星點設計—響應面法優(yōu)選高良姜的砂燙炮制工藝

鄧仙梅 黃斯敏 陳玉玲 孟江 趙斌

摘 要 目的：優(yōu)選高良姜的砂燙炮制工藝，為高良姜的規(guī)范化炮制提供科學依據。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）測定炮良姜中高良姜素和姜黃素含量。在單因素試驗基礎上，以炮制溫度、炮制時間為考察因素，以高良姜素和姜黃素含量的綜合評分為指標，采用星點設計-響應面法優(yōu)選高良姜的砂燙炮制工藝，并進行工藝驗證。結果：優(yōu)選的工藝為炮制溫度200 ℃、炮制時間5.5 min。3次驗證試驗中，平均綜合評分為94.38（RSD=1.02%），與預測值93.74的相對誤差為0.68%。結論：優(yōu)選的炮制工藝方法簡便、預測性良好，可用于高良姜的砂燙炮制。

關鍵詞 高良姜；炮良姜；砂燙炮制；星點設計-效應面法；高良姜素；姜黃素

Optimization of the Hot Sand Processing Technology for Alpinia officinarum by Central Composite Design- response Surface Method

DENG Xianmei1，HUANG Simin1，CHEN Yuling1，MENG Jiang2，ZHAO Bin3（1.Dept. of Pharmacy，Zhaoqing Medical College，Guangdong Zhaoqing 526000，China；2.School of TCM，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；3.Dept. of Pharmacology，Zhongshan Torch Polytechnic，Guangdong Zhongshan 528436，China）

ABSTRACT OBJECTIVE：To optimize the hot sand processing technology of Alpinia officinarum，and to provide scientific evidence for the standardized processing of A. officinarum. METHODS：The contents of galangin and curcumin in processed A. officinarum were determined by HPLC. Based on single factor test，using processing temperature and processing time as factors，comprehensive score of galangin and curcumin contents as index，central composite design-response surface method was used to optimize hot sand processing technology of A. officinarum，and the processing technology was validated. RESULTS：The optimal processing technology included processing temperature of 200 ℃ and processing time of 5.5 min. In validation tests，average comprehensive score was 94.38 （RSD=1.02%），relative deviation of which to predicted value 93.74 was 0.68%. CONCLUSIONS：The optimized processing technology is simple and predictable. It can be used for hot sand processing technology of A. officinarum.

KEYWORDS Alpinia officinarum； Processed Alpinia officinarum； Hot sand processing； Central composite design-response surface method； Galangin； Curcumin

高良姜是姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根莖[1]，屬于“十大南藥”之一，在歷版《中國藥典》中均有收載。高良姜是一味藥食兩用的中藥材，具有溫胃止嘔、散寒止痛的功效[1]。現代藥理研究表明，高良姜具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗?jié)兊淖饔?，并且對胃黏膜具有較好的保護作用[2]。而炮良姜則是高良姜經高溫炮制后得到的一種炮制品，在古籍記載的很多古方中高良姜都需制成炮良姜后方可入方使用，比如在《備急方》中記載治霍亂吐痢腹痛：“高良姜，火炙令焦香?！痹凇栋僖贿x方》中記載治心脾痛：“高良姜、檳榔等分，各炒。上為細末，米調下?！薄侗静菥V目》曰：“高良姜，紅豆蔻，并宜炒過入藥?！钡F代學者對于高良姜的研究都是集中在化學成分和藥理作用方面[3-7]，而關于高良姜的炮制研究尚是一片空白。在2015年版《中國藥典》（一部）（后文簡稱藥典）中，也僅有關于高良姜飲片的加工方法——“除去雜質，洗凈 ，潤透 ，切薄片 ，曬干?！盵1]沒有關于高良姜的相關炮制工藝和飲片質量標準。而在實際應用中，很多民間老中醫(yī)在用高良姜治療腸胃疾病時，都會將高良姜進行高溫炮制制成炮良姜后再入方使用。但因高良姜目前尚沒有一個可靠的炮制標準和質量標準，所以不能在企業(yè)生產，只能在用藥時臨方炮制，這直接限制了高良姜炮制品的生產和使用，也阻礙了對其進一步的開發(fā)和應用。因此，本課題組首次對高良姜的炮制工藝進行研究，擬填補該研究領域的空白。

中藥炮制的方法有很多，而根莖類中藥炒焦品的炮制方法主要有清炒法和砂燙法兩種。高良姜屬于根莖類中藥，故筆者首先對上述兩種炮制方法進行了對比研究。發(fā)現高良姜藥材質地比較堅硬，清炒法需要時間長且炒制程度不均勻，成品性狀也比較差；而砂燙法可使藥材受熱更均勻，且采取砂燙法制得的炮良姜外觀性狀也很好。故在本研究中，選取砂燙法作為高良姜的炮制方法。此外，據文獻報道，高良姜素和姜黃素是高良姜的主要活性成分[8-10]，其中高良姜素具有抗菌、抗病毒的作用[11]；姜黃素具有抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)等作用，并且對糖尿病及其導致的并發(fā)癥方面有較好的療效[11-12]。而近幾年來星點設計-響應面法被廣泛應用于中藥領域的工藝篩選研究[13-15]。因此，本研究擬采用星點設計-響應面法進行高良姜的炮制工藝設計，以炮制溫度、炮制時間為自變量，以其有效成分高良姜素、姜黃素的含量為評價指標，優(yōu)選高良姜的砂燙炮制工藝，為高良姜的炮制加工生產提供科學指導。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀，配備二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；BP124S型電子天平、BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；KQ250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LSF-80型高速粉碎機（常德市中藥機械廠）。

1.2 藥品與試劑

高良姜藥材于2017年8月26日采集于廣東省湛江市徐聞縣，經廣東藥科大學中藥學院劉基柱副教授鑒定為姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根莖；高良姜素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：k1706037，純度：≥99.0%）；姜黃素對照品（上海晶純實業(yè)有限公司，批號：c10087892，純度：≥98.0%）；實驗所用水為屈臣氏蒸餾水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 高良姜的砂燙炮制方法

將凈河砂（先用清水沖洗河砂后，撈起，曬干，并用鍋清炒至滑利狀態(tài)，取出晾涼，備用）置于鍋內，用中火加熱至一定溫度時，投入適量凈高良姜片[按2015年版《中國藥典》（一部）方法制備[1]]，不斷翻炒一定時間后取出，篩去河砂，放涼，即得。

2.2 HPLC法測定炮良姜中高良姜素和姜黃素含量

2.2.1 溶液的制備 （1）混合對照品溶液。分別稱取高良姜素、姜黃素對照品適量，精密稱定，置于不同量瓶中，加入甲醇溶解并制備成質量濃度分別為6.10、2.90 mg/mL的單一對照品母液，存放于4 ℃冰箱中，備用。分別精密吸收上述2個對照品母液150、200 μL，置于同一1 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，即得混合對照品溶液。（2）供試品溶液。取不同炮制條件的炮良姜樣品粉末（過三號篩）0.8 g ，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液25 mL，稱定質量，然后超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）提取40 min，室溫放冷，再次稱定質量，加甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，濾液再以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。（3）空白溶液。取甲醇溶液25 mL，稱定質量，然后超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）提取40 min，室溫放冷，再次稱定質量，加甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，濾液再以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Agilent-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.5%磷酸水（B），梯度洗脫（0～38 min，55%A；38～50 min，55%→65%A；50～55 min，65%→55%A）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min。在上述色譜條件下，精密吸取空白溶液、混合對照品溶液和供試品溶液（表3編號2條件制備的樣品）各10 μL，注入液相色譜儀進行分析，記錄色譜圖。結果表明，空白溶液無干擾；混合對照品溶液色譜圖中高良姜素、姜黃素分別在23.82、33.09 min時出峰，且峰形對稱；在供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上有相應的峰出現，且各峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論板數按高良姜素峰計不低于6 000。以上結果提示，該色譜條件的系統(tǒng)適用性良好，色譜圖見圖1。

2.2.3 標準曲線的繪制 分別精密吸取混合對照品溶液3、5、10、15、20、25 μL，按擬定色譜條件進行測定，記錄峰面積，并以進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標作圖，繪制標準曲線。結果，得到高良姜素的標準曲線方程為y=2 551.8x+626.98（R2=0.999 0），線性范圍為0.27～2.28 mg/mL；姜黃素的標準曲線方程為y= 1 309.8x-220.55（R2=0.999 1），線性范圍為0.117～1.45 mg/mL。

2.2.4 定量限與檢測限 分別取“2.2.1”項下高良姜素、姜黃素對照品溶液適量，倍比稀釋后，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1計算檢測限和定量限。結果，高良姜素、姜黃素的檢測限分別為34、27 ng/mL，定量限分別為124、95 ng/mL。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品液10 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.2”項下條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果，高良姜素、姜黃素峰面積的RSD分別為0.68%、0.73%（n=6），表明儀器精密度好。

2.2.6 重復性試驗 稱取同批藥材粉末（過三號篩）6份，每份0.8 g，精密稱定，按“2.2.1（2）”項下方法平行制備6份供試品溶液。分別精密吸取所制溶液10 μL注入液相色譜儀，按“2.2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積并計算高良姜素、姜黃素的含量。結果，高良姜素、姜黃素含量的RSD分別為1.13%、1.26%（n=6），表明采用該方法提取和檢測的重復性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 稱取炮良姜樣品粉末（按表3中方案2制備的樣品，過三號篩），按“2.2.1（2）”項下方法制備供試品溶液，然后精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h后，按“2.2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積并計算高良姜素、姜黃素的含量。結果，高良姜素、姜黃素含量的RSD分別為1.45%、1.26%（n=7），表明該供試液在室溫條件下24 h內穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的炮良姜樣品粉末（按表3中方案2制備的樣品，過三號篩）0.40 g，精密稱定，平行稱取6份，按1 ∶ 1的比例分別加入高良姜素、姜黃素對照品，然后再按“2.2.1（2）”方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積并計算高良姜素、姜黃素的回收率。結果，高良姜素、姜黃素的平均回收率分別為98.76%、96.52%，RSD分別為1.91%、2.03%（n=6），表明該方法準確度高?；厥章式Y果見表1。

2.3 單因素試驗

在砂燙法中影響成品質量的因素主要有溫度、時間及投藥量[16-18]，為篩選出高良姜的炮制工藝，本研究擬對這3個影響因素進行單因素考察，并測定各因素條件下制備樣品中高良姜素、姜黃素含量，再結合炮制后飲片性狀，以此為依據篩選出關鍵的影響因素。

2.3.1 炮制溫度 稱取大小均勻的高良姜藥材20 g，共5份，分別置于溫度為100、150、200、250、280 ℃的河砂中砂燙翻炒5 min，對各溫度條件下制備的樣品按建立方法進行含量測定。結果，高良姜素的含量隨著炮制溫度的升高而降低，而姜黃素的含量則隨著炮制溫度的升高而升高，其中在200 ℃時這兩者的含量相對較高（結果見圖2A），且此時所制炮良姜性狀為外表棕褐色，內部棕黃色，符合中藥炮制中炒焦品的常規(guī)性狀鑒別標準[1，16-18]，故以200 ℃為中心點設計星點設計-效應面試驗進一步優(yōu)化。

2.3.2 炮制時間 稱取大小均勻的高良姜藥材20 g，共5份，分別在200 ℃條件下進行砂燙翻炒2、5、8、10、12 min，然后按建立方法測定翻炒不同時間樣品中高良姜素、姜黃素含量。結果，高良姜素的含量隨著炮制時間的延長而降低，而姜黃素含量則隨著炮制時間的延長而呈現出一定的升高趨勢，其中在5 min時這兩者的含量均比較適中（結果見圖2B），且這時所制炮良姜性狀為外表棕褐色，內部棕黃色，符合中藥炮制中炒焦品的常規(guī)性狀鑒別標準，故以翻炒5 min為中心點設計星點設計-效應面試驗進一步優(yōu)化。

2.3.3 投藥量 分別稱取10、20、30、40、50 g藥材，分別在200 ℃下砂燙翻炒5 min，然后按建立方法測定不同投藥量樣品中高良姜素、姜黃素含量。結果，不同投藥量在同一溫度下翻炒相同時間所得樣品中的高良姜素、姜黃素含量變化不大（結果見圖2C），且所制樣品外觀性狀差異也不明顯，這表明投藥量對成品質量影響不大，故忽略該因素，不再進行進一步優(yōu)化。

2.4 星點設計-響應面法優(yōu)選高良姜的砂燙炮制工藝

2.4.1 試驗設計與結果 從單因素試驗結果可知，炮制溫度和炮制時間對炮良姜成品中有效成分含量及外觀性狀影響較大，而投藥量對成品有效成分含量及外觀性狀影響較小，故選取炮制溫度（A，℃）和炮制時間（B，min）作為進一步考察的自變量因素。以高良姜素、姜黃素含量加權評分的綜合得分（OD）為指標進行2因素5水平的試驗設計。根據本課題組前期對同產于廣東湛江徐聞縣多批高良姜藥材中高良姜素、姜黃素含量測定結果提示，高良姜素、姜黃素在高良姜飲片中的含量比值大概是3 ∶ 1～4 ∶ 1，且在歷版《中國藥典》中均以高良姜素的含量作為高良姜藥材的評價指標，故最終確定兩者的權重系數分別為0.8、0.2，即OD=（高良姜素含量/高良姜素含量最大值）×0.8×100+（姜黃素含量/姜黃素最大值）×0.2×100。按照星點試驗設計表所示條件，采用砂燙法進行炮良姜的工藝試驗，得到炮良姜成品，并采用上述建好的HPLC法測定各樣品中高良姜素、姜黃素含量含量。因素與水平見表2，星點試驗設計與結果見表3。

表2 因素與水平

Tab 2 Factors and levels

[水平＼&因素＼&炮制溫度（A），℃＼&炮制時間（B），min＼&-1.414＼&129.29＼& 0.55＼&-1＼&150＼& 2.0＼& 0＼&200＼& 5.5＼& 1＼&250＼& 9.0＼& 1.414＼&270.71＼&10.45＼&]

2.4.2 模型擬合與方差分析 根據試驗結果，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件，以OD值為因變量對各因素分別進行多元線性回歸和二項式擬合，得到多元線性回歸擬合方程為Y=82.20-9.97A-7.86B（P=0.0514，R2=0.365 4）；二次多項回歸擬合方程為Y=93.74-9.97A-7.86B-9.10AB-10.49A2-8.26B2（P=0.000 1，R2=0.991 0）。通過比較P值及相關系數R2 可看出，多元線性回歸擬合方程的P>0.05，表明建立的模型不具顯著性，R2值較低表示自變量與因變量之間的線性關系較差，擬合度低，預測性差，因此該擬合模型不適合；二次多項回歸擬合方程的P=0.000 1（<0.01），R2值較高，表明該模型具有極顯著性，擬合度高，預測性好，故選擇二次多項回歸擬合擬合模型為最佳模型，對該模型的回歸參數進行方差分析，結果見表4。

表4 方差分析結果

Tab 4 Analysis of variance

[來源＼&平方和＼&自由度＼&均方＼&F值＼&P值＼&模型＼&2 722.68＼&5＼&544.54＼&266.36＼&0.000 1＼&A＼&795.26＼&1＼&795.26＼&389.01＼&0.000 1＼&B＼&494.36＼&1＼&494.36＼&241.82＼&0.000 1＼&AB＼&331.06＼&1＼&331.06＼&161.94＼&0.000 1＼&A2＼&765.73＼&1＼&765.73＼&374.56＼&0.000 2＼&B2＼&474.81＼&1＼&474.81＼&232.26＼&0.000 1＼&殘差＼&14.31＼&7＼&2.04＼&＼&＼&失擬項＼&10.62＼&3＼&3.54＼& 3.84＼&0.113 2＼&純誤差＼&3.69＼&4＼&0.92＼&＼&＼&總和＼&2 736.99＼&12 ＼&＼&＼&＼&]

方差分析結果顯示，該二項式擬合模型的F值為266.36，P<0.01，表明模型具極顯著性；確定系數R2為0.991 0，說明方程的因變量與全體自變量之間的線性關系是顯著的，響應值的變化有99.10%是來源于本試驗所選的自變量。同時，方程的失擬項F值為3.84，P>0.05，表示失擬項不顯著，回歸方程在整個回歸區(qū)域內的擬合情況良好。

2.4.3 響應面分析 根據所擬合的二項式方程，應用Design-Expert 8.0.6.1軟件繪制炮制溫度和炮制時間交互作用對OD值影響的三維響應面圖。結果顯示，在炮制溫度升高及炮制時間延長時OD值逐漸降低。綜合該軟件效應面優(yōu)化工藝結果及性狀觀察的實際情況，最終得出高良姜最佳的炮制工藝為：炮制溫度200 ℃、炮制時間5.5 min。炮制溫度和炮制時間對2種含量綜合評分影響的響應面圖和等高線圖見圖3。

2.4.4 工藝驗證 按上述優(yōu)選出來的炮制工藝條件重復進行3次試驗。結果，高良姜素、姜黃素含量的平均值分別為7.78、2.79 mg/g，RSD分別為1.27%、1.19%（n=3）；OD的平均值為94.38，RSD為1.02%（n=3），與預測值93.74相對誤差為0.68%（<3%）。此外，在該條件下制備的炮良姜性狀為外表棕褐色，內部棕黃色，符合中藥炮制中炒焦品的常規(guī)性狀鑒別標準，說明優(yōu)選的擬合方程可較好地預測高良姜的炮制工藝。該結果表明，該方法應用于高良姜的炮制工藝研究有效、可行，且該炮制工藝穩(wěn)定性較好。

3 討論

中醫(yī)認為“焦香醒脾胃”，是指中藥飲片炒焦后產生的焦香氣味具有健脾胃的功效，這也是炮制過程中提示藥材已炮制好的一個判斷標準，炒焦前后藥物的化學成分可能會發(fā)生變化，還可能會產生新的物質，并且可能共同發(fā)揮消食導滯的作用[19]。中藥材經高溫砂燙炮制后其化學成分含量及種類都會發(fā)生變化，從而引起其功效主治的改變[20-23]。同為姜科的干姜具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的功效。臨床上主要用于脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、寒飲喘咳等病癥。而干姜經過砂燙制成炮姜后功效變?yōu)闇亟浿寡?、溫中止痛，臨床上主要用于陽虛失血、吐衄崩漏、脾胃虛寒等病癥[1]。而與干姜同科的高良姜在炮制成炮良姜后其化學成分會有何變化？其功效會發(fā)生與干姜類似的變化嗎？為何古籍中用高良姜治療腸胃疾病時要先對其進行“火炙令焦香”才入方使用呢？本課題組研究發(fā)現，樣品中的高良姜素隨著炮制溫度的升高及炮制時間的延長，其含量逐漸下降；而姜黃素的含量則在一定范圍內隨著炮制溫度的升高及炮制時間的延長而呈現出上升的趨勢，但上升到一定程度后又下降。藥典中要求高良姜飲片中高良姜素含量不得低于0.70%，本試驗所制炮良姜中高良姜素含量約為0.76%，依然符合藥典要求，表明該工藝所制炮良姜飲片質量是合格的。關于其成分變化的具體研究結果，本課題組將另文報道，并且會在此基礎上進一步對炮良姜對腸胃的藥理作用進行研究，從而為古籍中記載的治療霍亂吐痢腹痛等腸胃疾病需用炮良姜提供實驗依據。

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（收稿日期：2018-12-06 修回日期：2019-01-29）

（編輯：林 靜）