一款胚芽為核心的八寶粥的營養(yǎng)成分分析及體外活性評價

韓曉峰 王成祥 文劍 馬芙俊 馬淑紅 段盛林

摘?要：研究了一款以胚芽為核心的八寶粥的營養(yǎng)成分和抗氧化性能力，以及胚芽球蛋白對RAW 264.7巨噬細(xì)胞的增殖作用。首先測定了此款八寶粥的各種氨基酸含量，重點考察了γ-氨基丁酸（GABA）的含量;其次分別采用還原Fe3+、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、鄰苯三酚自氧化法和Folin-Ciocalteu法測定了該產(chǎn)品的總還原力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和總多酚的含量;最后分離提取出胚芽球蛋白，并且通過細(xì)胞實驗分析球蛋白對巨噬細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明：該產(chǎn)品氨基酸含量豐富，尤其是GABA含量比較突出，該產(chǎn)品具有很好的抗氧化能力;巨噬細(xì)胞的增殖實驗表明，該產(chǎn)品具有提高機(jī)體的免疫能力的潛力。

關(guān)鍵詞：八寶粥;胚芽;營養(yǎng)成分;抗氧化性;巨噬細(xì)胞增殖

粥作為商品化的食品形式，往往被打上“快消品”和添加較多防腐劑、穩(wěn)定助劑的標(biāo)簽[1-4]，我們研究團(tuán)隊在前期的工作中已經(jīng)成功解決了以胚芽為核心的八寶粥（下稱胚芽粥）的穩(wěn)定性問題[5]，在不添加助劑的情況下能夠形成自穩(wěn)定體系[6]，并且以玉米胚芽和小麥胚芽為核心原料，對食材中的糙米、綠豆和鷹嘴豆進(jìn)行發(fā)芽處理，達(dá)到強(qiáng)化重點營養(yǎng)素的目的，同時口感和風(fēng)味優(yōu)于對比產(chǎn)品。本研究在解決穩(wěn)定性和適口性的基礎(chǔ)上，通過分析檢測和功能評價進(jìn)一步考察胚芽粥的營養(yǎng)成分和抗氧化能力。巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫的重要組成[7]，球蛋白是胚芽中的主要蛋白之一，植物中的球蛋白具有免疫調(diào)節(jié)作用[8]。本研究通過細(xì)胞實驗評價了胚芽球蛋白對巨噬細(xì)胞的增殖能力。

1?材料和試劑

1.1?原料與試劑

1.1.1?胚芽粥原輔料?玉米胚芽粉、小麥胚芽粉、鷹嘴豆、綠豆、糙米、胡蘿卜、玉米粒、糯米、普通大米、魔芋粉、木糖醇、燕麥纖維、低聚果糖和變性淀粉，同福碗粥股份有限公司;品牌A燕麥粥、品牌B燕麥粥，超市購買。

1.1.2?試劑?福林試劑、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品、Tris-HCl、Folin-Ciocalteu試劑、氨基乙酸Glycine、考馬斯亮藍(lán)，美國Sigma化學(xué)公司;重蒸苯酚、次氯酸鈉、無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、濃鹽酸、碳酸鈉、沒食子酸、氯化鈉、正己烷、亞硫酸、硫酸銨，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純;十二烷基磺酸鈉（SDS）、丙烯酰胺（Acr）、N-N甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、β-巰基乙醇，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;蒸餾水，屈臣氏;DMEM培養(yǎng)基、噻唑蘭（MTT）、胰蛋白酶、平衡鹽緩沖液（HBSS），太和華美（北京）醫(yī)藥科技股份有限公司;胎牛血清（FBS），北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司;無FFA牛血清蛋白（BSA），日本W(wǎng)AKO公司;Western 洗膜盒、TME顯色液，碧云天生物技術(shù)有限公司;RAW 264.7巨噬細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.2?儀器與設(shè)備

微量移液槍，德國Eppendorf 公司;RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器有限公司;pH計、精密電子天平CP214，瑞士Mettler Toledo 公司;759-紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司;DK-8D三溫三控水槽，上海博迅實業(yè)有限公司;KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;SHA-B水浴恒溫振蕩器，金壇市精達(dá)儀器制造廠;SHZ（III）循環(huán)水式真空泵，河南省予華儀器有限公司;LGJ-18真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司;全波長酶標(biāo)儀，美國熱電集團(tuán);高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼公司;凝膠色譜系統(tǒng)1525型，沃特世科技（上海）有限公司;全自動氨基酸分析儀L-8900，株式會社日立制作所;凝膠成像儀QUANTUM VILBER LOURMAT，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司;賽洛捷克 Scilogex MX-F固定式旋渦混合器、掌上離心機(jī)Scilogex D1008&D1008E，北京言必信有限公司;電泳槽Biorad Mini-PROTEAN Tetra Cells，伯樂BIO-RAD;脫色搖床 WD-94056D，北京市六一儀器廠;醫(yī)用低溫保存箱（-80℃）DW-86L728J，青島海爾特種電器有限公司。

2?胚芽粥的制備

2.1?胚芽粉的制備

選取小麥胚芽和玉米胚芽按比例混合，經(jīng)過清洗、脫硫、提取、酶解、過濾、濃縮、殺菌、噴霧干燥，最終得到成品原料胚芽粉（圖1）。

2.2?鷹嘴豆、綠豆和糙米的發(fā)芽處理

鷹嘴豆、綠豆和糙米清洗瀝干后用0.2mol/L的次氯酸鈉溶液消毒25min，再次沖洗。鷹嘴豆、綠豆和糙米加入水，沒過1cm。35℃水浴鍋恒溫水浴10～24h，5～6h換1次水，沖洗3次。經(jīng)過浸泡，有明顯的小芽冒出后，水沖洗3次，紗布覆蓋，加入少量水，保持濕潤，在35℃水浴中發(fā)芽10～12h。

2.3?胚芽粥的制備工藝

將鷹嘴豆、綠豆和糙米進(jìn)行發(fā)芽處理后，胡蘿卜切丁備用，將所有原料攪拌均勻，備用。將木糖醇、燕麥纖維等配制成糖液。填量300g/碗，封口溫度≥175℃。將灌裝好的半成品放入殺菌鍋，121℃高溫殺菌40min（圖2）。

3?實驗方法

3.1?受試物制備

3.1.1?胚芽粥原料的水提取物制備方法?將未發(fā)芽和發(fā)芽后的綠豆和糙米分別粉碎，室溫晾干，再次粉碎，過60目篩，粉末備用。檢測前分別取待測粉末，稱量2.5g，加適量蒸餾水研磨勻漿，然后定容至50mL，30℃水浴中浸提2h，抽濾，凍干機(jī)干燥。

3.1.2?胚芽粥與對比產(chǎn)品處理方法?取6g胚芽粥和其他樣品，加適量蒸餾水研磨均勻，然后定容到50mL，于30℃水浴浸提2h抽濾，凍干機(jī)干燥。

3.2?產(chǎn)品營養(yǎng)素分析

3.2.1?原料和胚芽粥中γ-氨基丁酸（GABA）含量測定?按照吳波等[9]的測定方法，于645 nm波長處測定其吸光度。取準(zhǔn)確配制好的0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液測定其吸光度，以GABA濃度為橫坐標(biāo)、以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。

3.2.2?胚芽粥氨基酸含量的測定?依據(jù)“GB/T 5009.?124—2003 食品中氨基酸的測定”方法。

3.3?抗氧化性能測定

3.3.1?總還原能力的測定?按照測定方法[10]，分別加入1mL pH 6.6的0.2 mol/L PBS 緩沖液、1mL 1%鐵氰化鉀溶液、1mL提取樣液于試管中，搖勻后置于50℃水浴中加熱20min，待冷卻后再加入1mL 10%三氯乙酸溶液并搖勻，離心（3 000r/min，10min）;吸取2mL于另一只試管中，加入3mL蒸餾水和0.2mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10min，于700nm處測定反應(yīng)體系的OD值，以蒸餾水為參照。

3.3.2?DPPH自由基清除率的測定?按照本課題組的測定方法[10]，稱取0.007 9g DPPH 用無水乙醇溶解，定容至100mL。 按照表1加樣后，避光反應(yīng)30min，利用紫外-可見分光光度計法在波長517 nm處測定吸光值，以吸收的下降表示其對有機(jī)自由基消除能力。統(tǒng)一蒸餾水做空白。

3.3.3?超氧陰離子自由基清除能力的測定?采用鄰苯三酚自氧化法，測定發(fā)芽糙米中的超氧陰離子自由基的清除能力，以此代表抗氧化活性：在2.4mL Tris-HCl緩沖液（pH值8.2）中加入0.1mL提取液，混勻后加入0.3mL濃度為7mmol/L的鄰苯三酚開始反應(yīng)，4min時加入1滴濃度為10mol/L的濃鹽酸終止反應(yīng)，隨后在波長325nm處測定體系的吸光度（A1）。對超氧陰離子自由基的清除能力用TR表示，計算公式為式（1）：

TR=（A0-A1）/A0×100%（1）

式（1）中：A0—空白管的吸光度。

3.3.4?總多酚含量的測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取0.5g沒食子酸，溶于40mL蒸餾水中，定容到100mL。再用配好的溶液1mL稀釋至100mL，即為濃度為0.05mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）樣品測定：采用Folin-Ciocalteu方法進(jìn)行測定。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確吸取多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10.0mL容量瓶中，各加6.0mL水，搖勻。加入0.5mL福林試劑，充分搖勻，1min后加20%的Na2CO3溶液1.5mL，搖勻，用去離子水定容至10.0mL，70℃水浴加熱10min，冷卻后在765nm下測定吸光度，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)、以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。

3.4?胚芽球蛋白的分離及鑒定

3.4.1?胚芽球蛋白的提取?依據(jù)朱科學(xué)等[11]的提取方法，取胚芽粉以1∶8的重量比加入正己烷，搖床常溫攪拌12h，靜止0.5h棄去上清液，沉淀用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)試劑，得到脫脂胚芽粉。準(zhǔn)確稱取一定量脫脂胚芽粉，按1∶5重量比加入去離子水，室溫下攪拌30min、3 000 r/min離心15min，棄去上清液;重復(fù)此操作1次;向沉淀中加入1L 3% NaCl溶液，室溫下攪拌浸提30min，3 000r/min離心15min，收集上清液;繼而加 500mL 3% NaCl溶液于沉淀中，進(jìn)行相同的操作，收集上清液。將2次所得的上清液合并，邊攪拌邊加入飽和硫酸銨溶液至溶液半飽和;3 000 r/min離心15min，棄去上清液取沉淀，沉淀用去離子水分散;3 000r/min離心15min，用去離子水洗滌沉淀，相同條件離心，獲得的沉淀置于培養(yǎng)皿中，冷凍干燥即為胚芽球蛋白，實驗備用。

3.4.2?電泳測定?制膠：將分離膠混勻后灌入玻璃板間，以水封頂，保持液面水平，倒棄分離膠上的水，并用濾紙吸干多余水分，加入上濃縮膠，立即將梳子插入玻璃板間。15～30min完全聚合后，小心拔出梳子，然后將玻璃板固定在電泳槽上。樣品前處理：將樣品配制成溶液加入5×SDS上樣緩沖液（4∶1 體積比），100℃加熱3～5min，12 000g離心1min，取上清作SDS-PAGE分析。上樣：取15μL樣品加入樣品池，并加入Marker。電泳：濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)行至電泳槽下端停止。染色：將膠從玻璃板中取出，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色，脫色搖床上室溫染色1h。脫色：將膠從染色液中取出，放入脫色液中，更換3～4次脫色至蛋白帶清晰。凝膠可保存于雙蒸水中或7%乙酸溶液中。

3.5?胚芽球蛋白巨噬細(xì)胞增殖實驗

取生長良好、對數(shù)生長期的RAW 264.7巨噬細(xì)胞，PBS洗3次，胰酶消化后進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為105個/mL，接種于96孔板，每孔200μL，置于5% CO2 37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)上清液，PBS洗去未貼壁細(xì)胞，分別加入100μL DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS）和不同濃度胚芽球蛋白（0.1～1 000μg/mL）。每組設(shè)6個復(fù)孔，置于5% CO2 37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，換成100μL無血清DMEM培養(yǎng)基，每孔加50μL MTT（2mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，于振蕩儀振蕩10min后，使用酶標(biāo)儀測490nm下的各孔OD值。獨(dú)立批次細(xì)胞實驗重復(fù)3次。

4?結(jié)果與分析

4.1?產(chǎn)品營養(yǎng)素分析結(jié)果

4.1.1?GABA含量

由圖5可知，糙米和綠豆發(fā)芽后其GABA含量都有所提高，其中綠豆發(fā)芽和未發(fā)芽GABA含量都高于糙米?？傮w來看，發(fā)芽能夠一定程度提高糙米和綠豆中GABA的含量。

4.1.2?氨基酸測定?從表2、圖6中可知，胚芽粥中含有18種氨基酸，蛋白含量為0.93g/100g。胚芽粥中含有人體必需的8種必需氨基酸：Thr（0.030 4%）、Val（0.047 7%）、Met（0.017 4%）、Ile（0.032 8%）、Leu（0.082 5%）、Phe（0.050 1%）、Lys（0.046 6%）、Trp（0.011 3%）。由此可見，胚芽粥中的氨基酸組成豐富。

4.2?抗氧化實驗結(jié)果

4.2.1?總還原能力的測定?還原力強(qiáng)弱與抗氧化性溶液濃度呈正相關(guān)性，即樣品提取物濃度越大，則吸光值越大，進(jìn)而可知其還原力越大。由圖7可知，發(fā)芽后糙米、綠豆的還原能力較未發(fā)芽時都有所提高，其中綠豆提高比較明顯。胚芽粥相比于普通大米粥、品牌A燕麥粥、品牌B燕麥粥的總還原能力要高，說明發(fā)芽有助于提高原料的抗氧化能力。

4.2.2?DPPH自由基清除率的測定?根據(jù)DPPH自由基的單電子在517 nm處有一強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色的特性。由于自由基清除劑能夠與單電子配對而使得吸收逐漸消失，因此，褪色程度越大，樣品中自由基清除劑越多，抗氧化能力越好。由圖8可知，發(fā)芽糙米的DPPH清除能力較未發(fā)芽時要強(qiáng)，綠豆發(fā)芽前后的DPPH清除能力沒有很大差異。同時，胚芽粥相比于普通大米粥、品牌A燕麥粥、品牌B燕麥粥的DPPH清除能力要高，說明發(fā)芽有助于提高原料的抗氧化能力。

4.2.3?超氧陰離子自由基清除能力的測定?未發(fā)芽糙米和未發(fā)芽綠豆總多酚對超氧陰離子的清除率分別低于發(fā)芽糙米和發(fā)芽綠豆，這表明，發(fā)芽后糙米、綠豆增加的多酚物質(zhì)的抗氧化活性與其含量具有正相關(guān)性，發(fā)芽后抗氧化能力增強(qiáng)。相比于普通大米粥、品牌A燕麥粥、品牌B燕麥粥，胚芽粥的超氧陰離子的清除率要高，說明以發(fā)芽原料制得的粥的抗氧化能力會增強(qiáng)（圖9）。

4.2.4?總多酚含量的測定?由圖10可知，經(jīng)過35℃發(fā)芽處理后，糙米、綠豆的總多酚含量分別提高2.01、1.29mg/100g。說明發(fā)芽處理有利于糙米、綠豆總多酚含量的提高。并且，相比于普通大米粥、品牌A燕麥粥、品牌B燕麥粥，胚芽粥的總多酚含量要高，說明以發(fā)芽原料制得的粥的抗氧化能力會增強(qiáng)。

4.3?胚芽球蛋白的鑒定結(jié)果

圖11結(jié)果表明，電泳的4條泳道分別為不同濃度的球蛋白提取物，1～2為1、0.5mg/mL的樣品濃度，3～4均為0.25mg/mL的樣品濃度。研究表明，球蛋白主要由4條亞基組成，2條輕鏈、2條重鏈。2條輕鏈的分子量約為250kD，2條重鏈的分子量約為500、700kD[12]。球蛋白提取物的分子量主要集中在200、400、550、700kD左右，其中在550kD和700kD處的條帶較為清晰。電泳圖譜中可明顯看出，除了主要條帶外還有其他亞基，說明提取的球蛋白提取物主要為球蛋白，其中可能參雜了少量的清蛋白或者谷蛋白。為了驗證提取的球蛋白是否具有免疫活性，對球蛋白的提取物進(jìn)行進(jìn)一步的體外免疫活性驗證。

4.4?胚芽球蛋白巨噬細(xì)胞增殖實驗

圖12結(jié)果表明，不同濃度的免疫球蛋白均能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW 264.7的增殖，質(zhì)量濃度為1、0.1、0.01mg/mL時，巨噬細(xì)胞RAW 264.7的增殖呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05）。當(dāng)免疫球蛋白的質(zhì)量濃度為1mg/mL時，促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW 264.7增殖的作用最大（P<0.01）;當(dāng)其濃度為0.001、0.000 1mg/mL時，促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW 264.7的增殖作用不顯著（P>0.05）。由此可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著免疫球蛋白的濃度的增大，促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的作用越強(qiáng)。

5?結(jié)論

糙米、綠豆、鷹嘴豆的發(fā)芽使得食材所含有的大量酶被激活和釋放，在酶解作用下釋放出更多營養(yǎng)成分，降低甚至消除抗?fàn)I養(yǎng)因子[13]，并且糙米發(fā)芽能夠軟化糠層纖維，達(dá)到提升口感和風(fēng)味的效果[14]。本文通過實驗證實，發(fā)芽工藝大幅提高了GABA的含量[15]，同時也表明胚芽粥含有多種氨基酸。本文通過抗氧化體系實驗研究發(fā)現(xiàn)，胚芽粥具有很好的抗氧化能力，胚芽球蛋白可能通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的增殖能力來提高機(jī)體的免疫能力。

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Nutrient Ingredients Analysis and in Vitro Activity Evaluation on A Mixed Germ Congee

HAN Xiao-feng1，2，WANG Cheng-xiang3，WEN Jian1，2，MA Fu-jun1，2，MA Shu-hong3，DUAN Sheng-lin1，2

（1 China National Research Institute of Food & Fermentation Industries，Beijing 100015，China;2 Functional Staple Food Creation and Nutrition Intervention for Chronic Diseases in Beijing Key Laboratory，Beijing 100015，China;3 Tong-fu Porridge Limited by Share Ltd，Wuhu 241000，China）

Abstract：Objective To analyze nutrient ingredients and the antioxidant capacity of a kind of mixed congee with germ，and study the proliferative effect of the germ globulin to the macrophage RAW 264.7 in vitro.Method First of all，the amino acid contents in this product was measured，and the γ-aminobutyric acid（GABA）was investigated among all key materials，the congee and other contrastive products.Secondly，the antioxidant activities of this congee and related substrates was determined by Fe3+reducing power，the scavenging ability of DPPH free radical，the eliminating capacity of superoxide anion radical and the contents of total polyphenols.Whats more，the proliferative activity of the germ globulin to the macrophage RAW 264.7 was determined via cells experiment in vitro.Result The germ congee was not only a kind of nutrition-rich food，which was packed with amino acids and GABA，but also had the potential to boost the body immunity.Conclusion This work is worth to continue to study further.

Keywords：mixed congee;germ;nutrient ingredient;antioxidant activity;macrophages proliferation

（責(zé)任編輯?唐建敏）