +B 10 mg/L、A 0.3 mL/L +B 15 mg/L、A 0.4 mL/L +B 20 mg/ L、A 0.5 mL/L +B 25 mg/L、A 0.6 mL/L +B 30 mg/L、A 0.7 mL/L +B 35 mg/L、A 0.8 mL/L +B 40 mg/L、A 0.9 mL/L +B 45 mg/L、A 1.0 mL/L +? B 50 mg/L（根據(jù)使用說明，益培隆分A瓶、B瓶，消毒時(shí)需配合使用）。

2? ?結(jié)果與分析

從表1可知，在處理① 中，0.1% HgCl2消毒7 min 時(shí)污染率最低，同時(shí)死亡率也最高，達(dá)到 13.33%。從污染率和死亡率綜合考慮，0.1% 氯化汞（HgCl2）消毒5 min時(shí)消毒效果最好，污染率 3.33%，死亡率 6.67%。在達(dá)到顯著消毒效果的同時(shí)對(duì)植物本身的傷害又相對(duì)最小。從表2中可以看出，處理②中消毒片（有效氯500 mg/片）和 處理①0.1% HgCl2的消毒效果相比較，消毒片（有效氯500 mg/片）的消毒效果明顯較弱。消毒時(shí)間在7 min 時(shí)效果最好，污染率和死亡率分別是 13.33%和 3.33%。

從表3、表4來看，新型殺菌劑植培靈和益培隆的消毒效果比傳統(tǒng)消毒藥劑的消毒效果顯著。植培靈在培養(yǎng)基中的濃度為4 mL/L 時(shí)，消毒效果最好且死亡率為 0，污染率 3.33%。益培隆的消毒效果不如植培靈，且相對(duì)植培靈死亡率較高，當(dāng)益培隆在培養(yǎng)基中的濃度為A 0.5 mL/L +B 25 mg/L時(shí)消毒效果最好，其中污染率和死亡率分別是 10.00% 和 3.33%。

3? ?結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)傳統(tǒng)消毒藥劑 75% 的乙醇分別與 0.1%氯化汞、消毒片（有效氯500 mg/片）組合使用時(shí)，75%的乙醇消毒30 s 和 0.1% 氯化汞（HgCl2）消毒5 min組合消毒效果明顯最好，污染率和死亡率均低至 3.33%。新型殺菌劑植培靈的消毒效果與0.1%氯化汞（HgCl2）的消毒效果不相上下，植培靈在培養(yǎng)基中濃度為4 mL/L時(shí)消毒效果最好，污染率 3.33%，死亡率 0%。

在傳統(tǒng)消毒藥劑中，0.1% 氯化汞（HgCl2）的消毒效果最好，但殘留物最不易清除，且使用后的廢液會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，很難處理。我們篩選出的新型滅菌劑植培靈，由植物源提取，無毒無害，熱穩(wěn)定性好，可高溫滅菌，不產(chǎn)生抗藥性，不影響植物生長，并且消毒效果明顯比氯化汞（HgCl2）要好，也不會(huì)造成環(huán)境污染造，可作為替代傳統(tǒng)氯化汞（HgCl2）消毒方法的最佳選擇。

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（本文責(zé)編：陳? ? 珩）